Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Dieses Protokoll etabliert eine neuartige neuronale Axon- und Astroglia-Co-Kultur-Plattform, um Neuron-GGL-Interaktionen mit hochauflösender Bildgebung zu analysieren. Zuerst bauen Sie die mikrofluidische Kulturkammer zusammen, bereiten Sie neuronale Kulturen vor und induzieren Sie die neuronalen Axone, in die andere Seite des MCP einzudringen. Fügen Sie als Nächstes kultivierte Astrozyten hinzu, um ein kompartimentiertes Co-Kultursystem zu ermitteln. Die Ergebnisse, einschließlich der Zeitrafferbildgebung mit konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie, können helfen, die Wechselwirkungen zwischen Axonen, Astroglia und neuronalen Axonen zu verstehen.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir versuchten, die Wirkung des neuronalen Prozesses von der neuronalen Sekretion auf die GT-1-Regulation zu trennen. Typischerweise haben Personen, die neu in der Methode sind, Schwierigkeiten, Axone in einen anderen Teil des Zellkompartiments zu induzieren. Es erfordert eine hohe Dichte an gesunden Neuronen, die auf der neuronalen Seite plattiert sind, wobei das Neuron in der Nähe der zentralen Kanäle plattiert ist.

Die offenen MCP-Kammern sind für kompartimentierte Kulturen verschiedener Zelltypen ausgelegt, Polyurethan- und Lamininbeschichtungen sind für die Beschichtung von Neuronen und Astrozyten in der Co-Kultur erforderlich. Zuerst ein Milligramm pro Milliliter Polyurethanlösung auf die sterilen Glasbodenschalen geben und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie das beschichtete Glasbodengeschirr dreimal mit doppelt destilliertem Wasser und legen Sie es dann zum Trocknen unter einen sterilen Abzug.

Als nächstes bestreichen Sie die Schale mit einem Milligramm pro Milliliter, laminin und trocknen sie eine Stunde lang unter UV-Licht. Die Montage von MCP auf der Glasbodenschale sollte vor der Verwendung frisch zubereitet werden. Positionieren Sie die mikrofluidische Kulturplattform mit den zentralen Verbindungskanälen auf ihrer Unterseite und schließen Sie sie dicht mit dem beschichteten Glas ab.

Untere Gerichte. Fügen Sie reguläre Neuronen- oder Astrozyten-Kulturmedien auf beiden Seiten des zusammengesetzten MCP hinzu. Inkubieren Sie die Kammer zwei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und stellen Sie sicher, dass zwischen dem MCP und dem Glas keine Leckage vorhanden ist.

Untere Schale. Cortico neuronale Zellkulturen werden frisch aus embryonalen 14 bis 16 Tage alten Mäusegehirnen hergestellt. Nach der Dissektion des Mäusegehirns entfernen Sie unter dem Präpariermikroskop die Hirnhäute aus der Hirnrinde.

Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer Rasierklinge in kleine Gewebeblöcke und legen Sie die zerkleinerten Gewebeblöcke nach dem Zentrifugieren in ein Röhrchen. Entsorgen Sie das Medium über dem Pellet und fügen Sie 0,05 % hinzu. Versuchen Sie es 10 Minuten lang und nehmen Sie ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Dissoziieren Sie die Zellen durch sanftes Tittieren mit einer feuerpolierten Nudelpipette.

Führen Sie die Probe durch ein 70-Mikron-Sieb, um eine klare neuronale Zellsuspension mit Neuronenbeschichtung zu sammeln. Medium ergänzt mit 5%FBS-Samen. 150 Mikroliter Neuronen auf der rechten Seite der zusammengesetzten MCP-Platte.

Eine hohe Dichte an Neuronen, da nur die Neuronen, die sich im Zellretentionsbereich anheften, in der Lage sind, Axone durch die zentralen Kanäle in die andere Seite des assemblierten MCP zu züchten. Am nächsten Tag. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig aus dem Zellplattierungsbereich der Kammer und ersetzen Sie das Neuronenplattierungsmedium durch eine normale Neuronenkultur.

Medium, fügen Sie 20 Nanogramm pro Milliliter, glialer abgeleiteter neurotropher Faktor oder GDNF auf die Astrozytenseite der Kammer hinzu. Dadurch entsteht ein chemischer Gradient, der dazu beiträgt, das Axonwachstum von der neuronalen Seite über die zentralen Kanäle des assemblierten MCP zu induzieren. Zwei Tage später auf Axone überwachen, die in den zentralen Kanal gelangen.

Sobald die Axone in den zentralen Kanal eintreten, treten sie in der Regel innerhalb eines Tages auf der anderen Seite ein. Axone sind in der Regel mindestens eine Woche lang intakt, nachdem sie in die andere Seite eingetreten sind. Nachdem ich das Gehirn von P 1 bis drei Mäusen dissoziiert habe, samende Astrozyten in Polyurethan-beschichtete 10-Zentimeter-Schalen.

Kultur, die Zellen füllen das Astrozytenkulturmedium über Nacht täglich für die nächsten zwei Tage auf, und dann einmal alle drei Tage nach sieben Tagen, wenn die Astrozyten eine 90%ige konfluente Monoschicht gebildet haben, Ernte Zellen mit Trypsin Etwa fünf Tage, nachdem die Neuronen plattiert wurden, aspirieren Sie das GDNF. Säen Sie dann 150 Mikroliter der resuspendierten Astrozyten in die linke Seite des zusammengesetzten MCP aus. Wenn Axone kurz vor dem Eintritt stehen oder gerade eingetreten sind, interagieren Axone, die in die linke Seite des assemblierten MCP eingetreten sind, direkt mit den Astrozyten, entweder durch direkten axonalen Kontakt oder durch Freisetzung löslicher Faktoren.

Überwachen Sie die Astrozyten auf ihre Anheftung an den Zellretentionsbereich. Färben Sie die Zellen im kompartimentierten Co-Kultursystem, um spezifische Proteine sichtbar zu machen, wie sie an der Interaktion zwischen den Axonen und den Astrozyten beteiligt sind. Das kompartimentierte Neuronen- und Astrozyten-Co-Kultursystem ermöglicht es nur den neuronalen Prozessen, insbesondere den Axonen, selektiv mit Astrozyten zu interagieren.

Hier beschreiben wir die axoninduzierte transkriptionelle Aktivierung des Astroglia-Glutamat-Transporters. In diesen Studien wurden transgene Mäuse verwendet, die unter der Kontrolle des genomischen Promotors GT one eine Expression eines EGF-Fluoreszenzreporters aufweisen. Eine hohe Dichte von Neuronen wird im Zellretentionsbereich des assemblierten MCPA kultiviert; die vergrößerte Ansicht zeigt, wie die Axone die zentralen Kanäle kreuzen und auf der anderen Seite in die andere Seite eintreten, wobei die Beta-3-Tubulin-Färbung den Axonwachstumskegel zeigt.

Das MCP-System ermöglicht die Überwachung der Axonbündel, während sie durch den zentralen Kanal wachsen und auf der anderen Seite eintreten. Immunos-Färbung für GT one identifiziert Astrozyten in der glialen Seite des MCP-Systems entstanden. Das Bild zeigt hier den Kontakt zwischen Axonen und GLT, einem positiven Astrozyten.

Die Expression des EGFP-Reporters korreliert mit der endogenen Aktivierung des GT-One-Promotors, der Proteinexpression und der funktionellen Aktivität. Die Beurteilung der GT-Eins-Promotoraktivität in einzelnen Astrozyten in C zwei zeigt eine signifikant erhöhte GLT-Eins-Immunreaktivität in kompartimentierten Co-Kultursystemen. Wichtig ist, dass das MCP-System Zeitrafferbilder ermöglicht, um dynamische Veränderungen zu überwachen.

Zum Beispiel zeigen diese Daten eine Axon-induzierte GT-1-Promotoraktivierung mit zurück GT 1 EGFP-Astrozyten und Wildtyp-Neuronen einen Tag nach der Plattierung der Astrozyten. Es wird eine sehr geringe EGFP-Fluoreszenz beobachtet. Die EGFP-Intensität steigt 48 Stunden nach der Co-Kultur signifikant an, wenn sich die Axone weit in der Astrozytenseite befinden und hier in direktem Kontakt mit den Astrozyten interagieren.

Die Kinin-Behandlung auf der neuronalen Seite des assemblierten MCP induzierte den neuronalen Zelltod. Interessanterweise stimulierte es auch die Axonretraktion und -degeneration sowie die Abnahme der axonalen EGFP-Fluoreszenz. Diese dynamischen Änderungen der EGFP-Fluoreszenzintensität als Reaktion auf die Axone zeigten deutlich, dass die Promotoraktivität von Astroglia GT durch die Axoninteraktion moduliert wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Kernkultursystem mit der mikrofluidischen Kulturplattform einrichten Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in wenigen Tagen ordnungsgemäß durchgeführt werden.