Name: Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Erfahren Sie die sequenzielle Photobleiche zur Darstellung einzelner Schwann-Zellen an neuromuskulären Synapsen. Diese Methode nutzt konfokale Mikroskopie und GFP-markierte transgene Mäuse für präzise Einzelzellanalysen.

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Wir möchten Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi und Kristina Wullimann für hervorragende technische Unterstützung danken. Wir danken W. Macklin für die Bereitstellung Plp-GFP Mäusen. , Von der Alexander-von-Humboldt-Stiftung und von der nationalen Förderagentur (&quot;Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot;; TM wird durch das Institut für Höhere Studien (Technische Universität München), von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG) unterstützt ) im Rahmen des ERA-Net NEURON &quot;iPSoALS&quot; und &quot;2-Photonen-Imaging&quot;. TM und MB werden vom Center for Integrated Protein Science (München) unterstützt. PM wurde von der Graduate School der Technischen Universität München (TUM-GS) unterstützt.

Ein. Triangularis Sterni Explantation (Abbildung 1) Timing: 15 min. <ol><li> Bereiten chirurgische Instrumente: 2 Paar Zangen, 1 Schere, 1 Paar Frühjahr Schere, 1 Gewebekulturschale (10-cm). Pre-Blasen (mindestens 15 min) gekühlt (4 ° C) Ringer-Lösung mit 5% CO 2/95% O 2. Füllen Sie 15-cm Gewebekulturschale mit Eis und bedecken Sie es mit Metallplatte. Planen Dissektionsmikroskop und legen die 15-cm-Schale mit Eis unter der Dissektion Umfang um das Explantat beim Präparieren kühlen. </li><li> Lethally betäuben der Maus durch Isofluran Überdosierung (oder einem anderen anerkannten Methode des Opfers). Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol zu Pelz Kontamination der Explantation zu verhindern. Für SC Bleichen, verwendeten wir Plp-GFP-Mäuse, die Thy1-OFP3 oder Thy1-Membow13 zur gleichzeitigen Visualisierung der Axon überquert werden können. </li><li> Mit dem Paar große Schere, einen Medianschnitt desdie Haut über dem Brustbein und zwei Einschnitte parallel zur unteren Kante des Brustkorbs. </li><li> Mit dem Paar große Schere, die Haut entfernen, öffnen Sie die Bauchdecke, und machen Einschnitte parallel zum Rippenbogen den ganzen Weg zurück auf die Wirbelsäule. Dann sezieren off die Brustmuskeln durch Einschnitte in der Nähe des Muskels Einsetzen an dem Brustbein. </li><li> Schneiden Sie die Blende geöffnet knapp unterhalb der xiphoid Knorpel und sezieren off der Membran entlang ihrer Küsten-Insertionen. </li><li> Halten des Brustkorbs des Xiphoid mit einem Satz von Zangen, startet das Schneiden der Rippen von der Wirbelsäule, so nah wie möglich an ihrer Insertionen. Die linke und rechte Schnitte sollten oberhalb des Herzens in Richtung Man. sterni konvergieren. Versuchen Sie zu vermeiden Schneiden großen Blutgefäße (vor allem die subclavia). Bessere Sichtbarkeit wird durch leichtes Anheben der Vorbereitung, während auf den Xiphoid mit einer Pinzette erreicht. </li><li> Machen Sie einen Schnitt quer unterhalb des Man. sterniund übertragen das Explantat in den 10-cm-Spiegel mit gekühlter 5% CO 2/95% O 2-Blasen Ringer-Lösung. Legen Sie die 10-cm-Spiegel auf der Metallplatte für den 15-cm Gewebekulturschale mit Eis gefüllt. Alle weiteren Schritte sollten unter der Dissektionsmikroskop durchgeführt werden. </li><li> Mit kleinen Feder Schere entfernen Sie die Reste des Thymus, Pleura, Zwerchfell (innen) und Brustmuskeln (außerhalb; 1B-D). </li><li> Um das Explantat in dem 3,5-cm-Schale passen, sezieren off alle Rippen, die nicht mit dem Brustbein haben einzufügen. Dies geschieht am besten mit kleinen Feder Schere und Schneiden des Gewebes in zwischen den Rippen (1E). </li><li> Pin der triangularis sterni Nerv-Muskel-Explantat in die Sylgard beschichtet 3,5-cm Gewebekulturschale mit minutien Stifte (verkürzt auf &lt;4 mm; Figur 1G). Zwei Stifte sollten durch knorpeligen (weiß) Teilen des Brustbeins zu gehen. Legen mindestens zwei Stifte durch die Rippen sowohl auf der linken und rechten Seite des the Explantat Ziel für die weicheren Teile und knorpeligen Vermeidung der Rippen unter oder nahe der triangularis Muskel. Je mehr Nadeln verwendet werden, desto besser (wir verwenden typischerweise 8-10). Wie Sie unten Stift die Vorbereitung, stellen Sie sicher, dass die Rippen etwas verteilt sind, zur Festsetzung der Muskel in einer leicht gestreckten Position. </li><li> Optional: Visualisieren synaptischen Seiten mit Acetylcholin-Rezeptoren, indem Bungarotoxin gekoppelt Alexa-Farbstoffe (Konzentration von 0,8 pg / ml in 5% CO 2/95% O 2-Blasen Ringer-Lösung). Inkubieren merken Explantat in Sylgard beschichtete Schale für 15-20 min bei Raumtemperatur dann waschen mehrmals mit 5% CO 2/95% O 2-Blasen Ringer-Lösung. </li></ol> 2. Bleaching SCs und optionale Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 2) Timing: 30 - 45 min + optional 1 bis 5 Stunden für Zeitraffer. <ol><li> Transfer 3,5-cm-Sylgard-beschichtete Gericht zu einem konfokalen Mikroskop ausgestattet with ein Argon-Laser (488 nm Wellenlänge) und dem Eintauchen in Wasser Objektive (4x, 0,13 NA; 20x, 0,5 NA und 100x, 1,0 NA oder 60x, 0,9 NA). </li><li> Optional für Zeitraffer-Mikroskopie: Insert 3,5-cm-Sylgard-beschichtete Schale in Heizring, installieren Superfusionssystem und den Temperaturfühler (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass keiner von ihnen das Explantat, der Rand des Spiegels oder des Sylgard Beschichtung berühren. Erhitzen der Probe auf 33-35 ° C. Für SC Bleichen ohne Zeitraffer, Raumtemperatur ist besser, als Zellen weniger Dynamik zwischen Bleich-Schritte zeigen. </li><li> Mit einem 4x Luftobjektiv beobachten Innervationsmuster triangularis sterni Muskeln und finden triangularis sterni Endplatte Band. Wechseln Sie zu 20x Tauchen-cone Ziel und die Suche nach oberflächlichen Regionen innerhalb der Endplatte Band (Bereiche darüberliegenden Rippen sind gute Kandidaten). Ändern Ziel 100x oder 60x Tauchen-cone Ziel auf einzelne NMJs überprüfen. Ideal ist ein NMJ, die von mehreren SCs abgedeckt und befindet sich in unmittelbarer superficially (2B). Wenn Sie Zeitraffer-Aufnahmen nach dem Bleichen durchzuführen, wählen Sie bis zu 3 NMJs, die relativ nahe beieinander liegen, um die Ausbeute zu erhöhen. </li><li> Erwerben Sie eine konfokale Abbildung des NMJ vor Fotobleichen einzelne SCs (Abbildung 2B). (Für volle Auflösung Bildgebung auf einem Olympus FV1000 Mikroskop zB, verwenden Sie eine 100x, 1,0 NA objektive und 2,5 Zoom, der in Nyquist-limited Probenahme von ~ 0,1 um pro Pixel führt.) </li><li> &quot;Park&quot; der 488 nm Laserstrahls zentral auf dem Kern einer SC mit voller Leistung für 5 Sekunden (alternativ ein effizientes Abtastmuster in einer kleinen Region von Interesse verwendet werden kann, wie der &quot;Tornado-Scan&quot;-Funktion auf einem Olympus-Mikroskop; da wir ein Konfokalmikroskop zu verwenden, wird der Laser in die Bild-konjugierten Ebenen fokussiert und daher bei 488 nm mit einem Objektiv von 1,0 NA, &lt;0,5 um im Durchmesser). Auf die Zelle und Richter Bleichergebnis neu ausrichten. Wenn nötig wiederholen Bleichschritt erst wieder GFP Ebenen sind zu reduzierend in der Nähe Hintergrund-Ebenen. Erwerben Sie ein Bild nach dem Bleichen (Abbildung 2C). Es ist kritisch, um sicherzustellen, dass die gebleichte Region außerhalb jeder Überlappung zwischen zwei Zellen ist - wenn es eine Überlappung wird Bleichmittel in einer zweiten Zelle offensichtlich sein. </li><li> Wiederholen Sie Schritt vor, bis alle, aber ein SC gebleicht werden (Abbildung 2D-E). Der letzte &quot;rohen&quot; SC eignet sich für die konfokale Zeitraffer-Mikroskopie. Rekonstruieren Einzelzellen durch Subtraktion der Bilder, zB mit Photoshop Software, um einzelne SC Morphologie und Gebiet (2F) abzugrenzen. Seien Sie sich bewusst, dass die Subtraktion zweier Magier fügt Rauschen (zB durch Import in Folge &quot;Schichten&quot; in Photoshop festlegen und dann die obere Kanal auf &quot;Differenz&quot; in der Drop-Down-Menü am oberen Rand der Kanäle tab). Dies kann durch die &quot;Flecken Entfernen&quot;-Funktion auf den Kanälen vor Abzug und Zuschneiden entfernt einen Hintergrund, die offensichtlich nicht von der nicht stammen umgangen werdengebleichten Zelle. Um den Kontrast zu optimieren, kann es erforderlich sein, um die Helligkeit der zwei Kanäle in dem &quot;Ebenen&quot; Fensters zu verändern. Das resultierende Bild des gebleichten Zelle ist die überlagert auf dem Originalbild einer Synapse, pseudo-farbig in einer einzigartigen Farbton und transparent gemacht, das Gebiet des gebleichten Zelle im Originalbild farblich (ab dabei für alle gebleichten und der letzte , ungebleicht Zellen das Bild in Abbildung 2F Ergebnisse gezeigt). </li><li> Optional: Start konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie nach dem Bleichen alle, aber ein SCs. Aufnehmen eines Bildes in festen Abständen (beispielsweise alle 5 bis 10 min). Verwenden Sie so wenig Laserleistung wie möglich. Bis zu 3 NMJs können an der gleichen Sitzung abgebildet werden. </li><li> Machen Sie eine Karte der Zeitraffer NMJs, indem ein Bild mit 100x ohne Zoom, dann Bilder der Region mit 20x und 4x Ziele (Abbildung 2G-I). Diese &quot;Karte&quot; wird benötigt, um NMJs nach Immunhistochemie einer festen Muskeln zu finden. </li><li> Bei Bild-Verarbeitung, Umwandlung einzelner Bilder in maximaler Intensität Projektionen und speichern im TIFF-Format. Kombinieren Sie alle z-projizierte Zeit-Punkte in einem Stapel und richten in xy, zB mit dem &quot;stackreg&quot; plugin 10 in Fidschi (ein Paket auf dem Open-Source-Software ImageJ basiert; National Institutes of Health). </li></ol> 3. Fixierung und Immunhistochemie (Abbildung 3) Timing: Übernachtung. <ol><li> Übertragen des Explantats in einem 50-ml-Reaktionsgefäß mit mindestens 15 ml 4% PFA durch vorsichtiges Entfernen der Stifte. Post-fix die vordere Brustwand mit dem triangularis sterni Muskel für 1 Stunde auf Eis. Spülen fixierten Gewebes mit 0,1 M Glycin in PBS (um restliches Fixiermittelpartikel quenchen und verringern somit Hintergrund) für mindestens 10 min. Proben können an dieser Stelle gespeichert und verarbeitet werden später. </li><li> Übertragen festen Explantat zu einem 10-cm Sylgard Gewebekulturplatte Gericht mit 0,01 M PBS gefüllt. Schneiden Sie eine Trapezform mit einer side parallel zum Brustbein und die andere durch die Knochen-Knorpel-Übergänge - diese enthält die triangularis Muskeln auf seiner Oberfläche. Entfernen Sie den unteren Rippen mit einer horizontalen (dh trans-sternal) geschnitten, so dass das kaudale Ende des triangularis Muskeln frei zugänglich ist (Abbildung 3A-D). </li><li> Einfügen einer Injektionsnadel als Stift in den oberen Teil des Trapezes (3E). Verwenden einer subkutanen Nadel, die an einer 1 ml Spritze und der Pinzette triangularis Muskel auf der Oberfläche zu entfernen durch leichtes Festhalten eines kaudalen Ecke des Muskels und mit der Nadel als Mikro-Skalpell. Sicherstellen, dass Schnitte parallel zu der Ebene der Brustwand hergestellt. Sobald die kaudalen Teil des Muskels wird freigesetzt, legen Sie eine andere Injektionsnadel als Stift unterhalb des Muskels durch die Brustwand - das lähmt die Vorbereitung und ermöglicht Ausüben eines leichten Zug auf den Muskel mit einer Pinzette (3F). Wie Sie schneiden Binde tissue Insertionen, &quot;peel&quot; weg der Muskel aus dem Thorax. Cut letzten caudal Befestigung mit Feder Schere. Entfernen Sie Fett und Blutgefäße Überreste mit einer Pinzette. Seien Sie vorsichtig, nicht zu zerreißen weg die Nerven. Hinweis: Verwenden Sie getrennte Gruppen von Werkzeugen und Geschirr für die Arbeit mit lebenden und fixierten Gewebe. </li><li> Starten Immunhistochemie (mit einem Standard-Protokoll) durch Übertragen Gewebeproben in Blockierlösung für 1 Stunde auf einem Schüttler bei Zimmertemperatur. Kleinstmöglichen Volumen für die Färbung ist 200 ul mit einer 96-Well-Platte. </li><li> Bewerben Primärantikörper in Blocking-Lösung wurden 200 ul pro Well über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler verdünnt. </li><li> Waschen in 0,01 M PBS dreimal 10 min. </li><li> Anwenden geeigneter sekundärer Antikörper für 1-2 h bei Raumtemperatur in Blockierungslösung verdünnt. </li><li> Waschen in 0,01 M PBS dreimal 10 min. </li><li> Montieren Sie in der Anti-Fading-Medium (zB Vectashield) und Deckglas. </li><li> Objektträger auf magnetischen Metallplatte, Ort Magneten aufder Probe für ein paar Stunden oder über Nacht bei 4 ° C abzuflachen Dichtung mit Nagellack. </li></ol>

<ol><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
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<li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li>
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<li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li>
<li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li>
<li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der SC Bleichen hier vorgestellte Methode ist einfach, schnell und vielseitig: (i) Es ermöglicht enthüllt einzigen SC Morphologie und Dynamik durch konfokale Mikroskopie auf einer einzigen Transgen basiert - und das ist ein wesentlicher Vorteil bei der Kombination der Ansatz z. B. mit der Krankheit Modelle, die zusätzliche Allele erfordern . (Ii) Das Verfahren ist schnell, wie aus Dissektion zur Fixation in einem halben Tag durchgeführt werden kann. (Iii) Die Anzahl der Anwendungen ist breit, wie es mit anderen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Company (Beispiel) </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 70% (Vol / Vol) Ethanol-Lösung </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> in Sprühflasche </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> jede andere zugelassene Betäubung kann für tödliche Anästhesie verwendet werden </td></tr><tr><td> transgenen Mäusen (Plp-GFP) </td><td></td><td></td><td> von zitierten Quellen gewonnen werden </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop mit Kaltlichtbeleuchtung </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> ausgestattet mit Schott KL 1500 LCD </td></tr><tr><td> Pinzette #2 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzette # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> Schere, große medizinische </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> Schere, kleine abgewinkelte Feder </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> Durchlauferhitzer </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> Heizen Ring für 3,5-cm-Schalen </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> Zwei-Kanal-Temperaturregelung </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Superfusion Pumpsystem </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15-cm Gewebekulturschale </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> gefüllt mit Eis und abgedeckt Metallplatte </td></tr><tr><td> 10-cm Gewebekulturschale </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> mit sauerstoffreichem Ringer-Lösung </td></tr><tr><td> 3,5-cm Gewebekulturschale </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> gefüllt mit Sylgard Polymers </td></tr><tr><td> Sylgard Polymers </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Silikon-Elastomer Kit </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV1000 </td><td> mit Argonlaser </td></tr><tr><td> 50-ml Reaktionsgefäß </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% PFA in PBS </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Kanüle 0,5 mm x 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> Spritze 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> Synaptophysin-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> Kaninchen </td></tr><tr><td> Sekundärantikörpers </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> 24-Well-Platte </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0,01 M PBS </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M Glycin in PBS </td><td> Roth </td><td> 3790,1 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> Dias </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien Stifte × 10 </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-20 </td><td> verkürzt auf &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin Alexa 594 gekoppelt </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blocking Solution </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% Normal Goat Serum </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% Rinderserumalbumin </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Glöckner sprudelte mit 95% O 2/5% CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM CaCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Spezifische Reagenzien und Ausrüstungen. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleiche zur einzel-schwann-zellen an der neuromuskulären synapse delineate

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequentielle Photobleichen stellt eine nicht-invasive Methode zur individuellen SCs im NMJ etikettieren. Die NMJ ist die größte Synapsen des Nervensystems der Säuger-System und ist als Leitbild zur synaptischen Struktur und Funktion zu untersuchen serviert. In Maus NMJs Motors Axonterminalen bilden Brezel-like Kontaktstellen mit Muskelfasern. Der Motor Axon und sein Terminal werden von SCs ummantelt. In den vergangenen Jahrzehnten haben mehrere transgene Mäuse generiert, um Motoneuronen und SCs visualisieren, zum Beispiel Thy1-XFP 1 und Plp-GFP Mäusen 2. Motor entlang Axone werden myelinisierenden axonalen SCs in nicht überlappenden Internodien angeordnet, getrennt durch Knoten Ranvier, um saltatorische Aktionspotential Ausbreitungsrichtung aktivieren. Im Gegensatz dazu sind Endgerät SCs an der Synapse spezialisierten Gliazellen, welche zu überwachen und zu fördern Neurotransmission, verdauen Schutt und Führung regenerierenden Axone. NMJs eng um bis zu einem halben Dutzend nicht MYEL abgedecktinating Endgerät SCs - dies kann jedoch nicht durch Lichtmikroskopie individuell aufgelöst werden, da sie in direktem Kontakt Membran 3 befinden. Mehrere Ansätze existieren individuell visualisieren Terminal SCs. Keiner von ihnen sind makellos, though. Zum Beispiel erfordert Farbstoff Füllung, wobei einzelne Zellen mit einem Farbstoff gefüllten Mikroelektrode aufgespießt werden, Zerstören eines markierten Zelle vor dem Befüllen eine zweite. Dies ist nicht kompatibel mit anschließender Zeitraffer-Aufnahmen 3. Multispektrales &quot;Brainbow&quot; Kennzeichnung von SCs ist durch Verwendung kombinatorischer Expression von fluoreszierenden Proteinen 4 erreicht. Allerdings erfordert diese Technik, die mehrere Transgene und wird durch die Expressionsmuster der verwendeten Promotoren beschränkt. In Zukunft könnte Ausdruck &quot;photoschaltbare&quot; Proteine ​​in SCs noch eine andere alternative 5 sein. Hier präsentieren wir sequentielle Fotobleichen, wo einzelne Zellen gebleicht werden, und ihr Image durch Subtraktion erhalten. Wir glauben,dass dieser Ansatz - aufgrund seiner Einfachheit und Vielseitigkeit - eine dauerhafte Neben der Neurowissenschaftler Technologie-Palette, zumal es in vivo verwendet werden können und auf andere übertragen Zelltypen, anatomischen oder Arten 6. In dem folgenden Protokoll, Detail wir die Anwendung der sequentiellen Bleichen und anschließende konfokale Zeitraffer-Mikroskopie an Klemme SCs in triangularis sterni Muskel-Explantaten. Diese dünne, oberflächliche und einfach zerlegt Nerv-Muskel-Präparat 7,8 hat sich für ein Studium der NMJ Entwicklung, Physiologie und Pathologie 9 nützlich. Schließlich erklären wir, wie die triangularis sterni Muskeln bereit ist nach der Fixierung durchzuführen korreliert hochauflösende konfokale Bildgebung, Immunhistochemie oder ultrastrukturelle Untersuchungen.

Ein Beispiel eines triangularis sterni Explantat bereit zum Abbilden Schale wird in Figur 1G gezeigt. Diese Explantat eignet sich besonders für bildgebende NMJs ex vivo als die triangularis Muskel besteht nur aus wenigen Lagen von Muskelfasern. Dies ermöglicht den Erhalt hochauflösende Bilder von Explantaten aus transgenen Maus Linien abgeleitet werden, dass entweder Highlight SCs (Plp-GFP 2) und / oder Axone (Thy1-XFP 1). Kritische Faktoren für hohe Bild...

Sichtbarmachen einzelner Zellen in dicht gepackten Geweben wie terminalen Schwann-Zellen (SCs) an neuromuskulären Endplatten (NMJs), ist eine Herausforderung. &quot;Sequential Fotobleichen&quot; ermöglicht die Abgrenzung einzigen Terminal SCs, zum Beispiel in der triangularis sterni Muskel Explantat, eine bequeme Nerv-Muskel-Präparat, wo sequenzielles Bleichen mit Zeitraffer-Aufnahmen kombiniert werden können und<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunfärbungen.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequenzielles Photobleaching bietet eine nicht-invasive Methode zur Markierung einzelner Schwann-Zellen (SCs) an der neuromuskulären Endplatte (NMJ). Die NMJ ist die größte Synapse des Nervensystems der Säugetiere ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einzelne Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse mittels konfokaler Mikroskopie darzustellen. Dieses Protokoll verwendet transgene Mäuse, die GFP in terminalen und axonalen Schwann-Zellen exprimieren. Der erste Schritt ist die Entnahme eines Nerv-Muskel-Präparats.Als Nächstes erfolgt die sequenzielle Bleiche aller außer einer Schwan-Zelle an einer bestimmten neuromuskulären Verbindung, wodurch die Einzelzellmorphologie sichtbar wird. Abschließend wird eine Übersichtsaufnahme mit geringer Vergrößerung angefertigt. Das Gewebe wird fixiert und für die Immunhistochemie verwendet, um jeden gewünschten Marker in Bezug auf die verbliebene, nicht gebleichte Schwan-Zelle sichtbar zu machen.Die Ergebnisse zeigen die Einzelzellmorphologie sowie, falls gewünscht, Zeitraffermikroskopie oder immunhistochemische Kolokalisationsanalyse in fixiertem Gewebe basierend auf konfokaler Bildgebung. Obwohl diese Methode Einblicke in die Morphologie und das Gebiet einzelner Schwanzellen an der neuromuskulären Verbindung ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie Zelllinien, lebende Hirnschnitte oder sogar andere Arten wie Zebrafische.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da es etwas Erfahrung erfordert, eine ausreichend oberflächliche neuromuskuläre Verbindung zu identifizieren, und um Zeit nicht mit Strukturen zu verschwenden, die sich nicht lohnen. Vor Beginn der Operation das Ringer-Lösung mindestens 15 Minuten lang mit Sauerstoff anreichern und kühlen. Eine 15 cm große Zellkulturschale mit Eis unter ein Mikroskop stellen und mit einer Metallplatte abdecken.Stellen Sie die mit Ringer-Lösung gefüllte 10 cm großen Zellkulturschale auf die Metallplatte. Geben Sie den Sauerstoffstein in die Lösung. Im nächsten Schritt wird eine Maus ausgewählt, deren Schwann-Zellen und Axone mit unterschiedlichen Farben markiert sind.Nachdem die Maus euthanasiert wurde, besprühen Sie sie mit Ethanol, um eine Kontamination durch Fell zu verhindern. Verwenden Sie eine große Schere, um einen medianen Schnitt über dem Brustbein sowie zwei Schnitte parallel zum unteren Rand des Rippenbogens anzulegen. Entfernen Sie die Haut, öffnen Sie den Bauchraum und dissezieren Sie die Brustmuskulatur ab, wobei die Schnitte nahe der Muskeleinfügung am Brustbein erfolgen. Halten Sie mit einer Pinzette den Xiphoidknorpel fest und durchtrennen Sie das Zwerchfell knapp unterhalb des Xiphoidknorpels.Präparieren Sie das Zwerchfell entlang seiner costalen Ansätze heraus. Befeuchten Sie das Gewebe gelegentlich mit Ringer-Lösung, um Austrocknung zu verhindern, und halten Sie den Rippenkorb dabei mit einer Pinzette am Xiphoidfortsatz fest. Beginnen Sie damit, die Rippen so nah wie möglich an ihren Ansätzen von der Wirbelsäule abzuschneiden.Die linken und rechten Schnitte sollten oberhalb des Herzens in Richtung des Manubrium sterni zusammenlaufen. Vermeiden Sie es, größere Blutgefäße zu durchtrennen, insbesondere die Vena subclavia. Für eine bessere Sichtbarkeit.Heben Sie die Präparation vorsichtig an, indem Sie mit der Pinzette am Xiphoidfortsatz festhalten. Führen Sie nun einen Querschnitt direkt unterhalb des Manubrium sterni durch, um den Thorax zu entfernen, und übertragen Sie das Präparat in die 10 cm große Schale mit der vorbereiteten Ringer-Lösung. Stellen Sie die Schale auf die Metallplatte und die mit Eis gefüllte Schale unter das Mikroskop.Entfernen Sie mit kleinen Feder-Scheren die Reste von Thymus, Pleura, Zwerchfell und Brustmuskulatur. Trennen Sie mit kleinen Feder-Scheren alle Rippen ab, die nicht am Brustbein ansetzen. Durchtrennen Sie das Gewebe zwischen den Rippen.Dies ermöglicht es, dass das X-Explan in eine 3,5 cm große SIL-beschichtete Schale passt. Befestigen Sie das X-Explan nun mit acht bis zehn verkürzten Minuchin-Nadeln, wobei der hier markierte dreieckige Sternoideus-Muskel zu vermeiden ist. Zwei Nadeln sollten durch die knorpeligen Anteile des Brustbeins gehen, und zwei Nadeln sollten durch die weicheren knorpeligen Bereiche zwischen den Rippen geführt werden.Vermeiden Sie es, die Rippen unter oder nahe dem Musculus triangularis zu durchstechen. Setzen Sie das Fixieren mit Nadeln fort, bis die Rippen etwas auseinandergezogen sind. Befestigen Sie den Muskel in einer leicht gedehnten Position. Überführen Sie die mit der 3,5 cm breiten Sill-Schutzschicht beschichtete Petrischale auf ein konfokales Mikroskop, das mit einem Argonlaser und Wasserimmersionsobjektiven ausgestattet ist. Für die Zeitraffermikroskopie setzen Sie die mit der 3,5 cm breiten Sill-Schutzschicht beschichtete Petrischale in den Heizring ein. Installieren Sie ein Überströmungssystem und bringen Sie eine Temperatursonde an.Stellen Sie sicher, dass nichts das Explanat, den Rand der Schale oder die Zigarrenbeschichtung berührt. Für die Zeitraffermikroskopie erwärmen Sie das X-Explanat, für die Schwann-Zell-Bleichung ist jedoch Raumtemperatur besser geeignet. Beobachten Sie nun mit einem Forex-Luftobjektiv das Innervationsmuster des musculus sternothyroideus und finden Sie das Endplattenband des musculus sternothyroideus.Wechseln Sie zum 20x-Tauchobjektiv und beginnen Sie, oberflächliche Bereiche innerhalb der nplate-Bandregionen zu suchen. Gute Kandidaten sind Bereiche über den Rippen und in der Nähe der Interkostalnerven. Wechseln Sie zum 100x- oder 60x-Tauchobjektiv, um einzelne mjs zu überprüfen.Suchen Sie idealerweise eine von mehreren Schwann-Zellen überdeckte neuromuskuläre Endplatte, die sehr oberflächlich liegt. Entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls ist es, oberflächliche und flache neuromuskuläre Junctionen zu finden. Da die neuromuskuläre Junction zylindrische Muskel­fasern innerviert, neigt sie dazu, sich um die Faser zu wickeln, und bietet oft nicht den perfekten Winkel für die Bildgebung. Wählen Sie daher nur neuromuskuläre Junctionen aus, die oberflächlich, flach und an der Oberfläche liegen, nun mit einem 100x-Objektiv mit numerischer Apertur von 1,0.Erwerben Sie mit einem 2,5-fachen Zoom ein konfokales Bild der neuromuskulären Junction (NMJ). Diese Einstellungen ergeben eine Pixelgröße von etwa 0,1 Mikrometern und gewährleisten eine geeignete räumliche Abtastung gemäß dem Nyquist-Kriterium. Bleichen Sie nun die Schwann-Zelle durch Photobleichen aus, indem Sie den 488-Nanometer-Laserstrahl fünf Sekunden lang zentral auf den Zellkern mit maximaler Leistung positionieren.Als Nächstes fokussieren Sie erneut auf die Zelle und beurteilen Sie das Bleichergebnis. Falls erforderlich, wiederholen Sie den Bleichschritt erneut, bis die GFP-Konzentration auf nahezu Hintergrundniveau reduziert ist, und nehmen Sie anschließend ein weiteres Bild auf. Es ist entscheidend sicherzustellen, dass der gebleichte Bereich außerhalb jeglicher Überlappung zwischen zwei Zellen liegt.Wenn eine Überlappung besteht, wird die Entfärbung in einer zweiten Zelle offensichtlich sein. Bei korrekter Durchführung führt dieser Ansatz zu deutlich sichtbaren endgültigen Zellen, die oft eine überraschende Morphologie aufweisen, die man vor Beginn des Verfahrens nicht hätte vorhersagen können. Wiederholen Sie den Entfärbungsprozess, bis alle Schwann-Zellen bis auf eine entfärbt sind.Die letzte ungebleichte Schwan-Zelle eignet sich für die konfokale Zeitraffermikroskopie. Nach Abschluss der Zeitrafferaufnahmen erstellen Sie eine Karte dieser njs, indem Sie ein Bild mit 100x ohne Zoom aufnehmen, anschließend Bilder der Region mit dem 20x-Objektiv und wiederholen Sie den Vorgang mit dem 4x-Objektiv. Diese Karte ist erforderlich, um die njs nach der immunhistochemischen Färbung eines fixierten Muskels zu lokalisieren.Nach der Bildgebung und Bleiche das Explant lösen und in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit mindestens 15 Millilitern 4 % PFA überführen. Anschließend das Röhrchen nach einer einstündigen Kühlung der Gewebeprobe auf Eis für eine Stunde stellen, danach das Gewebe mindestens 10 Minuten lang mit 0,1 molarer Glycinlösung in PBS spülen. Danach das fixierte Explant in eine mit einer fünf Zentimeter messenden Silikonverbandschicht beschichtete Zellkulturschale, die mit 0,01 molarer PBS gefüllt ist, überführen und mit der weiteren Dissektion des Explants beginnen.Schneiden Sie zuerst eine trapezförmige Fläche aus, wobei eine Seite parallel zum Brustbein und die andere durch den Übergang von Knochen zu Knorpel verläuft. Diese enthält den Musculus triangularis an ihrer Oberfläche. Entfernen Sie anschließend die unteren Rippen mit einem horizontalen oder transsternalen Schnitt, sodass das kaudale Ende des Musculus triangularis frei zugänglich ist.Stechen Sie nun eine Hohlnadel als Stift in den oberen Teil des Trapezes. Entfernen Sie danach den Musculus triangularis. Halten Sie zunächst mit einer Pinzette die Sehnenansatzstelle des Muskels vorsichtig fest.Als Zweites verwenden Sie eine Spritze und eine Nadel wie ein mikrochirurgisches Skalpell, um parallel zur Ebene der Brustwand zu schneiden. Sobald der Muskel im Bereich des Brustkorbs gelöst ist, führen Sie eine weitere Nadel unter dem Muskel durch die Brustwand, um das Präparat zu fixieren. Während Sie die Bindegewebeeinlagen durchtrennen, lösen Sie den Muskel vorsichtig mit einer leichten Zugbewegung der Pinzette vom Thorax ab.Entfernen Sie abschließend Fett- und Blutgefäßereste vorsichtig mit einer Pinzette. Achten Sie darauf, die Nerven nicht zu beschädigen. Der Musculus triangularis ist nun bereit für die Immunhistochemie.Ein trianguläres Sternauge-Präparat unter Verwendung von Mäusen, die GFP unter dem PLP-Promotor exprimieren, wurde zur ex vivo-Visualisierung von Schwann-Zellen hergestellt. Axone konnten gleichzeitig sichtbar gemacht werden, indem P-L-P-G-F-P mit O-F-P-Drei-Mäusen gekreuzt wurde. Mithilfe des beschriebenen Protokolls wurde die Morphologie einzelner terminale Schwann-Zellen durch Bleichen der benachbarten zwei terminalen und der ersten axonalen Schwann-Zellen lebend in überraschend hoher Detailgenauigkeit aufgezeigt.Abgebildete neuromuskuläre Junctionen wurden mithilfe der zuvor erstellten Karte zurückverfolgt und nach der Live-Konfokalmikroskopie im fixierten Gewebe mit hoher Auflösung gescannt, wobei das trianguläre Sternelexplan fixiert und gefärbt wurde. Dargestellt sind hier Acetylcholinrezeptoren, markiert mit Bungarotoxin gekoppelt an Alexa 647 in Rot, und synaptische Vesikel, markiert mit einem Antikörper gegen Synaptophysin in Weiß. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Morphologie einzelner Zellen sichtbar gemacht werden kann, die ursprünglich alle durch dasselbe fluoreszierende Protein markiert und zu dicht gepackt waren, um sie einzeln aufzulösen.Unser Beispiel zeigt die neuromuskuläre Verbindung, aber es gibt viele weitere mögliche Anwendungen.

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