Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den DNA-Schadens-Checkpoint mithilfe von Xip-Ei-Extrakten als Modellsystem zu untersuchen. Bereiten Sie zunächst einen Low-Speed-Extrakt aus Xip-Eiern vor. Danach bereiten Sie beschädigtes Spermachromatin mit DNA-schädigenden Methoden wie MMS und UV-Licht vor.

Bereiten Sie außerdem die die DNA-Schädigung imitierende Struktur vor. Ein T 70 dient dazu, die DNA-Schadenskontrolle in LSE mit dem beschädigten Spermachromatin oder dem a T 70 auszulösen. Letztendlich können Ergebnisse von Blots Einblicke in die von a TR vermittelte DNA-Schadenskontrolle im Xenopus-Ei-Extrakt liefern.

Hallo zusammen. Hier ist CH Y aus dem Fachbereich Biologie an der UNC Charlotte. Heute zeigen wir Ihnen, wie Pus-Extrakt als Modellsystem verwendet wird, um die Schadensreaktion der Tech-Punkt-Signalübertragung zu untersuchen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der dynamischen Instabilität zu beantworten, beispielsweise wie die D-Schadenskontrolle aktiviert wird. Dieses Protokoll dient der Herstellung von Opus-Ei-Extrakt sowie von Reagenzien zur Induktion der DNA-Schadenskontrolle und der Analyse der DNA-Schadenskontrolle und von Xap. Diese Techniken lassen sich auf eine Vielzahl von DNA-schädigenden Ansätzen anwenden, einschließlich vierfachem NQO und Etoposid.

Um den DNA-Schadens-Checkpoint zu untersuchen, beginnen wir. Um die weiblichen Xenopus-Frösche vorzuprimen, injizieren Sie 100 Einheiten PMSG subkutan in die dorsalen Lymphsäcke. Mindestens zwei Tage nach der Priming-Behandlung induzieren Sie die Eiablage, indem Sie jeden vorbehandelten Frosch subkutan in den dorsalen Lymphsack mit 500 Einheiten humanem Choriongonadotropin injizieren. Inkubieren Sie die injizierten Frösche 14 bis 20 Stunden in separaten Eimern, die jeweils zwei Liter Marx-modifizierte Ringer-Lösung enthalten.

Entfernen Sie die Frösche aus den Eimern und gießen Sie die MMR-Lösung ab, bis etwa 100 Milliliter zurückbleiben. Überführen Sie dann die Eier aus den Eimern in einen 250-Milliliter-Becher und entfernen Sie das Eigel durch Zugabe von jeweils etwa 100 Milliliter 2%iger Cysteinlösung mit pH 7,8 alle 30 Sekunden. Schwenken Sie die Eier vorsichtig mit einer umgestülpten Glas-Pasteurpipette mit einem Durchmesser von 0,7 Zentimetern, dekantieren Sie die Lösung und ersetzen Sie sie zweimal durch frische Cysteinlösung.

Der Entfernungsvorgang der Dotterhülle dauert ungefähr fünf bis 15 Minuten. Sobald sich die Eier zu einer dichteren Schicht am Boden des Bechers zusammenlagern, entsorgen Sie die Cysteinlösung und waschen die Eier dreimal mit 0,25 XMMR-Lösung. Schwenken Sie die Eier mit einer Glaspipette und untersuchen Sie sie auf aufgequollene, weiße, defekte Eier, die sich tendenziell in der Mitte des Bechers ansammeln.

Entfernen Sie die schlechten Eier mit einer Pasteurpipette. Waschen Sie die Eier anschließend dreimal mit Puffer zur Ei-Lyse. Entfernen Sie eventuell weitere schlechte Eier, dann gießen Sie die Eier in ein 14-Milliliter-Falcon-Röhrchen.

Die Eier durch Zentrifugation 55 Sekunden bei 188 × g verdichten. Unter Verwendung einer klinischen Tischzentrifuge mit Schwenkkorbrotor wird die überschüssige Pufferlösung über der Eierschicht entfernt. Geben Sie nun pro Milliliter verdichteter Eier 0,5 µL einer 10 mg/mL-Lösung von Aprotinin, Leptin oder AL sowie 0,5 µL einer 5 mg/mL-Lösung von Zytokin B oder Cyto B hinzu, und zentrifugieren Sie die Eier 15 Minuten bei 16.500 × g und 4 °C. Unter Verwendung der Sarva-RC-6-Plus-Superspeed-Zentrifuge mit HB-6-Schwenkkorbrotor werden die Eier nach der Zentrifugation in drei Schichten im Reagenzglas fraktioniert: Lipidextrakt und Eigelb-Pigment von oben nach unten. Stechen Sie mit einer 21-Gauge-Nadel in den Seitenwandbereich des Falcon-Röhrchens im unteren Teil der mittleren Extraktsschicht.

Entfernen Sie die Nadel vorsichtig, da die Punktionsnadel durch Kunststoff verstopft sein könnte. Führen Sie eine neue 21-Gauge-Nadel, die an eine Ein-Milliliter-Spritze angeschlossen ist, in die Punktionsstelle ein. Um das Extrakt zu sammeln.

Aspirieren Sie den Extrakt langsam, wobei Luftblasen und Kontamination mit den Lipid- und Eigelbfarbstoffschichten vermieden werden müssen. Überführen Sie die Extrakte in ein gekühltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie pro Milliliter Eiextrakt 10 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter-Lösung hinzu.

Cycloheximid: ein Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter Lösung. A pronin Leptin: ein Mikroliter einer 5 Milligramm pro Milliliter Lösung, Zytokin B: ein Mikroliter einer einmolarigen DTT-Lösung und 0,33 Mikroliter einer 10 Milligramm pro Milliliter Lösung. Vorsichtig durch mindestens zehnmaliges Invertieren des Ei-Extrakts vermischen. Das Extrakt mit niedriger Geschwindigkeit muss innerhalb von vier Stunden verwendet werden, da sonst die Qualität des LSE beeinträchtigt wird.

Nach vier Stunden oder einem freien Auftauen lösen Sie die beiden synthetischen Oligonukleotide in Wasser mit einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Mikroliter auf. Geben Sie jeweils 100 Mikroliter jedes Oligos in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie fünf Minuten lang in einem 95-Grad-Celsius-Wärmeblock. Entfernen Sie den Trockenblock mit dem Röhrchen, das die Oligo-Mischung enthält, und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen. Portionieren Sie 10-Mikroliter-Aliquote zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius.

Die AL-Probe liegt nun als A T 70-Duplex mit einer Endkonzentration von zwei Mikrogramm pro Mikroliter vor. Bereiten Sie normale Spermatochromatin gemäß Tudor und Walter auf 0,5 Milliliter Chromatin vor. Geben Sie 5,5 Mikroliter einer 9,1-molaren MMS-Lösung hinzu.

Stellen Sie das Probenröhrchen für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Rotator unter Verwendung der klinischen Zentrifuge IE CCL zwei mit Schwenkkorbrotor und Röhrchenadaptern. Zentrifugieren Sie die Probe bei 686 ×g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet in 0,5 Millilitern Puffer X, der B-S-A-D-T-T-A Proin und Leptin enthält.

Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal und resuspendieren Sie das Pellet in 0,5 Milliliter Puffer x. Bestimmen Sie die Konzentration der Spermatozoenchromatin mit einem Hämozytometer.

Anschließend verdünnen Sie die Probe auf 100.000 Spermien pro Mikroliter und lagern Sie Aliquots von fünf Mikrolitern bei minus 80 Grad Celsius ein. Geben Sie die gewünschte Menge an normalem Spermatozoenchromatin auf die Oberfläche eines Stückes Parafilm und geben Sie die Probe in einen UV-Vernetzer. Stellen Sie den gewünschten Energieparameter ein und beginnen Sie, das Spermatozoenchromatin mittels UV-Licht zu schädigen.

Verwenden Sie das mit UV behandeltete Spermachromatin unverzüglich, um die DNA-Schadenskontrolle in dem vorbereiteten Low-Speed-Extrakt auszulösen. Geben Sie 50 Mikroliter LSE, ein Mikroliter Energiergemisch und zwei Mikroliter geschädigtes Spermachromatin zusammen. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur 90 Minuten lang und sorgen Sie dafür, dass Sie das Röhrchen alle 10 Minuten nach mindestens 30 Minuten leicht anstupsen.

Inkubation: Geben Sie einen Mikroliter der Reaktionsmischung auf einen Objektträger und fügen Sie einen Mikroliter der Kernzerkleinerungslösung hinzu. Legen Sie einen Deckgläser auf und überprüfen Sie die Kernbildung mittels Fluoreszenzmikroskop. Typischerweise bilden sich nach 30 Minuten der Inkubation runde Kerne, was darauf hinweist, dass die DNA-Replikation eingeleitet wurde.

Außerdem 10 Mikroliter der Reaktionsmischung mittels Immunblotting unter Verwendung von Anti-Check-eins-Antikörpern analysieren. 50 Mikroliter LSE, 1 Mikroliter Energimischung und 1,6 Mikroliter Toto-Mycin-Grundlösung in einem Mikrozentrifugenröhrchen vereinigen. Anschließend 1,25 Mikroliter entweder von einer zwei Mikrogramm pro Mikroliter betragenden T70-DNA-Duplex oder Wasser als Negativkontrolle hinzufügen.

Die Reaktionen 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und alle 10 Minuten die Reaktionsgefäße leicht schütteln. Nun 10 Mikroliter der Reaktionsmischung zu 90 Mikrolitern Probufffer hinzufügen, um mittels Western-Blot-Analyse ein Protein zu überprüfen. Die beschädigte spermatische Chromatinstruktur bzw. die Struktur, die einer DNA-Schädigung ähnelt, aktiviert im Vergleich zur Kontrolle, die durch MMS induziert wird, effektiv einen TR-check-one-vermittelten DNA-Schadens-Checkpoint im Xenopus-Ei-Extrakt-System.

Überprüfen Sie eine Phosphorylierung an Serin 344, die ein Indikator für die Aktivierung eines TR-Kinasen ist. Ebenso löst ein T 70 als eine DNA-Schädigung nachahmende Struktur die Phosphorylierung von Check one aus. Nach Beherrschung der LSE-Präparation kann diese in etwa einer Stunde abgeschlossen werden.

Da die Qualität des Extrakts nach etwa vier Stunden abnimmt, sind Schnelligkeit und Effizienz entscheidend. Diese Methoden können mit anderen Ansätzen kombiniert werden, um zentrale Fragen zur DNA-Schadens-Checkpoint-Signalübertragung zu beantworten. Beispielsweise kann eine Immun-Depletion durchgeführt werden, um zu prüfen, ob ein Zielprotein für den DNA-Schadens-Checkpoint erforderlich ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den D-Schadens-Checkpoint unter Verwendung von Pus-Extrakt als Modellsystem untersucht. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.