Name: Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung Arabidopsis Cotyledon Epidermis während der Keimung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Lernen Sie die langfristige konfokale Zeitraffer-Bildgebung von Arabidopsis Keimblättern zur Untersuchung der epidermalen Entwicklung und Stomata-Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die dynamische Verfolgung von Proteinen während der Zellteilung.

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Wir danken Amanda Rychel für die Unterstützung bei der Entwicklung der Zeitraffer-Protokoll und Lynn Pillitteri für den Bau von POLAR :: POLAR-eGFP. Wir sind auch dankbar ABRC für die Bereitstellung der pm-rb konstruieren. Dieses Protokoll wurde durch eine Unterstützung aus dem PRESTO Auszeichnung von Japan Science Technology and Agency entwickelt. Forschung POLAR wurde auch von der University of Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) und der National Science Foundation (MCB-0855659) unterstützt. KMP ist ein NSF Graduate Research Fellow (DGE-0.718.124) und KUT ist ein HHMI-GBMF Ermittler.

Ein. Seed Sterilisation <ol><li> Bereiten seed Sterilisationslösung: 33% Bleiche, 0,1% Triton X-100. </li><li> Ort Samen tragenden gewünschten fluoreszierenden Reporter-Konstrukt (en) und Genotyp (en) in 1,7 ml Röhrchen und anwendbar 1 ml Sterilisationslösung. Inkubieren auf Kolbenpendel für 15 min. </li><li> In einer sterilen Haube, verwenden Sie eine Pipette, um eine Sterilisation Lösung von Rohr zu entfernen, so dass Samen hinter sich. Spülen mit 1 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie viermal. </li><li> Inkubieren bei 4 ° C für zwei Tage oder länger. </li></ol> 2. Vorbereitung der Chamber Slide Medien <ol><li> Mix 20 ml 0,5% ige Lösung von Bacto Agar (nicht reine Agarose) in Wasser in einem 200 ml Kolben, und einer Mikrowelle bis gelöst. Seien Sie vorsichtig, wenn Kochen der Lösung. </li><li> Abkühlen der Lösung auf etwa 60 ° C </li><li> Sammeln Sie 1 ml Agar-Lösung mit einer Pipette und langsam auf dem Deckglas in der Kammer Schieber (Lab-Tek II Chambered # 1.5 deutschen Deckglas System) anzuwenden. Lösung which ist zu heiß oder zu schnell kann Leim oder Riss Glasschmelze angewendet. </li><li> Unmittelbar fügen Sie eine zweite ml Agar-Lösung. Agarmedien sollte nun vollständig bedeckt den Boden des Schlittens Kammer. Dies Minimalmedien ausreicht, um die Entwicklung in einer Pflanze Cotyledone, die gespeicherten Nährstoffe für vier bis fünf Tage durch Aufrechterhalten Feuchtigkeit und Ermöglichen Gasdiffusionselektrode enthält unterstützen. </li><li> Cool Slide auf dem Labortisch mit Kammer abgedeckt. Wenn Kolben fest verschlossen wird, kann Lösung gespeichert und erneut erhitzt für zukünftige Verwendung. </li></ol> 3. Seed Dissection <ol><li> Entfernen Rohr steriles Saatgut von 4 ° C Lagerung. </li><li> Legen Sie ein Papiertuch auf der Bühne einem Binokular und befeuchten mit Wasser. Gewebe einzustellen, um eine glatte Oberfläche zu erzeugen. Tissue wird verwendet, um Samen für die Präparation zu stabilisieren. </li><li> Pipet 20-30 Samen aus der Tube auf das Gewebe, wobei darauf geachtet, sie in der Binokular Sichtfeld des platzieren. </li><li> Mit scharfen Pinzette (Roboz, # 5 Biologie Spitze), Entfernen Sie vorsichtig die Samenschale vom Setzling innen. Beide äußeren und inneren Integumenten müssen entfernt werden. </li><li> Beim Abbilden das Keimblatt, ist es vorteilhaft, das Hypokotyl und Würzelchen zu entfernen. Keimblätter enthalten ausreichend Nährstoffe für mehrere Tage unter dieses Protokoll zu entwickeln. Wenn intakten, wird das Hypocotyl begradigen und drastisch verlängern, Bewegen der Cotyledone aus dem Zeitablauf Sichtfeld. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Keimblätter frei von der Hypokotyl schneiden. </li><li> Halten seziert Kotyledonen in Wasser getaucht, in ein Mikroröhrchen oder ähnliches. </li><li> Wiederholen 3,4-3,6 bis die gewünschte Anzahl von Cotyledonen erreicht ist. 15-20 erfolgreiche Dissektionen sind vor der Montage empfohlen. </li></ol> 4. Montage Keimblätter in der Chamber Slide <ol><li> Mit einem kleinen (18 mm 2) Deckglas, schneiden durch die Agar-Medien und heben Sie die gesamte Schicht aus der Kammer slide ist durch den Glasboden. </li><li> Pipette seziert Cotyledonen mit einem Minimum an Wasser aus anhältRohr in der Kammer gleiten, unter das angehobene Agarschicht. </li><li> Senken Sie die Agar auf die Keimblätter. Wenn überschüssiges Wasser vorhanden ist, legen Sie ihn weg mit einem Gewebe, darauf achtend, nicht die Keimblätter stören. Die Proben sollten nicht mehr so ​​leicht zu bewegen, wenn Mount abgeschlossen ist. </li><li> Zeigen Abdeckung auf Kammerobjektträgers und bewegen Folie Mikroskoptisch. </li></ol> 5. Time Lapse Imaging <ol><li> Richten invertierten konfokalen Mikroskop zur Abbildung der gewünschten Fluorophor (s). LSM700 Parameter verwendet: für GFP, Anregung bei 488 nm und Sammlung mit einem Bandpassfilter bei 440-530 nm; für RFP, Anregung bei 555 nm und Sammlung mit einem Bandpassfilter bei 570-610 nm aufweist. </li><li> Kontrollieren eingebettete Proben für Schäden. Programmieren Sie die Standorte der intakten, ordnungsgemäß montiert Keimblätter in Mikroskop-Software. Im Zen 2009: Fokus auf einer cotyledon mit 20x-Objektiv und bewegen Ziel Nutzraummitte Folie. Unter Acquisition Mode, ändern Zoom bis 0,5 und Baugröße &lt;/ Em&gt; 48x48 Pixel. Wählen Positionen Checkbox und Scan Übersicht Bild ... Button unter Positionen, dann erhöhen Horizontal und Vertikal tile Nummern 30-35. Wenn der Scan abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Positionen Knopf unter der Registerkarte Dimensionen und Ort Fadenkreuz an jedem cotyledon zu beobachten. </li><li> Richten Sie z-Serie umfasst die cotyledon Epidermis aller samples.In Zen 2009: Klicken Sie auf die Z-Stack aktivieren. Wählen Sie jede Position unter Position Liste und klicken Sie auf Move to-Taste. Konzentrieren Sie sich auf der obersten Ebene des cotyledon Epidermis und klicken Sie auf die Set Erste Schaltfläche unter Z-Stack. Konzentrieren Sie sich auf die niedrigste Position, an der Epidermis ist sinnvoll sichtbar und klicken Sie auf die zuletzt eingestellte Taste. Klicken Sie auf die Schaltfläche neben Optimale, was zeigt, die besten z-Schichtdicke, zu setzen. Überprüfen Sie jede cotyledon zu bestätigen, dass diese Einstellungen alle Proben umfassen, die z-Parameter kann nicht für indiv. eingestellt werdenidual Positionen in Zen 2009. </li><li> Richten Sie Zeitreihen auf die gewünschte Auflösung und Länge. Abständen von 15-30 min für drei Tage gelten für Dynamik von Proteinen in epidermalen Zellteilung. Dieses Intervall kann je nach Bedarf geändert werden. Im Zen 2009: Klicken Sie auf die Time Series Kontrollkästchen. Unter Time Series, eingestellt Cycles für die Anzahl der Bilder, die gewünschte mit dem Schieberegler oder Eingabe in das Textfeld ein. Set Interval bis 30 und das Pull-Down-Menü min wählen. </li><li> Beginnen xyzt Multi-Positions-Scan. Beachten Sie, dass die Anzahl von Positionen, die die Scan-Daten begrenzt werden muß, wenn Gesamtabtastzeit größer ist als das gewünschte Intervall, die Zeitpunkte nicht korrekt sein. Es können maximal sechs gleichzeitige Positionen sind möglich, wenn Bildgebung GFP und RFP bei 59 z-Scheiben in einem 30-Minuten-Intervall mit unserem System. Im Zen 2009: Change Frame Size die gewünschte Auflösung und klicken Sie auf Start Experiment. </li></ol> 6. Video Editing <ol><li> Von der konfokalen Datendatei, machen eine maximale Intensität z-Projektion jedes Mal / Position Kombination und Export als Bild-Dateien in einem verlustfreien Format wie TIFF. Dateinamen sollten in eine Reihe pro Position (zB POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc., nicht POLAR-GFP_0001_pos1) für die Software, um sie in einem Film zu kombinieren. Im Zen 2009: Verwenden Sie Copy: Subset unter der Registerkarte Verarbeitung Positionen in separate Dateien, dann Maximum Intensity Projection aufgeteilt. Schließlich, als TIFF exportieren (Datei: Export, in höherer Auflösung Bildfenster - Serie). </li><li> Verwenden FIJI 7,8 aufeinanderfolgenden Bildern, indem Sie das bUnwarpJ macro 9 (Plugins: Registrierung: bUnwarpJ) auszurichten. Ändern Registration Mode auf Mono. Alle Erweiterte Optionen können Standardwerte. Für lange Zeitspanne, laden und installieren Sie das Makro &quot;Affine + Konsequente Elastic 2D Image Registration&quot;, das wird bUnwarpJ zu einer Reihe von Bildern automatisch anzuwenden, und öffnen Sie yunsere Daten über Datei: Import: Image Sequence, es zu benutzen. Deaktivieren MOPS Sehenswürdigkeiten Extraktion und Lauf. </li><li> Verwenden FIJI / ImageJ oder Quicktime Pro, um die Reihenfolge der ausgerichteten Bilder öffnen und speichern in das gewünschte Videoformat (AVI ist eine gute Wahl). </li></ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64(1983).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Diese Zeitraffer-konfokalen Technik erlaubt Längsschnittstudien von fluoreszierend markierte Protein Expression und Lokalisierung in einzelnen Zellen der Arabidopsis Cotyledone Epidermis, die im Fall von polaren und andere dynamisch ändernden Proteinen ist entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion. Zuvor hat anhaltende Zeitspanne Bildgebung verwendet worden, um Arabidopsis root Pilzinfektion 11 und Meristem Wachstum 5,12 untersuchen, sondern indem die cotyledon Epidermis erw...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Ein-Kammer-slide </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> Oder Zwei-Kammer (155.379) </td></tr><tr><td> Laser Scanning konfokalen Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Zen 2009 Software </td></tr><tr><td> 20x Objektiv </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0,8, Plan-APOCHROMAT </td></tr><tr><td> Seziermikroskop </td><td> Benz (National) </td><td> 431TBL </td><td> Leuchtet von unten </td></tr><tr><td> Nr. 5 Zangen, Biologie Spitze </td><td> Roboz Surgical Instrument </td><td> RS-4978 </td><td> Sehr feine Spitzensind kritisch </td></tr></tbody></table>

langfristige, high-resolution konfokale zeitraffer bildgebung<em&gt; arabidopsis cotyledon</em&gt; epidermis während der keimung

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo Dynamik zellulärer Verhalten während einer Entwicklungsstörung Sequenz kann eine leistungsstarke Technik für das Verständnis der Mechanik des Gewebes Strukturierung sein. Während tierischen Entwicklung treten Schlüssel Zellproliferation und Strukturierung Ereignisse sehr schnell. Zum Beispiel, in Caenorhabditis elegans alle Zellteilungen für die Larven Bauplan erforderlich sind innerhalb von sechs Stunden nach der Befruchtung abgeschlossen, mit sieben mitotische Zyklen 1, die sechzehn oder mehr Mitosen von Drosophila Embryogenese treten in weniger als 24 Stunden 2. Im Gegensatz dazu sind Zellteilungen der Pflanzenentwicklung langsam, typischerweise in der Größenordnung von einem Tag 3,4,5. Dies stellt eine einzigartige Herausforderung und eine Notwendigkeit für die langfristige Echtzeit-Bildgebung für die Dokumentation dynamische Verhalten der Zellteilung und Differenzierung Ereignisse während Pflanzen Organogenese. Arabidopsis Epidermis ist ein hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung Signalisierung, das Schicksal der Zelle, und die Entwicklung der Pflanzen. In der cotyledon besteht dieses Gewebe von Luft-und Wasser-resistente Pflaster Zellen mit gleichmäßig verteilten Spaltöffnungen, Ventile sich öffnen und schließen, um den Gasaustausch und Wasserverlust zu kontrollieren. Richtigen Abstand dieser Spaltöffnungen ist entscheidend für ihre Funktion und ihre Entwicklung folgt eine Sequenz von asymmetrischen Teilung und Zelldifferenzierung Schritte, um die organisierte Epidermis (Abb. 1) zu produzieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung der Zellen und Proteine ​​in der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung. Dieser Zeitrahmen ermöglicht eine präzise Dokumentation der Stammzell-Divisionen und Differenzierung von epidermalen Zellen, einschließlich Spaltöffnungen und epidermalen Pflaster Zellen. Fluoreszierende Proteine ​​können zu interessierenden Proteine ​​fusioniert werden, um ihre Dynamik während der Zellteilung und Differenzierung Prozesse zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht es uns, die Lokalisierung eines neuen Proteins, POLAR 6 zu verstehen, während der Proliferation Stadium der Stomata-lineage Zellen in the Arabidopsis Cotyledone Epidermis, wo sie in Zellen asymmetrischen Teilung vorhergehenden Ereignisse und bewegt sich zu einem charakteristischen Bereich des Zellcortex kurz vor Teilung erfolgt exprimiert wird. Bilder können registriert und gestrafft werden Video leicht unter Verwendung Public Domain Software, um dynamische Protein-Lokalisierung und Zelltypen zu visualisieren, wie sie im Laufe der Zeit ändern.

<html> Ein Satz von informativen Zeitpunkten mit diesem Verfahren gesammelt wird in 3 gezeigt. Zellmembranen mit RFP (pm-rb) und GFP ist POLAR Protein unter seinem nativen Promotor fusioniert (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Auf der 30-Minuten-Zeitskala markiert sind, sehen wir Zellteilungen zusammen mit den Veränderungen in der Protein-Lokalisierung vor ihnen. Asymmetrische Zellteilungen in der Stomata Abstammungslinie Form Stammzell-Vorstufen wie Stomata genannt meristemoids, die die Fähigkei...

Wir beschreiben ein Protokoll mit Kammer-Objektträgern und Medien zu pflanzen Keimblätter für die konfokale Bildgebung der Epidermis über mehrere Tage der Entwicklung immobilisieren, zu dokumentieren stomatal Differenzierung. Fluorophor-markierte Proteine ​​können dynamisch durch Expression und subzelluläre Lokalisation verfolgt werden, das Verständnis ihrer möglichen Rollen bei der Zellteilung und Zelltyp-Differenzierung.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Die Bildgebung der In-vivo-Dynamik des Zellverhaltens über eine Entwicklungssequenz hinweg kann eine leistungsstarke Technik zum Verständnis der Mechanik von Gewebe sein ...

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die frühen Ereignisse der epidermalen Entwicklung nach der Samenkeimung auf zellulärer Ebene sichtbar zu machen. Dazu wird zunächst die Samenschale entfernt, um im zweiten Schritt einen klaren Blick auf die Kosin zu ermöglichen. Die Kosin werden unter einer Schicht Agar-Medium montiert, die sie fixiert und ihre Entwicklung unterstützt. Anschließend wird eine Zeitrafferaufnahme über mehrere Tage durchgeführt, um das Wachstum und die Teilung der epidermalen Zellen in vivo zu beobachten.Es wurden Ergebnisse erzielt, die dynamische Genexpression und Proteinlokalisation basierend auf sichtbarer Fluoreszenz zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden, wie beispielsweise Standbildern der Gus-Färbung oder GFP-Fusionen, liegt darin, dass sie die dynamische Bewegung von Proteinen während der Zellteilung und Differenzierung sichtbar macht. Die Arabidopsis-Samen für dieses Experiment werden in einer Samensterilisationslösung, bestehend aus 33 % Haushaltsnatriumhypochlorit und 0,1 % Triton X-100, sterilisiert. Dazu werden Samen, die die gewünschten fluoreszierenden Reporterkonstrukte und Genotypen tragen, in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen gegeben und mit einem Milliliter Sterilisationslösung versetzt. Anschließend wird 15 Minuten unter Schütteln inkubiert.Entfernen Sie in einer sterilen Haube mit einer Pipette die Sterilisationslösung aus dem Reagenzglas, wobei die Samen zurückbleiben. Spülen Sie mit einem Milliliter steriler Wasser. Wiederholen Sie den Vorgang viermal, nachdem Sie den vierten Spülschritt durchgeführt haben.Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius für zwei oder mehr Tage. Um das Medium für die Kammerplatte vorzubereiten, mischen Sie 20 Milliliter einer 0,5-%igen Bacto-Agar-Lösung in Wasser in einem 200-Milliliter-Kolben und erhitzen Sie es im Mikrowellenofen, bis es gelöst ist. Seien Sie vorsichtig beim Erhitzen der Lösung.Erhitzen Sie die Lösung auf etwa 60 Grad Celsius. Eine zu heiße Lösung oder eine zu schnelle Applikation kann den Klebstoff schmelzen oder das Glas der Kammerobjektträgerplatte springen lassen. Wenn die Agar-Lösung ausreichend abgekühlt ist, sammeln Sie mit einer Pipette ein Milliliter ein und geben Sie diese langsam unmittelbar auf das Deckglas innerhalb der Kammerobjektträgerplatte.Gebe einen zweiten Milliliter Agar-Lösung hinzu. Das Agar-Medium sollte nun die Unterseite der Kammerplatte vollständig bedecken. Dieses minimale Medium genügt, um die Entwicklung in einer Pflanzenolein zu unterstützen, die gespeicherte Nährstoffe für vier bis fünf Tage enthält und dabei die Feuchtigkeit erhält sowie den Gasaustausch ermöglicht.Rufen Sie den Objektträger mit der bedeckten Kammer auf dem Labortisch ab. Entnehmen Sie zur Durchführung dieses Verfahrens das Röhrchen mit den sterilen Samen der Lagerung bei vier Grad Celsius. Legen Sie ein Papiertuch auf den Tisch eines Stereomikroskops, befeuchten Sie es mit Wasser und glätten Sie es, um eine ebene Oberfläche zu erhalten.Das Gewebe dient dazu, die Samen während der Dissektion zu stabilisieren. Pipettieren Sie 20 bis 30 Samen aus dem Röhrchen auf das Gewebe und achten Sie darauf, sie im Sichtfeld des Stereomikroskops abzulegen. Die Dissektion des Co-Leading ist der anspruchsvollste Aspekt dieses Verfahrens.Die Verwendung einer niedrigen Vergr&ouml;&szlig;erung und scharfer Pinzette sowie gro&szlig;e Sorgfalt tragen zu einer erfolgreichen Dissektion bei. Vorsichtig die Samenschale vom darin befindlichen Keimling entfernen; sowohl das &auml;u&szlig;ere als auch das innere Integument m&uuml;ssen entfernt werden. Anschlie&szlig;end mit einem Skalpell die Keimbl&auml;tter vom Hypokotyl und Radikel abl&ouml;sen.Es ist vorteilhaft, den Hyperkot und das Radikal für die Bildgebung zu entfernen, da der Hyperkot sich andernfalls vollständig ausrichten und stark verlängern würde. Während die Koss-Leadin aus dem Zeitrafferaufnahme-Bereich bewegt wird, muss die präparierte Cos-Leadin in Wasser eingetaucht bleiben. Wiederholen Sie die Samenpräparation, bis die gewünschte Anzahl an Olean erreicht ist.Bevor olean in der Kammerobjektträger präpariert wird, werden 15 bis 20 erfolgreiche Dissektionen empfohlen. Um den Kammerobjektträger für die Präparation von cotan vorzubereiten, schneiden Sie mit einem kleinen Deckglas durch das Agarmedium und heben die gesamte Schicht von der Glasunterlage der Kammer ab. Überführen Sie das mit der Pipette dissektierte cotan mit einer minimalen Menge Wasser aus dem Halteröhrchen in die Kammer. Schieben Sie unter die angehobene Agarschicht. Senken Sie den Agar vorsichtig auf die Sedins ab. Falls überschüssiges Wasser vorhanden ist, tupfen Sie es mit einem Tuch weg.Darauf achten, die Sedimente beim Montieren nicht zu stören, sobald die Montage abgeschlossen ist. Die Proben sollten sich danach nicht mehr leicht bewegen. Deckglas auf die Kammerobjektträger setzen und den Objektträger auf den Mikroskoptisch übertragen.Stellen Sie vor der Bildaufnahme das invertierte konfokale Mikroskop so ein, dass der gewünschte Fluor abgebildet werden kann. Die Parameter des LSM 700 sind für die GFP-Anregung bei 488 Nanometern und die Sammlung mit einem Bandpassfilter von 440 bis 530 Nanometern sowie für die RFP-Anregung bei 555 Nanometern und die Sammlung vorgesehen.Mit einem Bandpassfilter bei 570 bis 610 Nanometern und einem 20-fachen Objektiv. Fokussieren Sie auf die ACO-Einlaufstelle und bewegen Sie das Objektiv in die Mitte der Kammer. Wechseln Sie im Erfassungsmodus zur Ansicht, stellen Sie den Zoom auf 0,5 und die Bildgröße auf 48 mal 48 Pixel ein.Wählen Sie das Kontrollkästchen „Positions“ aus und scannen Sie das Übersichtsbild, anschließend erhöhen Sie die Anzahl der horizontalen und vertikalen Kacheln auf 30 bis 35. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Scan“, um den Scanvorgang zu starten. Sobald der Scan abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche „Positions“ unter dem Reiter „Dimensions“ und platzieren Sie Fadenkreuze an jedem Cot-Einlauf, um diese zu beobachten.Überprüfen Sie die montierten Proben auf Beschädigungen. Löschen Sie Positionen, die beschädigten Coss-Leadin entsprechen, um nur geeignete Proben für die Bildgebung übrigzulassen. Richten Sie anschließend eine Z-Serie ein, die die Coss-Leadin-Epidermis aller Proben umfasst.Klicken Sie das Kontrollkästchen Zack an. Wählen Sie jede Position in der Positionsliste aus und klicken Sie auf die Schaltfläche „Verschieben nach“. Konzentrieren Sie sich auf die oberste Ebene der Cos-Leitung in der Epidermis und klicken Sie im Bereich Zack auf die Schaltfläche „Erste festlegen“.Fokussieren Sie auf die tiefste Position, bei der die Epidermis sinnvoll sichtbar ist. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Letzte festlegen“. Klicken Sie auf die Schaltfläche neben „Optimal“, die die beste Z-Schnitt-Dicke anzeigt, die eingestellt werden sollte.Überprüfen Sie jeden kos-Einleitungsabschnitt, um sicherzustellen, dass diese Einstellungen alle Proben abdecken. Die Z-Parameter können nicht für einzelne Positionen festgelegt werden. In der hier verwendeten Zen 2009-Software hat sich die Einrichtung von Zeitreihen mit der gewünschten Auflösung und Längenintervallen von 15 bis 30 Minuten über einen Zeitraum von drei Tagen für die Untersuchung der Proteindynamik bei der epidermalen Zellteilung bewährt, wobei die Intervalle bei Bedarf angepasst werden können.Klicken Sie das Kontrollkästchen Zeitreihe unter Zeitreihensatz-Zyklen an, geben Sie die gewünschte Anzahl von Bildern ein, indem Sie im Textfeld Intervall auf 30 setzen und im Dropdown-Menü MIN auswählen, um die XY-, ZT-Mehrfachpositionen-Aufnahme zu starten. Ändern Sie die Bildgröße auf die gewünschte Auflösung und starten Sie das Experiment. Beachten Sie, dass die Anzahl der Positionen durch die Scan-Spezifikationen begrenzt sein muss. Falls die gesamte Scan-Zeit länger ist als das gewünschte Intervall, werden die Zeitpunkte nicht korrekt sein.Mithilfe dieses Systems sind maximal sechs gleichzeitige Positionen möglich, wenn GFP und RFP bei 59 Z-Schnitten in einem Zeitintervall von 30 Minuten abgebildet werden. Ein Beispiel für eine Reihe aussagekräftiger Zeitpunkte, die mit dieser Methode aufgezeichnet wurden, ist hier gezeigt. Zellmembranen sind mit RFP und GFP markiert, die an ein polares Protein unter dessen natives Promotor fusioniert sind.Die Bilder in Serie A zeigen, dass polarisiertes GFP anfangs gleichmäßig verteilt erscheint und dann etwa zwei Stunden vor den asymmetrischen Teilungen, die durch Pfeilspitzen markiert sind. Polarisiertes GFP segregiert in Serie B von der Stelle der entstehenden meisterartigen OID weg, nach der initialen asymmetrischen Teilung, die durch die Pfeilspitze bei 47 Stunden angezeigt wird. Polarisiertes GFP verschwindet in beiden Zellen.Da der Merisoid einen schnellen Übergang in den Zustand der Spaltöffnungsmutterzelle andeutet, teilt sich die durch das Sternchen markierte Spaltöffnungsmutterzelle symmetrisch und differenziert zu Spaltöffnungsverschlusszellen, während die Cystozelle die polare GFP-Expression zurückgewinnt, was vermutlich einer späteren asymmetrischen Teilung vorausgeht. Gezeigt ist hier ein vereinfachtes, registriertes Video zur lokalen GFP-Expression während der Verstärkung und räumlichen Anordnung einer stomatalen Vorläuferzelle. Anfänglich erscheint die polare GFP-Expression uniform in der Zelle 39 Stunden nach der Keimung.Sie polarisiert stark kurz vor einer Teilung bei 40 Stunden und platziert eine kleinere Maid am gegenüberliegenden Ende der Zelle. Die größere Zelle rechts gewinnt zudem die Identität der Spaltöffnungs-Linie zurück, und bis 45 Stunden bewegt sich die Polar-GFP-Lokalisation neben den Spaltöffnungs-Vorläufer. Die Teilung bei 47 Stunden erzeugt einen neuen Steroid rechts, der sich von dem vorhandenen Me-Stamoid links weg orientiert, ausgehend vom ersten Me-Stamoid.Das Endergebnis ist, dass zwei Stomata durch eine Zelle voneinander getrennt sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Langzeit-Zeitrafferaufnahmen einer keimenden Kotyledone verwendet, um die Genexpression und die Proteinlokalisation in der Epidermis während der Entwicklung zu untersuchen.

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Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie fluoreszenzmarkierte Proteindynamik zu Pflanzenzelloberflächen mit variablem Winkel Epifluoreszenzmikroskopie, die blinkende Punkte von GFP-markiertem PATROL1 ein Membrantransportprotein zu überwachen, in der Zelle Kortex der Stomata Komplex in Arabidopsis thaliana.

Echtzeit-Imaging von Plant Cell Oberflächen Dynamics mit variabler Winkel Epifluoreszenzmikroskopie

Live-konfokale Abbildung stellt Biologen ein leistungsfähiges Werkzeug zum Studium der Entwicklung. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Live - konfokale Abbildung von Arabidopsis Blumen zu entwickeln.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

Hier präsentiert sich eine einfache Technik für hochauflösende konfokale Zeitraffer-Bildgebung der Wurzel- und Hypokotyl-Entwicklung für bis zu 3 Tage mit hohen Ziffernblende und Perfluordecalin als Immersionsmedium.

Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Wir berichten über eine einfache und vielseitige Methode zur Durchführung von fluoreszierenden live-Imaging von Arabidopsis Thaliana Blätter über einen längeren Zeitraum hinweg. Wir verwenden eine transgene Arabidopsis -Pflanze mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Reporter-gen unter der Kontrolle von einer Immunität im Zusammenhang mit Promoter als Vorbild für die räumlich-zeitliche Verständnis der Pflanze Immunantworten.

Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen

Wir bieten eine Methode zur Identifizierung von Modulatoren der Blatttranspiration durch großangelegtes Screening einer zusammengesetzten Bibliothek.

Identifizierung neuartiger Regulatoren der Pflanzentranspiration durch großangelegtes Thermisches Bildgebungsscreening in Helianthus Annuus

In dieser Arbeit werden zwei Phänotypisierungsmethoden ohne die Verwendung von epidermalen Peelings beschrieben, um die Gene zu charakterisieren, die die Entwicklung der Stomata steuern. Die erste Methode zeigt, wie ein stomataler Phänotyp unter Verwendung einer Toluidinblau-O-gefärbten Pflanzenepidermis analysiert werden kann. Die zweite Methode beschreibt, wie man stomatale Liganden identifiziert und ihre biologischen Aktivitäten überwacht.

Identifizierung der Gene, die an der Entwicklung der Stomata beteiligt sind, mittels epidermalem Phänotyp-Scoring

Hier beschreiben wir ein fortschrittliches Werkzeug zur Überwachung der Chlorophyllbiosynthese in den frühen Stadien der Arabidopsis-Keimlingsentetiolierung.   Die neuartige Methodik ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von intakten Proben der Endosperm-Zellschicht in Arabidopsis thaliana-Samen . Die Methode erfordert nur gängige Laborgeräte wie eine Injektionsnadel und eine Präzisionszange und ermöglicht eine hochauflösende fluoreszierende Bildgebung von Endospermzellen sowohl in sich entwickelnden als auch in reifen Samen.

Aufbereitung von intaktem Gewebe für die mikroskopische Analyse der Endosperm-Zellschicht in sich entwickelnden und reifen Arabidopsis-Samen

Lernen Sie die langfristige konfokale Zeitraffer-Bildgebung von Arabidopsis Keimblättern zur Untersuchung der epidermalen Entwicklung und Stomata-Differenzierung. Diese Methode ermöglicht die dynamische Verfolgung von Proteinen während der Zellteilung.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung

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