Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die epithelialen Teile der Brustdrüse frei von assoziierten Bruststromazellen zu isolieren. Beginnen Sie mit der aufgelaufenen Dissektion des chirurgischen Verwerfungsmaterials, um es mit enzymatischem Verdau für epitheliale Strukturen anzureichern. Trennen Sie die epithelialen Organoide vom stromalen Material außerhalb der Basalmembran.

Anschließend werden die verdauten Organoide durch Zellsiebe mit fester Porengröße verarbeitet, um angereicherte Fraktionen zu erhalten. Säen Sie die Organoide für die sofortige Kultur aus oder frieren Sie die Bestände für die zukünftige Verwendung ein. Letztendlich werden die epithelialen Organoide verwendet, um Langzeitkulturen von normalen menschlichen Brustepithelzellen zu erzeugen.

Ich habe diese Methode erstmals in den späten 1970er Jahren entwickelt, um das Gebiet der menschlichen Epithelzellbiologie und der Karzinogenese voranzutreiben. Es stand reichlich chirurgisches Entwurfmaterial aus normalem menschlichem Gedächtnisgewebe zur Verfügung. Gefragt war eine Methode, um dieses heterogene Massenmaterial so zu verarbeiten, dass es für reine Epithelzellkulturen und -medien geeignet ist, um ein langfristiges Wachstum zu unterstützen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, insbesondere um zu notieren, wie man das grobe Sezieren durchführt. Wie sehen richtig verdaute Organoide aus? Filtern der Organoide und Plattieren der Organoide für die Kultur.

Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie saubere Epithelfraktionen liefert, da das Stroma intakt bleibt und die Epithelzellen intakt bleiben. Organoide, die wir gefunden haben, sorgen für das beste Anfangswachstum und maximieren die Anzahl der Zellen, die gewonnen werden können. Zwei Wissenschaftler des Lawrence Berkeley National Laboratory, James Garvey und Mark LeBarge, werden nun dieses Verfahren aus dem weggeworfenen Material chirurgischer Eingriffe demonstrieren.

Humanes Brustgewebe in sterilen Behältern erhalten, die Puffer oder vollständiges Medium plus Antibiotika bei vier Grad Celsius enthalten. Schneiden Sie Stücke des Taschentuchs ab und legen Sie sie in eine große sterile Glasschale. Trennen Sie die Epithelbereiche von der Stromamatrix aus Fettgewebe, Bindegewebe und Blutgefäßen.

Präparieren Sie vorsichtig die weißen Stränge der Epithelbereiche, die in die gelbere Stromamatrix eingebettet sind. Halten Sie das Material mit einer Pinzette fest und kratzen Sie das grob verfettete Material mit einem Skalpell ab. Schneiden Sie dann mit gegenüberliegenden Skalpellen das Epithelgewebe in etwa vier Millimeter große Stücke, um die Verdauung zu erleichtern.

Übertragen Sie das präparierte Epithelgewebe in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 50 oder 15 Millilitern In stark fibrösem Gewebe. Es wird mehr festes weißes, nicht-epitheliales Material geben. Wenn es schwierig ist, die Epithelzellen aus solchen fibrösen Matrizen herauszuzerlegen.

Das Gewebe kann in ein bis drei Millimeter große quadratische Stücke geschnitten und separat verdaut werden. Füllen Sie das Röhrchen mit dem Aufschlussmedium, das rohe Kollagenase und hohe hohe Tage enthält, und lassen Sie einen kleinen Luftraum frei, um das Mischen während der Rotation zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem 360-Grad-Rotator bei acht U/min Nach dem Aufschluss.

Die Proben werden durch Zentrifugation von 600 g fünf Minuten lang pelletiert. Entsorgen Sie das überstehende Fett und das Medium gemäß den institutionellen Richtlinien für die Entsorgung von menschlichem Gewebe. Um die Gewebeverdauung zu überwachen, verdünnt man ein kleines Eloqua des Pellets in Medium und untersucht mikroskopisch in vollständig verdauten Organoiden, um anhaftendes Stroma zu zeigen.

Wiederholen Sie den enzymatischen Aufschluss, bis das Gewebe vollständig zu reinen Organoiden verdaut ist. Wenn eine zweite Verdauung über Nacht erforderlich ist, muss die Konzentration der Enzyme möglicherweise reduziert werden, um eine Überverdauung zu verhindern. Richtig verdaute Organoide zeigen glatt erscheinende duktale alveoläre oder duktale Alveolarstrukturen, die frei von anhaftendem Stroma sind.

Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, wird das endgültige Pellet durch die Wiederbelebung in mittelgroßen Antibiotika suspendiert. Die aufgeschlossene Probe wird in Behältern durch ein steriles 100-Mikron-Sieb über ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen geleitet. Nachdem das Medium in die Röhre abgeflossen ist, waschen Sie die Organoide mit drei Millilitern Medium.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis das gesamte resuspendierte Pellet übertragen wurde. Drehen Sie dann den Filter vorsichtig über ein steriles Röhrchen und waschen Sie die Organoide mit mehr Medium in das Röhrchen. Dies ist der 100-Mikron-Organoid-Pool.

Führen Sie nun das Material, das in das ursprüngliche 50-Milliliter-Röhrchen abgeflossen ist, durch ein 40-Mikron-Sieb, um die Alveolarstrukturen vom Filtratpool aus Einzelzellen und kleinen Klumpen von mesenchymalen und epithelialen Zellen und kleinen Stücken Gefäßgewebe zu trennen. Zentrifugieren Sie die 100-Mikron-, 40-Mikron- und Filtrat-Pools fünf Minuten lang bei 600 g. Rekonstituieren Sie jede Probe mit einem Milliliter ccpm.

Zwei Gefrierlösungen pro 0,1 Milliliter gepacktem Gaumen. Bei vier Grad Celsius halten. Setzen Sie vorsichtig 0,1 Milliliter von jedem der beiden Organoid-Pools ein.

Tropfen für Tropfen in gleichmäßiger Verteilung auf ein oder 2 35-Millimeter-Schalen. Vermeiden Sie es, die Oberfläche der Schale nach einigen Minuten zu zerkratzen, nachdem sich die Organoide festgesetzt haben. Fügen Sie Wachstumsmedien langsam hinzu, um ein Verdrängen der Organoide zu vermeiden.

Anschließend inkubieren Sie die Primärkulturen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten CO2-Inkubator. Säen Sie auch 0,1 Milliliter des Filtratpools direkt auf Gewebekulturkunststoff mit Fibroblastenmedium. Inkubieren Sie die Primärkulturen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten CO2-Inkubator.

Nach 24 bis 48 Stunden ist die Zellmigration aus den Organoiden zu überprüfen und nach zwei bis drei Tagen die mitotische Wachstumskultur zu überwachen. Die Zellen nähern sich dem Zusammenfluss und füllen das Medium alle zwei bis drei Tage wieder auf. Kleine Stücke des Gefäßsystems können sich anheften und zum Wachstum von Fibroblastenzellen führen.

Bei signifikantem Fibroblastenwachstum. Führen Sie eine differentielle Trippinisierung durch, um die Fibroblasten aus den großen Epithelpflastern zu entfernen. Waschen Sie die Zellen einmal in STE-Puffer.

Fügen Sie dann frische 0,5 Milliliter STE hinzu, um das Gericht mit kontinuierlicher mikroskopischer Beobachtung und sanften, aber scharfen Stößen des Gerichts auf eine harte Oberfläche zu bedecken. Achten Sie auf eine Ablösung der Fibroblasten, während die Epithelzellen noch adhärenten Durchgang haben. Die Primärkulturen, wenn sich die Flecken des Epithelauswuchses dem Zusammenfluss nähern.

Um die Primärkultur beizubehalten und mehrere Sekundärkulturen zu erzeugen, verwenden Sie partielles Trypsin. Waschen Sie die Zellen einmal in STE-Puffer und fügen Sie dann frisches STE hinzu, um das Gericht nur abzudecken. Überwachen Sie, dass sich etwa 50 % der Zellen abgelöst haben.

Fügen Sie dann zwei Milliliter Serum mit Wachstumsmedium hinzu und ernten Sie die Zellen. Übertragen Sie die Zellen dann nach zwei Wäschen in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Poolieren Sie die geernteten Zellen und die Kultur Die Partialisierung kann etwa vier- bis achtmal wiederholt werden, wobei die Zellen aus den Primärschalen gut nachwachsen und aus der Subkultur oder den gefrorenen Sekundärzellen mit entsprechendem Langzeitwachstum wachsen.

Wir empfehlen, die Zellen aus der ersten partiellen Trypsinisierung zur sicheren Aufbewahrung einzufrieren und Zellen aus dem zweiten PT für die Subkultur zu verwenden. Wenn das Gewebe entsprechend verdaut und filtriert wird, sind Organoide mit duktalen und alveolären Strukturen mit glatten Kanten ohne anhaftendes Stroma zu sehen. Wenn es zu wenig verdaut wird, wird Material anhaftend und es kommt zu mehr Fibroblastenkontamination, wenn es überdaut wird, werden die Ränder rau und die Bindung ist nach der Organoid-Bindung weniger effizient.

Auswachsen des Epithels beginnt innerhalb von 48 bis 72 Stunden bei 48 Stunden. Es gibt noch keine aktive Zellteilung mit sichtbarer Mitose nach 72 Stunden. Die Mitose soll sichtbarer werden.

Kleine Gefäßstücke können nach vier Tagen eine Ursache für das Auswachsen von mesenchymalen Zellen sein. Epithelauswüchse weisen morphologisch heterogene Populationen auf, wobei die Färbung mit Antikörpern gegen Keratin 14 und Keratin 19 die grünen K 19 positiven luminalen und rot K 14 positiven myoepithelialen Linien sowie die gelben K 14 positiven K 19 positiven Vorläuferzellen markiert. HMEC kann in verschiedenen Medienformulierungen kultiviert werden.

Low-Stress-Medien wie M 87 a, ergänzt mit Choleratoxin und Oxytocin, unterstützen ein überlegenes langfristiges Wachstum von normaler Prästasis-HMEC sowie das Wachstum mehrerer HMEC-Linien. Die Ergebnisse der Faktenanalyse verdeutlichen die Abstammungsvielfalt in den unkultivierten Organoiden und in der vierten Passage, HMEC, kultiviert in M 87, A-Medium. Hier werden die luminalen und myoepithelialen Populationen durch Expression der luminalen Marker, EPCA und CD 2 27 und der myoepithelialen Marker CD 49 F und CD 10 replatiert, identifiziert.

Vierte Passage, HMEC. Fakten, die für die vorherigen luminalen und myoepithelialen Marker angereichert wurden, wurden durch Immunfluoreszenzanalysen für Keratin K 14 und K 19 HMEC bestätigt. Auf Kunststoff kultiviert, sind Passage vier in der Lage, organisierte Strukturen mit in vivo ähnlichen Abstammungsbeziehungen von luminalen und myoepithelialen Zellen zu bilden, wenn sie in geeignete CD 2 27 und CD 10 platziert werden, um für diese beiden Linien anzureichern.

HMCs behalten ihre Fähigkeit, eine korrekte 3D-Zellorganisation in mikrostrukturierten 3D-Mikrowells mit luminalen Zellen im Inneren der Myoepithelzellen zu bilden. Mit Fakten angereicherte Vorläuferzellen können auch robuste 3D-Strukturen bilden, wenn sie mit Matrigel plattiert werden, das duktuläre und alveoläre Strukturen nachahmt. Die 3D-Strukturen in Matrigel weisen auch eine korrekte 3D-Selbstorganisation auf.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die epithelialen Teile der Brustdrüse von dem damit verbundenen Bruststroma befreien können. Einmal gemeistert, kann diese Technik im Laufe von zwei bis drei Tagen durchgeführt werden. Die Technik der Gewebeaufbereitung ist im Allgemeinen einfach.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Verdauung an der richtigen Stelle zu stoppen.