Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung Arabidopsis Cotyledon Epidermis während der Keimung

Das Ziel des folgenden Experiments ist es, die frühen Ereignisse der epidermalen Entwicklung nach der Samenkeimung auf zellulärer Ebene sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Samenschale entfernt wird, um in einem zweiten Schritt einen klaren Blick auf das Kosin zu ermöglichen. Die Kosine werden unter einer Schicht aus Agar-Medien montiert, die sie immobilisiert und ihre Entwicklung unterstützt. Anschließend wird eine Zeitraffer-Bildgebung über mehrere Tage durchgeführt, um das Wachstum und die Teilung der Epidermiszellen in vivo zu beobachten.

Es wurden Ergebnisse erzielt, die eine dynamische Genexpression und Proteinlokalisierung basierend auf sichtbarer Fluoreszenz zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. Standbildern von Gus-Färbungen oder GFP-Fusionen, besteht darin, dass sie die dynamische Bewegung von Proteinen während der Zellteilung und -differenzierung zeigt. Die Arabidopsis-Samen für dieses Experiment werden in einer Samensterilisationslösung aus 33 % Haushaltsbleiche und 0,1 % Triton X 100 sterilisiert. Samen mit den gewünschten fluoreszierenden Reporterkonstrukten und Genotypen werden in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen gegeben, ein Milliliter Sterilisationslösung aufgetragen und 15 Minuten lang auf einem Mutator inkubiert.

Verwenden Sie in einer sterilen Haube eine Pipette, um die Sterilisationslösung aus dem Röhrchen zu entfernen, wobei die Samen zurückbleiben. Mit einem Milliliter sterilem Wasser abspülen. Wiederholen Sie dies viermal nach dem vierten Spülgang.

Inkubieren Sie zwei oder mehr Tage lang bei vier Grad Celsius. Zur Vorbereitung des Kammer-Objektträgers werden 20 Milliliter 0,5%ige Lösung von Bact und Agar in Wasser in einem 200-Milliliter-Kolben mischen und in der Mikrowelle erhitzen, bis sie sich aufgelöst haben. Sei vorsichtig, wenn du die Lösung kochst.

Rufen Sie die Lösung auf etwa 60 Grad Celsius auf. Eine zu heiße oder zu schnell aufgetragene Lösung kann den Kleber schmelzen oder das Glas des Kammerobjektträgers zerbrechen. Wenn die Agarlösung kühl genug ist, sammeln Sie einen Milliliter mit einer Pipette und tragen Sie ihn sofort langsam auf das Deckglas im Inneren des Kammerobjektträgers auf.

Fügen Sie einen zweiten Milliliter Agarlösung hinzu. Agar Media sollte nun den Boden des Kammerschiebers vollständig bedecken. Dieses minimale Medium reicht aus, um die Entwicklung eines pflanzlichen Oleins zu unterstützen, das gespeicherte Nährstoffe vier bis fünf Tage lang enthält, indem es die Feuchtigkeit aufrechterhält und die Gasdiffusion ermöglicht.

Rufen Sie die Folie mit der abgedeckten Kammer auf der Arbeitsplatte auf. Um diesen Vorgang zu starten, nehmen Sie die Tube mit den sterilen Samen aus der vier Grad Celsius warmen Lagerung. Legen Sie ein Papiertuch auf den Tisch eines Präpariermikroskops, befeuchten Sie es mit Wasser und passen Sie es so an, dass eine glatte Oberfläche entsteht.

Das Gewebe wird verwendet, um die Samen während der Dissektion zu stabilisieren. Pipettieren Sie 20 bis 30 Samen aus dem Röhrchen auf das Gewebe und achten Sie darauf, sie im Sichtfeld des Präparierfernrohrs zu platzieren. Das Präparieren des Co-Leadins ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens.

Die Verwendung einer geringen Vergrößerung und einer scharfen Pinzette und großer Sorgfalt tragen dazu bei, eine erfolgreiche Dissektion mit einer scharfen Pinzette zu gewährleisten. Entfernen Sie vorsichtig die Samenschale von der Innenseite des Sämlings, sowohl die äußeren als auch die inneren Integumente müssen entfernt werden. Verwenden Sie anschließend ein Skalpell, um das Blei in Scheiben zu schneiden, das von der Hyperkottel und dem Radikal befreit ist.

Es ist von Vorteil, das Hyperkotium und das Radikal für die Bildgebung zu entfernen, denn wenn es intakt ist, wird sich das Hyperkot aufrichten und dramatisch verlängern. Bewegen Sie das Koss Leadin aus dem Zeitraffer-Sichtfeld, halten Sie das präparierte Cos Leadin in Wasser getaucht. Wiederholen Sie die Keimdissektion, bis die gewünschte Anzahl von Olean erreicht ist.

Es werden 15 bis 20 erfolgreiche Dissektionen empfohlen, bevor das Öl in den Kammerschlitten eingebaut wird. Um den Kammerschieber für die Montage von Cothan vorzubereiten, verwenden Sie einen kleinen Deckglas, um das Agarmedium zu durchtrennen und heben Sie die gesamte Schicht vom Glasboden der Kammer ab. Schieben Sie die Pipette mit einer minimalen Menge Wasser aus dem Halterohr in die Kammer.

Gleiten Sie unter die angehobene Agarschicht. Senken Sie das Agar vorsichtig auf die Sedins ab. Wenn überschüssiges Wasser vorhanden ist, weichen Sie es mit einem Taschentuch ein.

Achten Sie darauf, die Limousinen nicht zu stören, wenn die Montage abgeschlossen ist. Die Proben sollten sich nicht mehr leicht bewegen lassen. Setzen Sie die Abdeckung auf den Objektträger und übertragen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch.

Richten Sie vor der Bildgebung das inverse Konfokalmikroskop so ein, dass es den gewünschten Fluor abbildet. Die LSM 700-Parameter sind für die GFP-Anregung von 488 Nanometern und die Sammlung. Mit einem Bandpassfilter bei 440 bis 530 Nanometern und für RFP-Anregung bei 555 Nanometern und Sammlung.

Mit einem Bandpassfilter bei 570 bis 610 Nanometern mit einem 20-fachen Objektiv. Konzentrieren Sie sich auf den ACO-Einstieg und verschieben Sie das Ziel in die Mitte der Kammer. Schieben Sie unter Aufnahmemodus und ändern Sie den Zoom auf 0,5 Pixel und die Bildgröße auf 48 x 48 Pixel.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Positionen" und scannen Sie das Übersichtsbild, und erhöhen Sie dann die Anzahl der horizontalen und vertikalen Kacheln auf 30 bis 35. Klicken Sie auf die Schaltfläche Scannen, um den Scanvorgang zu starten. Wenn der Scan abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche "Positionen" unter der Registerkarte "Abmessungen" und platzieren Sie ein Fadenkreuz an jedem zu beobachtenden Kinderbetteinstieg.

Untersuchen Sie die montierten Proben auf Beschädigungen. Die Positionen, die dem beschädigten Coss-Leadin entsprechen, werden gelöscht, um nur geeignete Proben für die Bildgebung übrig zu lassen. Richten Sie als Nächstes eine Z-Serie ein, die die Coss-Leadin-Epidermis aller Proben umfasst.

Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Zack. Wählen Sie jede Position in der Positionsliste aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Verschieben nach. Fokussieren Sie sich auf die oberste Ebene der cos-Leitung in der Epidermis und klicken Sie auf die Schaltfläche "Erste setzen" unter Zack.

Fokussieren Sie sich auf die unterste Position, an der die Epidermis sinnvoll sichtbar ist. Und klicken Sie auf die Schaltfläche Letzte einstellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche neben optimal, um die beste Z-Schichtdicke zum Festlegen anzuzeigen.

Überprüfen Sie jede kos-Einleitung, um sicherzustellen, dass diese Einstellungen alle Stichproben umfassen. Die Z-Parameter können nicht für einzelne Positionen eingestellt werden. In der hier verwendeten Software Zen 2009 sind eingestellte Zeitreihen mit der gewünschten Auflösung und Längenintervalle von 15 bis 30 Minuten für drei Tage für die Proteindynamik bei der epidermalen Zellteilung wirksam, die Intervalle können jedoch bei Bedarf geändert werden.

Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Zeitserie unter Zeitreihe Zyklen für die gewünschte Anzahl von Bildern festlegen, indem Sie in das Textfeld Set interval to 30 eingeben und verwenden Sie das Pulldown-Menü, um MIN auszuwählen, um XY zu starten, ZT Multi-Position-Scan, Ändern Sie die Framegröße auf die gewünschte Auflösung und sammeln Sie das Startexperiment. Beachten Sie, dass die Anzahl der Positionen durch die Scan-Spezifikationen begrenzt sein muss. Wenn die Gesamtscanzeit größer als das gewünschte Intervall ist, sind die Zeitpunkte nicht korrekt.

Mit diesem System sind maximal sechs gleichzeitige Positionen möglich, wenn GFP und RFP bei 59 Z-Schichten im 30-Minuten-Intervall abgebildet werden. Hier sehen Sie ein Beispiel für eine Reihe von informativen Zeitpunkten, die mit dieser Methode erfasst wurden. Zellmembranen werden mit RFP markiert und GFP fusioniert ein polares Protein unter seinem nativen Promotor.

Die Bilder der Serie A zeigen, dass das polare GFP zunächst gleichmäßig verteilt erscheint, dann etwa zwei Stunden bevor asymmetrische Teilungen durch Pfeilspitzen angezeigt werden. Polares GFP trennt sich von der Stelle des beginnenden Meister-OID in der Serie B nach der anfänglichen asymmetrischen Teilung, die durch die Pfeilspitze bei 47 Stunden angezeigt wird. Polares GFP verschwindet in beiden Zellen.

Was einen schnellen Übergang in den Zustand der Schließmutterzelle durch das Merisoid impliziert, teilt sich die durch das Sternchen angezeigte Schließzelle symmetrisch und differenziert sich zu stomatären Schließzellen, während die Cysto-Zelle die polare GFP-Expression wiedererlangt, die vermutlich einer späteren asymmetrischen Teilung vorausgeht. Hier ist ein optimiertes registriertes Video der polaren GFP-Lokalisation während der Amplifikation und des Abstands einer stomatalen Vorläuferzelle zu sehen. Zunächst erscheint polares GFP 39 Stunden nach der Keimung gleichmäßig in der Zelle.

Kurz vor einer Teilung um 40 Uhr polarisiert es stark, wodurch ein kleineres Dienstmädchen am gegenüberliegenden Ende der Zelle steht. Die größere Zelle auf der rechten Seite gewinnt ebenfalls die Identität der stomatären Abstammungslinie zurück und nach 45 Stunden verschiebt sich die polare GFP-Lokalisation neben den stomatalen Vorläufer. Die Teilung nach 47 Stunden erzeugt ein neues Steroid auf der rechten Seite, das von dem bestehenden Me Stamoid weg orientiert ist, auf der linken Seite vom ersten Me Stamoid.

Das Endergebnis ist, dass zwei Stoma durch eine Zelle getrennt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Langzeitzeitraffer eines keimenden Co-Leadins verwenden können, um die Genexpression und Proteinlokalisierung in der Epidermis während der Entwicklung zu beurteilen.