Name: Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Erfahren Sie die standardisierte Trypsin-Passagierung von HuES humanen embryonalen Stammzellen. Diese Methode erhält undifferenzierte, karyotypisch normale Kulturen für zuverlässige Stammzellforschung.

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General Wir empfehlen dem Auftauen nicht mehr als eine Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt auf eine einfache Handhabung zu gewährleisten. Der Hundeführer sollte darauf achten, dass Kulturen bei Raumtemperatur und niedrigen CO2-Urlaub für längere Zeit. Alle Zentrifugation von lebenden Zellen ist bei 500-600 xg für 5 min bei Raumtemperatur. MEFs (embryonalen Feeder-Zellen) <ol><li> Pre-warm MEF Medien bis 37 ° C. Entfernen Sie MEF Fläschchen von -80 ° C und sofort tauchen die untere Hälfte der Röhre in einem 37 ° C Wasserbad. Es sollte ca. 30-45 Sekunden dauern, bevor die Zellen 80% aufgetaut (kleine gefrorene Teil links). </li><li> Bringt schnell das Rohr auf die Laminarströmungshaube, abspritzen mit 70% Alkohol und Transfer Zellen vorgewärmte Medien. </li><li> Saugen Sie die Gelatine-Lösung von Platten hergestellt früher. </li><li> Aliquot von 2 ml MEF-Lösung in einem tropfenweise Weise in jeder der sechs Brunnen. Achten Sie darauf, die MEFs gleichmäßig zu verteilen über den Brunnen. Datum der MEF Platte und in einem 37 ° C Inkubator über Nacht zu ermöglichen MEFs auf Platte befestigen. </li><li> Nach 6 Stunden MEFs wird an der Platte befestigt werden. Es ist am besten zu nutzen MEF Platten 24-48 Stunden nach dem Ausplattieren. NICHT in der MEF Platte, die über 4 Tage alt ist. </li><li> Pre-warmen Farbtönen Medien und 0,05% Trypsin / EDTA auf 37 ° C Unter der Haube prelabel ein steriles 50 ml konischen Rohr. </li><li> Vorsichtig absaugen Die Farbtöne Medien aus der Kultur, die geteilt werden. Vorsichtig waschen die Vertiefungen mit 2 ml 1X Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) pro Vertiefung. Saugen Sie das PBS. Add 0,75 ml 0,05% Trypsin / EDTA zum Brunnen. </li><li> Ersetzen Deckel, und beobachten Sie die Zellen unter 4x Vergrößerung. Die MEFs umliegenden Die Farbtöne Kolonien beginnen sich zurückzuziehen. Wenn die MEFs ausreichend sind gerundet und die Grenzen der Farbtöne Kolonien sind rau, Rückkehr der Platte an der Kapuze. Dieser Prozess dauert ca. 5 Minuten, absolut nicht länger als 10 Minuten oder Ihre Zellen nicht wieder wachsen. </li><li> Gently Pipette auf und ab, das Waschen der Grund des Brunnens, bis die MEF Monoschicht völlig losgelöst hat (Monolayer ist klebrig und kann in einem Stück bleiben). </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 50 ml konische Röhrchen mit zusätzlichen FARBEN Medien. Drehen Sie das Rohr von Zellen 500 xg für 5 Minuten, Absaugen der Medien, darauf achten, nicht das Zellpellet zu stören. </li><li> Um Platte auf eine neue Platte von MEFs, fügen Sie den entsprechend bestimmten Volumen der Zellen, um zusätzliche FARBEN Medien und Pipette die Lösung 5-7 mal mit einem automatisierten Pipette. </li><li> Entfernen Sie die MEF Druckmedien aus einem neuen Platte von MEFs. </li><li> Aliquot der Farbtöne Lösung tropfenweise in jede Vertiefung, so dass Sie die Tropfen gleichmäßig über die gut zu verteilen. Ohne Schütteln der Platte vorsichtig wieder die Zellen zu einer 37 ° C Inkubator über Nacht zu lassen FARBEN Kolonien Samen. </li><li> FARBEN Zellen kommen aus einem geteilten sollte sich ähnlich wie diejenigen, die aus einem Tauwetter. </li></ol>

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In diesem Video demonstriert, wie wir routinemäßig Durchgang FARBEN humanen embryonalen Stammzelllinien in unserem Labor. Effiziente und regelmäßige Aufteilung und Passagieren ist essentiell für die Aufrechterhaltung einer gesunden menschlichen embryonalen Stammzell-Linie. Trypsin-vermittelten Passage ist ein wesentlicher Vorteil von Farbtönen Zelllinien, ist es jedoch wichtig, nicht über trypsinize Kulturen oder zu einem großen Anteil der einzelnen Zellen während des Wiedereintritts Flechten haben.

FARBEN Medien 651,5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6,5 ml GlutaMAXTM 6,5 ml NEAA 6,5 ml 2-Mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Replacement 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng / mL Finale) 0,65 ml

passagierung farben humanen embryonalen stammzellen-linien mit trypsin

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin. Menschliche embryonale Stammzellen sind Artefakte der Zellkultur, und neigen dazu, karyotypischen Anomalien mit hoher Populationsverdopplungen erwerben. Proper Passagieren ist essentiell für die Aufrechterhaltung einer gesunden, undifferenziert, karyotypisch normalen FARBEN menschlichen embryonalen Stammzellen Kultur. Erstens, eine expandierende Kultur in PBS gewaschen, um restliches Medium und Zelltrümmer zu entfernen, dann Zellen werden mit einem minimalen Volumen von warmen 0,05% Trypsin-EDTA überlagert. Trypsin auf die Zellen für bis zu fünf Minuten nach links, dann Zellen werden vorsichtig mit einer 2-ml-serologischen Pipette verdrängt. Die Zellsuspension gesammelt und mit einem großen Volumen von Farbtönen Medien vermischt, dann Zellen werden durch sanfte Zentrifugation gesammelt. Das inaktivierte Trypsin Medien Gemisch entfernt und die Zellen in vorgewärmten FARBEN Medien resuspendiert. Eine entsprechende Teilungsverhältnis wird berechnet (in der Regel von 1.10 bis 01.20 Uhr), und die Zellen auf eine 1-2 Tage alten Platte mit einer Monoschicht von bestrahlten embryonalen Maus-Fibroblasten-Feeder-Zellen re-vernickelt. Die neu ausgesät FARBEN Kultur Platte links ungestört ist für 48 Uhr, dann werden die Medien wird jeden Tag danach. Es ist wichtig, nicht zu trpsinize auf eine einzige Zellsuspension, wie dies erhöht die Gefahr der Einschleppung von karyotypischen Anomalien.

In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig Passagen FARBEN humanen embryonalen Stammzell-Linien mit Trypsin.

Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

In diesem Video demonstrieren wir, wie unser Labor routinemäßig HuES-humane embryonale Stammzelllinien mit Trypsin passagiert. Humane embryonale Stammzellen sind Artefakte ...

Das ist, wo haben Sie die Techniken ausgeführt? Oh, wo habe ich dich gelehrt? Das erste Mal, als ich dir Bel beigebracht habe, habe ich den Sommer in meinem T.Yeah verbracht.Und das war so, dass wir dort Knorpelzeug mochten. Und so gefiel mir die soziale Kultur dort. Und dann, in meinem Abschlussjahr, in Hopkins, habe ich mit verschiedenen gearbeitet, also ging es bei mir, wie bei der Ingenieurssache, viel mehr darum, es zu versuchen, wir entwickeln dreidimensional.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen wachsen.

Von MEFs auf Matrigel I: Die Passage hESCs in Gegenwart von MEFs

Die Differenzierung der ESC deckt sich mit Zelltyp-spezifische Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung des Chromatins. Der Nachweis dieser Veränderungen bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die stemcellness und der Zelldifferenzierung zu definieren. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) stellt eine wertvolle Methode, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Stammzell-Differenzierung zu sezieren.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.

Von MEFs auf Matrigel 3: Die Passage hESCs von Matrigel auf Matrigel

Karyotypisierung ist eine einfache und nützliche Technik allgemein zum Nachweis genetischer Veränderungen verwendet. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll für das Chromosom verteilt Vorbereitung von menschlichen embryonalen Stammzellen für die Überwachung der chromosomalen Status dieser Zellen in Kultur gehalten.

Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Wir beschreiben ein kleines Molekül-basiertes Protokoll zur Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPC). Dieses Protokoll erzeugt Olig2 + NG2 + OPCs mit hohem Wirkungsgrad von 30 Tagen nach Differenzierung. Wir beschreiben eine Methode, die auf "Aufstocken" OPCs, dass Aktionspotentiale Feuer erzeugen kann.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Gerichtete Differenzierung von hES-Zellen in spezifische hat viel Interesse in der regenerativen Medizin erzeugt. Wir bieten Ihnen eine präzise, ​​Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Bestimmung...

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Dieses Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) zu vermehren, indem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta in einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder hPSC-spezifische synthetische Substrate.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

Diese Methode kann verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung mit pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit fluoreszierend markierten Sarkomerproteinen zu untersuchen.

Sarkomere-Verkürzung von pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung fluoreszierender Sarkomere-Proteine.

Um die Einschränkungen zu vermeiden, die mit der enzymatischen oder mechanischen Passage von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) verbunden sind, die auf Feederzellen kultiviert wurden, haben wir eine schnelle, effektive, kosteneffiziente und ertragreiche Methode zur Gewinnung von hESC- oder hiPSC-Kolonien etabliert, die auf einer Feederzellschicht menschlicher Vorhautfibroblasten gehalten werden, indem wir EDTA-vermittelte...

Schnelle, kostengünstige, enzymfreie Passage von humanen pluripotenten Stammzellen auf Feederzellen durch Ethylendiamintetraessigsäure-vermittelte Disadhäsion

Dieses Protokoll stellt die Differenzierung humaner Osteoklasten aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) dar und beschreibt Methoden zur Charakterisierung von Osteoklasten und Osteoklastenvorläufern.

Differenzierung und Charakterisierung von Osteoklasten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Erfahren Sie die standardisierte Trypsin-Passagierung von HuES humanen embryonalen Stammzellen. Diese Methode erhält undifferenzierte, karyotypisch normale Kulturen für zuverlässige Stammzellforschung.

Passagierung FARBEN humanen embryonalen Stammzellen-Linien mit Trypsin

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