Name: Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Epithelzellen aus menschlichem Mammagewebe mittels enzymatischer Verdauung und Filtration. Diese Methode ermöglicht Langzeitkulturen für die Erforschung von Epithelzellbiologie und Karzinogenese.

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MAL, JCG und MRS werden von der NIA (R00AG033176 und R01AG040081) und Laboratory Directed Forschung und Entwicklung, US Department of Energy contract # DE-AC02-05CH11231 unterstützt.

Ein. Tissue Processing und Verdauung <ol><li> Erhalten menschlichen Brustgewebe als discard Material von chirurgischen Eingriffen. Reduktion mammoplasties bieten kann normal oder gutartigen Zellen; Fibroadenome und gynecomastias bereitzustellen gutartigen Zellen; Nicht-Tumor-Gewebe Mastektomie (periphere oder kontralateralen zu einem Tumor, oder subkutanen) bereitzustellen, die Zellen von normal bis zu gutartigen enthaltenden Mikrotumoren reichen kann. Ordnungsgemäße IRB Zulassung vorliegt vor dem Erhalten der discard Material. Alle Materialien sollten unter bloodborne Erregers Vorschriften behandelt werden. </li><li> Das Material in sterilen Behältern mit Puffer oder Medien (zB 1:1 Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium und Ham F-12) mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 5 pg / ml Fungizone, 50U/ml Polymyxin B ergänzt, und 10% fötalem Rinderserum und Transport zu Labor bei 4 ° C. Reduction mammoplasty Gewebe gelagert oder bei 4 ° C versandt werden für 72 Stunden ohne nennenswerte Beeinträchtigung subsequent Lebensfähigkeit der Zellen. Kleine Stücke von Nicht-Reduktion mammoplasty Gewebe kann mehr zeitnahe Bearbeitung. </li><li> Trennen Sie die epithelialen Bereiche aus dem Stroma-Matrix von Fettgewebe, Bindegewebe und Blutgefäße mit einer Kombination aus sterilen Skalpell, Zangen und Scheren. Schneiden Sie Stücke von Gewebe mit einer Schere und in einem großen Glas sterile Schale (z. B. 150 mm). Sanft sezieren Sie die epithelialen Bereichen, die als weiße Fäden im yellower Stroma eingebettet erscheinen, mit der Pinzette das Material und das Skalpell zu kratzen die grob Fettmaterial halten. Zur Verdauung zu erleichtern, schneiden Sie das Epithelgewebe in kleinere Stücke von ~ 3-4 mm mit gegnerischen Skalpellen und in einen 50 ml Reagenzglas. Wenn große Mengen von Gewebe verarbeitet werden kann frischer Skalpellklingen benötigt. Entfernen Fettmaterial aus der Schüssel zur Entsorgung nach den institutionellen Regelungen. <ol class="lalpha"><li> In stark Bindegewebe (zB subkutan mastectomies mit schweren fibrocystic Krankheit), wird es mehr feste, weiße, nicht-epithelialen Material sein. Es kann schwierig sein, sich zu zerlegen die Epithelzellen aus solchen faserigen Matrizen. Große Stücke aus Fasermaterial kann in kleinere Stücke, ~ 1-3 mm Platz im Bereich sind verdaut und separat geschnitten werden. </li></ol></li><li> Platzieren Sie die seziert Epithelgewebe in einen konischen Zentrifugenröhrchen (50 ml oder 15 ml) mit dem Gewebe, umfassend nicht mehr als ein Drittel des Volumens der Röhre. Bringen der Röhre bis zum vollen Volumen, so dass nur ein kleiner Luftraum, um zum Mischen während der Rotation zu ermöglichen, unter Verwendung eines gewebespezifischen Verdauungsansatz (DME/F-12 oder gleichwertig, 10 ug / ml Insulin, Antibiotika wie oben und Endkonzentration von 10 % FCS, 200 U / ml Kollagenase und rohe 100 U / ml Hyaluronidase. </li><li> Die Röhrchen auf einem HulaMixer Röhrchenrotator und Drehen um 360 ° bei 8 rpm über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Zentrifugenröhrchen bei 600 × g für 5 min. Überstand verwerfen Fett und Medium für Entsorgung gemäßING institutionelle Regelungen. </li><li> Überprüfen für die Fertigstellung der Verdauung durch Verdünnen eines kleines Aliquot der Pellet in Medium. Die Verdauung ist abgeschlossen, wenn die mikroskopische Untersuchung Klumpen von Zellen (Organoide) mit glatten erscheinenden duktalen, alveoläre oder duktale-alveolären Strukturen frei von angeschlossenen Stroma (Abbildung 1A) zeigt. Reduction mammoplasty Gewebe wird in der Regel noch zeigen angeschlossenen Stroma nach einer nächtlichen Verdauung und zusätzliche Verdauung Zeit erfordern. <ol class="lalpha"><li> Resuspendieren des Pellets in unvollständig verdaut frischem Gewebe Verdauungsansatz und Wiederverwendung inkubieren unter Rotation bei 37 ° C für eine weitere Stunde 4-12. Wiederholen Sie die Schritte 1,6 und 1,7. Wenn Verdauung noch unvollständigem erneut hinzuzufügen Verdauungsansatz dem Pellet und Wiederverwendung inkubieren unter Rotation bei 37 ° C über Nacht. Die Konzentration der Enzyme kann reduziert over-Verdau über Nacht zu verhindern. </li></ol></li><li> Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, Zentrifugenröhrchen bei 600 xg für 5 min absaugen DigestIonen-Mix, Pellet erneut in Medium plus Antibiotika bei etwa 15 ml/50 ml Tube, 5 ml/15 ml Tube. </li></ol> 2. Filtration und Einfrieren von verdaute Material <ol><li> Übertragen Aliquots des resuspendierten Pellets auf eine sterile 100 um Sieb über einer sterilen 50-ml-Tube. Lassen des Mediums Drain in das Rohr, so Rewash die Organoiden auf 1-2x mal mit 2-3 ml Medium. Wiederholen, bis alle der resuspendierten Pellets übertragen wurde. Wenn es zu viele Organoide auf dem Filter und das Medium verbraucht nicht mehr einfach sind, verwenden Sie einen neuen Filter (s) für die restliche Material. Drehen Sie das Filter (s) auf einem anderen sterilen Röhrchen und waschen Sie die Organoide in das Rohr mit Medium. Dies ist der 100 um organoide Pool. </li><li> Nehmen Sie das Material, das in den ursprünglichen 50 ml Tube abgelassen und wiederholen Sie den Vorgang von 2,1 mit einem 40 um Sieb, um die 40 um organoide Pool, die meist alveolären Strukturen enthält erhalten. Das Material, das in th abgelassene Rohr bildet den Filtrat Pool, der einzelne / kleinen Klumpen von mesenchymalen und Epithelzellen und kleine Stücke von dem Gefäßsystem enthält. </li><li> Pellet die 100 um, 40 um und Filtrat Pools bei 600 xg für 5 min. </li><li> Überstand rekonstituieren jedes Röhrchen in CPM II (DME/F-12 oder gleichwertig mit 44% FCS und 6% DMSO) mit etwa 1 ml CPMII pro 0,1 ml verpackt Pellet. Halten bei 4 ° C. </li><li> Samen einer Testschale für die 2 organoiden Pools indem 0,1 ml der resuspendierten Materials in eine 35 mm-Gewebekulturschalen Plastikschale tropfenweise wie in 3.2. Das Filtrat Pool kann direkt auf Gewebekulturkunststoff werden mit Fibroblasten-Medium (DME/F-12 oder gleichwertig mit 10 ug / ml Insulin und 10% FBS) ausgesät. </li><li> Aliquot der verbleibende resuspendierten Materials in Nunc Typ Einfrieren Ampullen (1 ml / 2 ml Ampulle). Einfrieren über Nacht bei -80 ° C und dann übertragen umgehend Lagerung in flüssigem Stickstoff. Wir haben keine signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit beobachtetin unserem ursprünglichen Ampullen gelagert seit den späten 1970er Jahren eingefroren. </li></ol> 3. Seeding Gefrorene Organoide und Subculture of Primary Kulturen <ol><li> Schnell auftauen das gefrorene Ampulle enthält die Organoiden in einem 37 ° C warmen Wasserbad. Saatgut den Organoiden in 2 bis 10 (in der Regel ~ 6) 60 mm-Schalen, oder 1-3 100 mm-Schalen in Abhängigkeit von visuellen Schätzung der Anzahl der in der Ampulle Organoiden. Etwa 20-40 Organoide pro 60 mm-Schale ausgesät ist optimal. </li><li> Aufgetaut Organoiden sorgfältig platziert, tropfenweise auf die Schale Oberfläche mit einer 1 ml Pipette oder Pasteurpipette für eine gleichmäßige Verteilung der Organoiden. Organoiden angeordnet dicht beieinander wird wenig Platz für Auswachsen haben, was zu weniger Zellen für die Subkultur oder Einfrieren. Vermeiden Sie ein Verkratzen der Schale Oberfläche (Zellen neigen nicht zu vergangenen verkratzte Oberflächen wachsen). Warten 1-2 min, damit die Organoide zu befestigen und dann langsam Wachstumsmedium zu vermeiden verdrängen die Organoide (zB 2-3 ml/60 mm-Schale). Ichncubate bei 37 ° C in CO 2 befeuchteten Inkubator. Dies sind die primären Kulturen. Wir verwenden derzeit M87A + Oxytocin (X) Medium für die robustesten HMEC Wachstum (Abbildung 2). </li><li> Nach 1 Tag überprüfen, ob die Organoide angebracht sind. Fügen Sie zusätzliche Medium (zB 2-3 ml/60 mm-Schale). Zellmigration aus den Organellen sichtbar sein soll, indem 24-48 h und mitotischen Auswachsen von 48-72 Stunden nach der Aussaat (Abbildung 1B, C). Manchmal Anlage ist nach 24 Stunden schlecht, besonders wenn Ausplattieren overdigested Organoide oder Organoide von älteren Frauen, aber die meisten Präparate werden innerhalb von 72 Stunden zu befestigen. Kleine Stücke von dem Gefäßsystem kann befestigen und verursachen Fibroblastenzelle Auswuchs (1D). </li><li> Führen Kulturen mindestens 3 mal pro Woche. Zellen in M87A-type Medien gezüchtet wachsen in der Nähe Zusammenfluss innerhalb von 5-8 Tagen, je nach Dichte der Aussaat. </li><li> Wenn eine erhebliche Fibroblastenwachstumsfaktor, Differential Trypsinisierung (DT), bezogen auf dierasche Ablösung von Fibroblasten von der Oberfläche aus Kunststoff, benötigt wird, um die Fibroblasten zu entfernen. Wenn die epithelialen Patches groß, absaugen Medien, waschen Teller (zB 1-2 ml/60 mm-Schale) sich mit STE (Kochsalzlösung, 0,05% Trypsin, 0,02% EDTA), absaugen, mit frischem 0,5 ml STE und bei Raumtemperatur zu verlassen für ca. 1 min mit kontinuierlicher mikroskopischer Beobachtung. Wenn die Fibroblasten, sondern lösen die Epithelzellen sind noch anhaftenden, sanft, aber stark klopfen die Seite der Schale gegen eine harte Oberfläche, um die Fibroblasten zu vertreiben und dann schnell anzusaugen. Waschen Sie einmal mit PBS und saugen wieder. Kulturen stark mit Fibroblasten kontaminiert sein benötigen Sie einen zusätzlichen DT. </li><li> Subculture primären Kulturen, wenn große epitheliale Patches vorhanden sind, aber bevor Zusammenfluss. Die Dichte von organoiden Aussaat und Anlage beeinflussen die erforderliche Zeit. Um die primäre Kultur zu erhalten und mehrere sekundäre Kulturen, zeitlich beabstandet zu erzeugen, führen wir Partielle Trypsinizations (PT). </li><li> Aspirate Medien, waschen ein 60 mm-Schale mit 1-2 ml STE, 0,5 ml frische STE austeilen. Beobachten Zellablösung unter dem Mikroskop bei Raumtemperatur 1-5 min, unter leichtem Klopfen der Schale zu Zellablösung fördern. Trypsinisierung sollte gestoppt, wenn ~ 50% der Zellen wurden abgenommen werden. Frühe PTs haben in der Regel eine schnelle Zellablösung. Für spätere PTs können Zellen bei 37 ° C für eine schnellere Ablösung platziert werden, unter sorgfältiger Überwachung, wie alle Zellen kommen können schnell ab. </li><li> 2 ml Serum-haltigen Medien in die Schale, um repipette waschen, und übertragen in ein steriles 15 ml-Tube. Wiederholen 2x mit weiteren ~ 1-2 ml Medium, Zugabe der Wäsche, um das Rohr. Refeed die primäre Gericht und zum Inkubator. Zählen der Zellen, die in dem Rohr mit der Hämozytometer. Einmal subkultiviert, sind Zellen, no lo; PTs kann um 4 bis 8 mal mit guten Zellerneuerung in den primären Gerichte und eine entsprechende langfristige Wachstum aus den subkultiviert oder gefroren Secondaries (zweiten Durchgang Zellen werden als Secondaries wiederholt werdennger Vorwahlen). Sobald organoide Material nicht mehr in den primären Kulturen zeigen subkultiviert secondaries einen Rückgang der langfristigen Verdopplung der Population Potenzial. </li><li><ol class="lalpha"><li> Für eine Subkultur auf Secondaries, Samenzellen direkt aus der Tube in die Gerichte. Impfen von 1-2 x 10 5 Zellen/100 mm Schale in einem robusten Medium wie M87A + X wird zur Konfluenz von 4-7 Tagen führen. Fügen wir Choleratoxin zu dem Medium in zweiter Durchgang zur proliferative Potenzial zu erhöhen; Choleratoxin in Primärkultur weggelassen, weil sie zu mehrlagigen Zelle Auswachsen führt von den Organoiden. </li><li> Zum Einfrieren als Secondaries, Pellet Rohr bei 600 xg für 5 min, und resuspendieren in CPMII mit einer Enddichte von 10 6 Zellen / ml. Aliquot resuspendiert Zellen in Nunc Typ Gefrierpunkt Ampullen, frieren über Nacht bei -80 ° C und dann zeitnah zu übertragen Lagerung in flüssigem Stickstoff. </li></ol></li><li> Es wird empfohlen, um Zellen von der ersten zur Aufbewahrung PT einzufrieren, undVerwenden von Zellen aus der zweiten PT für Subkultur. Zusätzliche Terminals können eingefroren gelagert für den zukünftigen Gebrauch werden. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der menschliche Brustgewebe Verarbeitung hier vorgestellte Verfahren ermöglicht Gewinnung reiner Brustepithelzellen aus dem heterogenen Gemisch von Zelltypen in der menschlichen Brust. Filtration durch Poren von fester Größe ermöglicht eine Trennung von verschiedenen Fraktionen der Brustdrüse (zB duktale und duktalen-alveolären vs alveolären) aus dem aufgeschlossenen Stromazellen Matrix. Isogenen Mamma Fibroblasten erhalten, um die Epithelzellen angepasst werden. Gefrorene verdaute Material hat gute Lebensfähigkeit seit über 30 Jahren beibehalten. Diese Methode wurde erfolgreich auf alle, aber sehr faserig Mamma Gewebe gearbeitet und ist einfach durchzuführen. Andere Varianten des Brustgewebes Verarbeitung existieren, bieten keinen epithelialen Fraktionen, die als lebensfähig, sauber, oder getrennt sind. Platzierung verarbeitet Organoide in Kultur mit geringer Beanspruchung induzierenden Medien wie M87A ermöglicht langfristiges Wachstum des HMEC mit mehreren Linie Marker. HMEC die auf Kunststoff kultiviert wurden noch die Fähigkeit beibehalten Gattungente 3D-Strukturen mit normalen in vivo-ähnlichen Linie Beziehungen. Diese HMEC Kulturen eignen sich für umfangreiche experimentelle Untersuchung, einschließlich hoher Durchsatz, der normalen HMEC Verhalten und Faktoren, die zu treiben oder zu hemmen Seneszenz und Transformation kann.

<table border="1"><tbody><tr><td> Glass Petrischale 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Schere 6,5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Pinzetten 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Skalpelle Einweg </td><td> Miltex </td><td> 4-411 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / Streptomycin </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymyxin B-Sulfat </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Zellsieb 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Zellsieb 40 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Tubes 15 ml </td><td> Greiner bio-one </td><td> 188-261 </td></tr><tr><td> Tubes 50 ml </td><td> Greiner bio-one </td><td> 227-261 </td></tr><tr><td> TC Gerichte 10 cm </td><td> Greiner bio-one </td><td> 664-160 </td></tr><tr><td> TC Gerichten 6 cm </td><td> Greiner bio-one </td><td> 628-160 </td></tr><tr><td> Kryoröhrchen </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Scientific </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf Modell </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

verarbeitung von human reduction mammoplastik und mastektomie gewebe für die zellkultur

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimentelle Untersuchung der normalen humanen Mamma Epithelzelle (HMEC) Verhalten und wie normale Zellen zu erwerben abnormale Eigenschaften können durch in-vitro-Kultur-Systemen erleichtert werden, die genauer in vivo Modell Biologie. Verwendung von menschlichem gewonnenes Material zur Untersuchung zellulärer Differenzierung ist Alterung, Seneszenz, und Immortalisierung besonders vorteilhaft angesichts der vielen signifikanten Unterschiede in diesen molekularen Eigenschaften zwischen menschlichen und üblicherweise verwendet Nagerzellen 1-2. Mammazellen stellen eine bequeme Modellsystem, da große Mengen von normalen und abnormalen Geweben verfügbar sind aufgrund der Häufigkeit der Reduktion mammoplasty und Mastektomie Operationen. Die Brustdrüse besteht aus einer komplexen Mischung von vielen verschiedenen Zelltypen, z. B. Epithel, adipöses, mesenchymalen, Endothelzellen. Die Epithelzellen sind verantwortlich für die differenzierte Mamma Funktion der Laktationund auch der Ursprung der überwiegenden Mehrheit der menschlichen Brustkrebs. Wir haben Methoden entwickelt, um Brustdrüse chirurgischen discard Gewebe in reinen epithelialen Komponenten sowie mesenchymale Zellen 3 verarbeiten. Das verarbeitete Material kann eingefroren unbegrenzt, oder initiiert in Primärkultur. Chirurgische discard Material ins Labor transportiert und manuell seziert, um für epitheliale enthaltendem Gewebe anzureichern. Nachfolgende Verdauung des sezierten Gewebes mit Kollagenase und Hyaluronidase Streifen Stromatumoren Material aus den Epithelien an der Basalmembran. Die erhaltenen kleinen Stücke der epithelialen Baum (Organoiden) kann aus dem aufgeschlossenen Stroma durch sequentielle Filtration an Membranen von festen Porengröße abgetrennt werden. Je nach Porengröße kann erhaltenen Fraktionen aus größeren duktalen / alveoläre Stücke, kleinere alveolaren Cluster oder Stromazellen werden. Wir haben überdurchschnittliches Wachstum beobachten, wenn Kulturen Organoide sind nicht als dis initiiertsociated Einzelzellen. Platzierung von Organoide in Kultur mit Low-Stress induzierenden Medien unterstützt das langfristige Wachstum von normalen HMEC mit Markern der Multiple Lineage Typen (myoepithelialen, luminale, Vorläuferzellen) 4-5. Eine ausreichende Anzahl von Zellen von einem individuellen Gewebe erhalten werden umfangreiche experimentelle Untersuchungen über standardisierte Zellansätzen sowie Abfragesignals unter Verwendung von Hochdurchsatz Modalitäten ermöglichen. Cultured HMEC haben in einer Vielzahl von Studien, die die normalen Vorgänge, die Wachstum, Differenzierung, Altern und Seneszenz, und wie diese normalen Prozesse während unsterblich und malignen Transformation 4-15,16 verändert eingesetzt. Die Wirkungen von Wachstum in Gegenwart von extrazellulärem Matrixmaterial anderen Zelltypen und / oder 3D-Kultur kann mit Wachstums auf Kunststoff 5,15 verglichen werden. Cultured HMEC, beginnend mit normalen Zellen, bieten eine experimentell handhabbar System Faktoren, die zu untersuchenkann zu treiben oder zu verhindern menschlichen Alterung und Krebsentstehung.

Repräsentative Zahlen für Gewebe angemessen zu Organoide verdaut und in Kultur sind in Abbildung 1 dargestellt. Unvollständig verdaute Gewebe zeigen Material noch an der Außenseite des diesen Strukturen befestigt, und wird wahrscheinlich eine gewisse fibroblastische Zellwachstum in Primärkultur, erfordern DT zu entfernen. Overdigested Gewebe wird weniger glatte Außengrenzen und kann länger dauern, bis in Primärkultur befestigen. Epithelialen Auswachsen sollte innerhalb von 48-72 h (1B, C) ​​zu beginnen. Kleine Stücke von Gefäßsystem (1D) eine Quelle von Mesenchymzelle Auswachsen sein. Epithelial Auswüchse zeigen morphologisch heterogene Populationen mit proliferative Populationen, die Mischungen von Zellen enthalten, mit Marker mit myoepithelialen, Vorläuferzellen und luminalen Linien (1E, 3C-E) verbunden. Das Wachstum im niedrigen Spannungen Medien wie M87A mit Cholera-Toxin und Oxytocin ergänzt wird unterstützt langfristig überdurchschnittlicheWachstum von normalen pre-Stasis HMEC zur vorherigen Medien Formulierungen (Abbildung 2). M87A-Typ Medien wird auch das Wachstum von luminalen und Vorläuferzellen durch Durchgänge 4-8 (3C-E, 4), danach zeigen die meisten Zellen nur Myoepithelzellen Abstammungslinie Marker. HMEC auf Kunststoff kultiviert werden, behalten ihre Fähigkeit zur korrekten 3D Selbstorganisation in mikrostrukturierten 3D Mikrowells bilden, mit luminalen Zellen Innenraum zu Myoepithelzellen (4A, B), und um organisierte Strukturen bilden, wenn in Matrigel (4C, D) ausplattiert. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. HMEC Organoide und Primärkultur. (A) Organoide zeigt duktalen-Wabenstruktur nach der Verdauung und Filtration. (B, C) Organoide zeigt duktalen und Wabenstruktur 2 Tage nach der Platzierung in der primären Kultur; beachten Sie den Beginn Zelle outgrowth (weiße Pfeile). (D) kleine Blutgefäß und mit Start-Fibroblasten Auswachsen von gleichen Kulturen wie B, C. befestigt (E) Epithelzellen Auswuchs aus primären organoiden Kultur nach 4 Tagen. Abstammungslinien sind durch Färbung mit Antikörpern gegen K14 (rot) und K19 (grün) identifiziert; Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Luminal (K14-/K19 +, grün), myoepithelialen (K14 + / K19-, rot), und Vorläuferzellen (K14 + / K19 +, gelb) sind Zellen sichtbar. Ungefärbten Zellen in organoiden Kern aufgrund unvollständiger Antikörpers Eindringen beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Wachstum von HMEC Kulturen in verschiedenen Medien Formulierungen. Organoide von einem Individuum, Probe 184, gewonnen wurden in Primärkultur mit verschiedenen Medien Formulierungen eingeleitet. Beste langfristiges Wachstum wird unter Verwendung unserer jüngsten Formulierung, M87A + Oxytocin (X) 4. Dieses Medium unterstützt auchWachstum von mehreren HMEC Linien (siehe Abb. 1E). Eine frühere Medienformulierung, MM 3 vorgesehen weniger robustes Wachstum, während ein Serum-freie Medien, MCDB170 (Handelsprodukt MEGM) 17 führt eine schnelle Induktion des Cyclin-Kinase-Inhibitor p16 INK4a und Selektion für aberrante Zellen 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Abbildung 3. Vergleich der Erblinie Vielfalt in uncultured Organoide und kultivierten HMEC bei 4 th Passage. (A, B) FACS-Analyse von einem ungebildeten, enzymatisch gespalten organoide für (A) Expression von EpCAM und CD49f/alpha 6-Integrin, und (B) CD227/Muc1 und CD10/CALLA. (C, D) FACS-Analyse von 4 th Durchgang pre-Stasis HMEC zur Expression von (C) und EpCAM CD49f/alpha 6 Integrin, und (D) und CD227/Muc1 CD10/CALLA. Erkennbare populations als LEP (Ausdruck luminalen Marker EPCAM oder CD227), MdEP (Ausdruck myoepithelialen Marker CD49f oder CD10) oder PROG (angereichert in der CD49f + / EPCAM + Bevölkerung) beschriftet. Beachten Sie, dass während der Anpassung an Kultur Regulierung von EpCAM und CD49f Änderungen uncultured Organoide verglichen. (E) Unsorted HMEC und FACS-angereicherten LEP und MEP bei 4 th Durchgang für Immunfluoreszenzanalyse von Keratin K14 (MEP Marker) und K19 (LEP Marker) zur Linie Identifizierung überprüfen gefärbt. Zellkerne mit DAPI blau erscheinen. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Abbildung 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Abbildung 4. Cultured HMEC der Lage sind, organisierte Strukturen mit in vivo-ähnlichen Linie Beziehungen, wenn in geeigneten Mikroumgebungen gelegt. (A) Pre-Stasis 4 th Durchgang HMEC wurden FACS-angereicherten into luminalen LEP und Myoepithelzellen MEP Abstammungslinien unter Verwendung von Markern für CD227 und CD10, mit diesen Linien durch Expression von K14 und K19 verifiziert (nicht dargestellt). (B) Wenn sie zusammen in mikrostrukturierten Vertiefungen gemischt wurden die kultivierten Zellen in der Lage Selbstorganisation zu Doppelschichten mit MEP auf der Außenseite und LEP internen [aus Chanson et al angepasst. 5]. Fluoreszenzmarkierten LEP (grün) und MEP (rot) wurden mit einem konfokalen Mikroskop bei 0 h, 24 h und 48 h nach Zugabe der Kavitäten (oben) abgebildet. Steuerung HMEC wurden willkürlich mit roten oder grünen fluoreszierenden Markierungen (unten) bezeichnet. (C) Hellfeld Bild von FACS-angereicherte Progenitorzellen (cKit +) ausplattiert in 3D (Matrigel) Kultur gewachsen und für 18 Tage. Resultierenden Strukturen aufweisen können alveolären Morphogenese. (D) Die Strukturen wurden von Matrigel extrahiert und gefärbt, um K14 und K19 zu erkennen; Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Immunfluoreszenz Analyse zeigt, organisierte Strukturen mit der richtigen luminalen und basalen polaheit.

Ein Verfahren für die menschliche Brust OP discard Material verarbeiten beschrieben. Verarbeiteten Gewebe, in Form von Organoiden kann unbegrenzt gelagert oder eingefroren platziert in Kultur für langfristige Wachstum werden. Dieses Verfahren ermöglicht die experimentelle Überprüfung der normalen humanen epithelialen Zellbiologie, und die Wirkungen von exogen Störungen.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die epithelialen Teile der Brustdrüse frei von assoziierten Bruststromazellen zu isolieren. Beginnen Sie mit der aufgelaufenen Dissektion des chirurgischen Verwerfungsmaterials, um es mit enzymatischem Verdau für epitheliale Strukturen anzureichern. Trennen Sie die epithelialen Organoide vom stromalen Material außerhalb der Basalmembran.Anschließend werden die verdauten Organoide durch Zellsiebe mit fester Porengröße verarbeitet, um angereicherte Fraktionen zu erhalten. Säen Sie die Organoide für die sofortige Kultur aus oder frieren Sie die Bestände für die zukünftige Verwendung ein. Letztendlich werden die epithelialen Organoide verwendet, um Langzeitkulturen von normalen menschlichen Brustepithelzellen zu erzeugen.Ich habe diese Methode erstmals in den späten 1970er Jahren entwickelt, um das Gebiet der menschlichen Epithelzellbiologie und der Karzinogenese voranzutreiben. Es stand reichlich chirurgisches Entwurfmaterial aus normalem menschlichem Gedächtnisgewebe zur Verfügung. Gefragt war eine Methode, um dieses heterogene Massenmaterial so zu verarbeiten, dass es für reine Epithelzellkulturen und -medien geeignet ist, um ein langfristiges Wachstum zu unterstützen.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, insbesondere um zu notieren, wie man das grobe Sezieren durchführt. Wie sehen richtig verdaute Organoide aus? Filtern der Organoide und Plattieren der Organoide für die Kultur.Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie saubere Epithelfraktionen liefert, da das Stroma intakt bleibt und die Epithelzellen intakt bleiben. Organoide, die wir gefunden haben, sorgen für das beste Anfangswachstum und maximieren die Anzahl der Zellen, die gewonnen werden können. Zwei Wissenschaftler des Lawrence Berkeley National Laboratory, James Garvey und Mark LeBarge, werden nun dieses Verfahren aus dem weggeworfenen Material chirurgischer Eingriffe demonstrieren.Humanes Brustgewebe in sterilen Behältern erhalten, die Puffer oder vollständiges Medium plus Antibiotika bei vier Grad Celsius enthalten. Schneiden Sie Stücke des Taschentuchs ab und legen Sie sie in eine große sterile Glasschale. Trennen Sie die Epithelbereiche von der Stromamatrix aus Fettgewebe, Bindegewebe und Blutgefäßen.Präparieren Sie vorsichtig die weißen Stränge der Epithelbereiche, die in die gelbere Stromamatrix eingebettet sind. Halten Sie das Material mit einer Pinzette fest und kratzen Sie das grob verfettete Material mit einem Skalpell ab. Schneiden Sie dann mit gegenüberliegenden Skalpellen das Epithelgewebe in etwa vier Millimeter große Stücke, um die Verdauung zu erleichtern.Übertragen Sie das präparierte Epithelgewebe in ein konisches Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 50 oder 15 Millilitern In stark fibrösem Gewebe. Es wird mehr festes weißes, nicht-epitheliales Material geben. Wenn es schwierig ist, die Epithelzellen aus solchen fibrösen Matrizen herauszuzerlegen.Das Gewebe kann in ein bis drei Millimeter große quadratische Stücke geschnitten und separat verdaut werden. Füllen Sie das Röhrchen mit dem Aufschlussmedium, das rohe Kollagenase und hohe hohe Tage enthält, und lassen Sie einen kleinen Luftraum frei, um das Mischen während der Rotation zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem 360-Grad-Rotator bei acht U/min Nach dem Aufschluss.Die Proben werden durch Zentrifugation von 600 g fünf Minuten lang pelletiert. Entsorgen Sie das überstehende Fett und das Medium gemäß den institutionellen Richtlinien für die Entsorgung von menschlichem Gewebe. Um die Gewebeverdauung zu überwachen, verdünnt man ein kleines Eloqua des Pellets in Medium und untersucht mikroskopisch in vollständig verdauten Organoiden, um anhaftendes Stroma zu zeigen.Wiederholen Sie den enzymatischen Aufschluss, bis das Gewebe vollständig zu reinen Organoiden verdaut ist. Wenn eine zweite Verdauung über Nacht erforderlich ist, muss die Konzentration der Enzyme möglicherweise reduziert werden, um eine Überverdauung zu verhindern. Richtig verdaute Organoide zeigen glatt erscheinende duktale alveoläre oder duktale Alveolarstrukturen, die frei von anhaftendem Stroma sind.Wenn die Verdauung abgeschlossen ist, wird das endgültige Pellet durch die Wiederbelebung in mittelgroßen Antibiotika suspendiert. Die aufgeschlossene Probe wird in Behältern durch ein steriles 100-Mikron-Sieb über ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen geleitet. Nachdem das Medium in die Röhre abgeflossen ist, waschen Sie die Organoide mit drei Millilitern Medium.Wiederholen Sie den Vorgang, bis das gesamte resuspendierte Pellet übertragen wurde. Drehen Sie dann den Filter vorsichtig über ein steriles Röhrchen und waschen Sie die Organoide mit mehr Medium in das Röhrchen. Dies ist der 100-Mikron-Organoid-Pool.Führen Sie nun das Material, das in das ursprüngliche 50-Milliliter-Röhrchen abgeflossen ist, durch ein 40-Mikron-Sieb, um die Alveolarstrukturen vom Filtratpool aus Einzelzellen und kleinen Klumpen von mesenchymalen und epithelialen Zellen und kleinen Stücken Gefäßgewebe zu trennen. Zentrifugieren Sie die 100-Mikron-, 40-Mikron- und Filtrat-Pools fünf Minuten lang bei 600 g. Rekonstituieren Sie jede Probe mit einem Milliliter ccpm.Zwei Gefrierlösungen pro 0,1 Milliliter gepacktem Gaumen. Bei vier Grad Celsius halten. Setzen Sie vorsichtig 0,1 Milliliter von jedem der beiden Organoid-Pools ein.Tropfen für Tropfen in gleichmäßiger Verteilung auf ein oder 2 35-Millimeter-Schalen. Vermeiden Sie es, die Oberfläche der Schale nach einigen Minuten zu zerkratzen, nachdem sich die Organoide festgesetzt haben. Fügen Sie Wachstumsmedien langsam hinzu, um ein Verdrängen der Organoide zu vermeiden.Anschließend inkubieren Sie die Primärkulturen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten CO2-Inkubator. Säen Sie auch 0,1 Milliliter des Filtratpools direkt auf Gewebekulturkunststoff mit Fibroblastenmedium. Inkubieren Sie die Primärkulturen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten CO2-Inkubator.Nach 24 bis 48 Stunden ist die Zellmigration aus den Organoiden zu überprüfen und nach zwei bis drei Tagen die mitotische Wachstumskultur zu überwachen. Die Zellen nähern sich dem Zusammenfluss und füllen das Medium alle zwei bis drei Tage wieder auf. Kleine Stücke des Gefäßsystems können sich anheften und zum Wachstum von Fibroblastenzellen führen.Bei signifikantem Fibroblastenwachstum. Führen Sie eine differentielle Trippinisierung durch, um die Fibroblasten aus den großen Epithelpflastern zu entfernen. Waschen Sie die Zellen einmal in STE-Puffer.Fügen Sie dann frische 0,5 Milliliter STE hinzu, um das Gericht mit kontinuierlicher mikroskopischer Beobachtung und sanften, aber scharfen Stößen des Gerichts auf eine harte Oberfläche zu bedecken. Achten Sie auf eine Ablösung der Fibroblasten, während die Epithelzellen noch adhärenten Durchgang haben. Die Primärkulturen, wenn sich die Flecken des Epithelauswuchses dem Zusammenfluss nähern.Um die Primärkultur beizubehalten und mehrere Sekundärkulturen zu erzeugen, verwenden Sie partielles Trypsin. Waschen Sie die Zellen einmal in STE-Puffer und fügen Sie dann frisches STE hinzu, um das Gericht nur abzudecken. Überwachen Sie, dass sich etwa 50 % der Zellen abgelöst haben.Fügen Sie dann zwei Milliliter Serum mit Wachstumsmedium hinzu und ernten Sie die Zellen. Übertragen Sie die Zellen dann nach zwei Wäschen in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Poolieren Sie die geernteten Zellen und die Kultur Die Partialisierung kann etwa vier- bis achtmal wiederholt werden, wobei die Zellen aus den Primärschalen gut nachwachsen und aus der Subkultur oder den gefrorenen Sekundärzellen mit entsprechendem Langzeitwachstum wachsen.Wir empfehlen, die Zellen aus der ersten partiellen Trypsinisierung zur sicheren Aufbewahrung einzufrieren und Zellen aus dem zweiten PT für die Subkultur zu verwenden. Wenn das Gewebe entsprechend verdaut und filtriert wird, sind Organoide mit duktalen und alveolären Strukturen mit glatten Kanten ohne anhaftendes Stroma zu sehen. Wenn es zu wenig verdaut wird, wird Material anhaftend und es kommt zu mehr Fibroblastenkontamination, wenn es überdaut wird, werden die Ränder rau und die Bindung ist nach der Organoid-Bindung weniger effizient.Das Auswachsen des Epithels beginnt innerhalb von 48 bis 72 Stunden bei 48 Stunden. Es gibt noch keine aktive Zellteilung mit sichtbarer Mitose nach 72 Stunden. Die Mitose soll sichtbarer werden.Kleine Gefäßstücke können nach vier Tagen eine Ursache für das Auswachsen von mesenchymalen Zellen sein. Epithelauswüchse weisen morphologisch heterogene Populationen auf, wobei die Färbung mit Antikörpern gegen Keratin 14 und Keratin 19 die grünen K 19 positiven luminalen und rot K 14 positiven myoepithelialen Linien sowie die gelben K 14 positiven K 19 positiven Vorläuferzellen markiert. HMEC kann in verschiedenen Medienformulierungen kultiviert werden.Low-Stress-Medien wie M 87 a, ergänzt mit Choleratoxin und Oxytocin, unterstützen ein überlegenes langfristiges Wachstum von normaler Prästasis-HMEC sowie das Wachstum mehrerer HMEC-Linien. Die Ergebnisse der Faktenanalyse verdeutlichen die Abstammungsvielfalt in den unkultivierten Organoiden und in der vierten Passage, HMEC, kultiviert in M 87, A-Medium. Hier werden die luminalen und myoepithelialen Populationen durch Expression der luminalen Marker, EPCA und CD 2 27 und der myoepithelialen Marker CD 49 F und CD 10 replatiert, identifiziert.Vierte Passage, HMEC. Fakten, die für die vorherigen luminalen und myoepithelialen Marker angereichert wurden, wurden durch Immunfluoreszenzanalysen für Keratin K 14 und K 19 HMEC bestätigt. Auf Kunststoff kultiviert, sind Passage vier in der Lage, organisierte Strukturen mit in vivo ähnlichen Abstammungsbeziehungen von luminalen und myoepithelialen Zellen zu bilden, wenn sie in geeignete CD 2 27 und CD 10 platziert werden, um für diese beiden Linien anzureichern.HMCs behalten ihre Fähigkeit, eine korrekte 3D-Zellorganisation in mikrostrukturierten 3D-Mikrowells mit luminalen Zellen im Inneren der Myoepithelzellen zu bilden. Mit Fakten angereicherte Vorläuferzellen können auch robuste 3D-Strukturen bilden, wenn sie mit Matrigel plattiert werden, das duktuläre und alveoläre Strukturen nachahmt. Die 3D-Strukturen in Matrigel weisen auch eine korrekte 3D-Selbstorganisation auf.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die epithelialen Teile der Brustdrüse von dem damit verbundenen Bruststroma befreien können. Einmal gemeistert, kann diese Technik im Laufe von zwei bis drei Tagen durchgeführt werden. Die Technik der Gewebeaufbereitung ist im Allgemeinen einfach.Es ist wichtig, daran zu denken, die Verdauung an der richtigen Stelle zu stoppen.

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