Hippocampus Insulin Mikroinjektion und

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Stoffwechsel des Hippocampus während eines Verhaltensversuchs zu messen. Dies wird erreicht, indem ein gut abgerichtetes Tier chirurgisch mit einer Mikrodialysingleitkanüle präpariert wird. Am Tag der Untersuchung wird eine Mikrodialysisonde in die Kanüle eingeführt und der PERFUSE-eight-Fluss bestätigt.

Anschließend wird der Sondensonde das Equilibrieren ermöglicht, während sich das Tier in einer Kontrollkammer befindet. Letztendlich kommen geeignete analytische Methoden zum Einsatz, beispielsweise eine Glucose-Oxidase-, NADP-, N-A-D-P-H-Reaktion und eine fluometrische Analyse. Wenn die Glucosemessung verwendet wird, um den Stoffwechsel- und/oder neurochemischen Freisetzungsgrad während der Testphase zu zeigen, ist einer der schwierigsten Aspekte dieser Technik die sorgfältige Handhabung der Mikrodialyseschläuche, da die Tiere diese oft durchbeißen oder die Leitungen verwickeln, falls nicht sorgfältig vorgegangen wird.

Das erste Mal, als ich während eines Verhaltensversuchs eine hippocampale Mikrodialyse anwandte, war während meiner Doktorandenzeit. Wir wollten überprüfen, ob die bestehenden Modelle zur Glukoseversorgung tatsächlich mit den bekannten psychologischen Daten zur Gedächtnisverbesserung durch Glukose vereinbar waren. Mithilfe dieser Methodik konnten wir zeigen, dass die bisherigen Modelle zur Glukoseversorgung des Gehirns vollkommen falsch waren.

Nach standardisierten chirurgischen Verfahren bereiten Sie das Tier vor, legen den Schädel frei und bohren Löcher für die Kanülenplatzierung. Setzen Sie eine Kanüle an vorbestimmten Koordinaten ein und senken Sie sie langsam auf die Zieltiefe ab. Befestigen Sie die Kanüle nach korrekter Positionierung mit Zahnzement.

Bei Bedarf die Wunde mit einer sterilen chirurgischen Naht verschließen. Abschließend einen Style verwenden, um die Kanülenpatenz aufrechtzuerhalten. Danach das PERFUSE Acht für die Mikrodialyse vorbereiten.

Es sollte beachtet werden, dass eine genaue Fluidzusammensetzung für optimale Ergebnisse unerlässlich ist. Am Tag der Durchführung sollte Rinderserumalbumin BSA hinzugefügt und vollständig gelöst werden. Nach der Herstellung sollte das PERFUSE eight durch einen 0,2-Mikron-Filter filtriert werden.

Bereiten Sie anschließend die Behandlung vor, die gegebenenfalls dem Gehirn verabreicht wird, indem Sie ein Aliquot des hergestellten A-ZSF verwenden. Hier wird Insulin für die Applikation in den Hippocampus vorbereitet. Am Tag vor der Untersuchung sollte eine neue Mikrodialysesonde sowie Leitung vorbereitet werden.

Erstellen Sie zwei separate Leitungen für Zufluss und Abfluss. Verwenden Sie PE-50-Schläuche, um zwei ein Meter lange Stücke FEP-Schlauch miteinander zu verbinden, und stellen Sie sicher, dass der Totraum zwischen den Leitungen minimal ist. Die Schläuche sollten wie gezeigt zugeschnitten werden, um schräge Enden zu erhalten, die eine einfache Einführung in die PE-50-Verbinder ermöglichen.

Schließen Sie das Zulaufrohr an eine Ein-Milliliter-Hamilton-Spritze an, die mit sterilfiltriertem entionisiertem Wasser gefüllt ist, und befestigen Sie die Sonde am anderen Ende, sodass das Tier sich während der Messungen frei bewegen kann. Schließen Sie die Zu- und Ablaufleitungen an einen Zweikanal-Schwenkkopf an. Verbinden Sie anschließend das Ablaufrohr mit der Pumpe und betreiben Sie diese mit 1,5 Mikrolitern pro Minute, bis entionisiertes Wasser aus dem Ablaufrohr der Sonde austritt.

Schalten Sie die Pumpe aus und verbinden Sie die andere Leitung zwischen dem Ausflussrohr und einem Probensammelrohr. Leiten Sie fünf Milliliter durch das Rohr und platzieren Sie die Sonde über Nacht in ein Gefäß mit steriler, deionisierter Wasser, wobei sichergestellt werden muss, dass die Sondenspitze stets benetzt bleibt. 24 Stunden vor der Untersuchung führen Sie eine Vor-Roe-Behandlung des Versuchsobjekts durch, indem Sie den Platzhalterstilus entfernen und eine Mikrodialysesondu einführen, die ausschließlich für diesen Zweck verwendet wird.

Ersetzen Sie danach 10 Minuten lang den Dummy-Stilus und setzen Sie die Ratte zurück in ihren Käfig. Alternativ verwenden Sie in diesem Schritt eine neue Sonde und lassen Sie, ohne sie zu entfernen, bis zur Messung an Ort und Stelle. Am folgenden Tag.

Am Tag der Mikrodialyse füllen Sie die Hamilton-Spritze und das Szintillationsfläschchen mit filtriertem A ECF und lassen Sie die Pumpe eine Stunde lang equilibrieren. Bei Bedarf füllen Sie eine zweite Hamilton-Spritze mit der vorbereiteten Behandlungslösung und setzen sie in die Spritzenpumpe ein. Der Schlüssel zum Erfolg dieses Verfahrens liegt darin, ruhig zu bleiben und das Tier besonders sorgfältig zu handhaben.

Seien Sie also ruhig, bewegen Sie sich langsam und präzise und üben Sie vor allem ausgiebig. Wenn die Equilibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Platzhalterstab und führen Sie die equilibrierte Mikrodialysesonde vorsichtig über die Kanüle in das Gehirn der Ratte ein. Stellen Sie die Ratte in eine durchsichtige Plastikbox, die etwas vom Einstreu aus ihrem Heimkäfig enthält.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Tubing ausgleichen. Befestigen Sie ein 1,6-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit Wasser gefüllt ist, an der Tubing außerhalb des Käfigs, sodass die Schwerkraft die Mikrodialyselines entwirrt, aber nicht straff hält. Lassen Sie die Sonde und die Ratte zwei Stunden lang equilibrieren.

Zu Beginn dieses Zeitraums überprüfen Sie, ob der Durchfluss von Perfuse acht ungehindert ist. Sammeln Sie dazu den Ausfluss von PERFUSE acht über einen definierten Zeitraum und wiegen Sie die Probe, um sicherzustellen, dass das erwartete Volumen das System verlässt, bevor Sie Proben entnehmen. Stellen Sie sicher, dass die Korrelation zwischen Dialyse der Probe und Probensammlung genau berechnet wird.

Hier liegt ein Volumen von 30 Mikrolitern zwischen der Sonde und der Sammelstelle bei einer Rate von 1,5 Mikrolitern pro Minute vor. Es besteht eine Verzögerung von 20 Minuten, von dem Zeitpunkt, an dem die Probe das Gehirn verlässt, bis sie gesammelt wird. Sammeln Sie nach der Equilibrierungsphase mindestens drei Proben, während sich die Ratte in der Heimkammer befindet.

Um eine stabile Messgrundlinie vor der Verhaltensprüfung zu etablieren, planen Sie sorgfältig den Zeitpunkt der Applikation Ihrer Behandlungslösung an das Gehirn. In diesem Aufbau, bei dem ein Volumen von 30 Mikrolitern zwischen der Spritzenspitze und der Sonde besteht, die in das Gehirn des Tieres eindringt, wechseln wir die Behandlungsspritze 20 Minuten vor dem gewünschten Eintreffen der Behandlungslösung im Hippocampus gegen die perfundierte Behandlungslösung aus. Um die Spritzen zu wechseln.

Trennen Sie einfach die Zulaufleitung von der Kontroll-Perfuse-eight-Spritze und schließen Sie sie schnell an die Behandlungs-Perfuse-eight-Spritze an. Dies sollte nicht länger als fünf Sekunden dauern, um eine Unterbrechung des Perfuse-eight-Durchflusses zu vermeiden. Achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen, die die Wirksamkeit zum entsprechenden Zeitpunkt beeinträchtigen könnten.

Nach der Verabreichung der Behandlung das Tier vorsichtig in die gewählte Einrichtung für Verhaltensuntersuchungen bringen. Hier wird die spontane Alternation in einem plusförmigen Labyrinth gemessen. Dem Tier ermöglichen, das Labyrinth 20 Minuten lang frei zu erkunden.

Notieren Sie die Abfolge und den Zeitpunkt der Armbewegungen von Aries entweder mithilfe einer Videoaufzeichnung oder manuell, um Proben zu sammeln. Bewegen Sie während dieses Zeitraums das Ausflussrohr in ein neues Sammelgefäß. Halten Sie alle fünf Minuten das Rohr so, dass es sich frei bewegen kann.

Es sollte die Bewegung der Ratte nicht behindern oder sich vor dem Tier bewegen und abgelenkt still verharren, sodass Ihre Bewegungen das Verhalten der Ratte nicht beeinflussen. Entfernen Sie die Ratte nach der Testung vorsichtig aus dem Labyrinth und bringen Sie sie in die Kontrollkammer zurück. Setzen Sie die Sammlung von Mikrodialysaten für mindestens vier Proben fort, um den Erholungszeitraum nach der Aufgabenausführung abzudecken.

Nachdem die gewünschten Proben gesammelt wurden, entfernen Sie die Sonde vorsichtig vom Kopf des Tieres und legen Sie sie in ein Aufbewahrungsröhrchen. Bringen Sie das Tier in seinen Heimkäfig zurück und beobachten Sie es genau auf eventuelle postexperimentelle Veränderungen im Gesundheitszustand oder Verhalten. Spülen Sie abschließend die Schläuche aus, indem Sie auf eine Spritze mit einer Katho-Lösung umschalten, um das Wachstum von Mikroben zu verhindern.

Dieses Beispiel zeigt einen mit der Aufgabe verbundenen Abfall der Glukose im hippocampalen ECF. Der graue Kasten stellt die Zeit dar, die das Tier im Labyrinth verbracht hat. Die violette Linie zeigt die hippocampale Glukosekonzentration bei Tieren ohne Labyrinthtest, während die rote Linie Tiere darstellt, die die spontane Alternationsaufgabe mit dem Unterarm durchführen.

Die orangefarbene Linie zeigt Messungen an Tieren, die die einfachere Version dieser Aufgabe mit drei Armen durchführen. Hier sind die Veränderungen von Hippocampus, Glukose und Laktat nach der Verabreichung von Insulin zu sehen. Beachten Sie, dass diese Veränderungen ohne jegliche Verhaltensprüfung beobachtet werden und daher allein die Wirkung von Insulin unter Grundbedingungen widerspiegeln.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es äußerst wichtig, ruhig zu bleiben. Ratten können Stresszustände des Experimentators wahrnehmen und werden dann unruhig, was die Durchführung erheblich erschweren und vermutlich Ihre Ergebnisse verfälschen kann. Diese Kombination von Techniken ermöglicht eine genaue neurochemische Untersuchung von Verhaltensprozessen.

Ähnliche Techniken werden heute auch bei menschlichen Patienten angewendet. Beispielsweise können bei Patienten mit Epilepsie, bei denen Elektroden implantiert wurden, um den Anfallsfokus zu lokalisieren, zusätzlich Mikrodialysesonnen implantiert werden, um Stoffwechselmessungen zu ermöglichen.