Name: Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Analyse der Schwann-Zell-Entwicklung entlang wachsender Axone in ihrer natürlichen Umgebung. Diese Methode nutzt Kollagenmatrizen und NGF zur Untersuchung der Zellmigration in vitro.

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Wir wollen Urmas Arumae für die Freigabe eines Kollagen-Protokoll und Jutta Fey und Ursula Hinz für hervorragende technische Unterstützung danken. Darüber hinaus wollen wir Christian F. Ackermann, Ulrike Engel und das Nikon Imaging Center an der Universität Heidelberg und auch Joachim Kirsch für die freundliche für das Video shoting helfen, danken. Die Arbeit wurde teilweise durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592) gefördert.

Ein. Herstellung von Kollagen Gels <ol><li> Bereiten Sie eine Aktie Medium, enthaltend 455 ul 10x MEM, 112 ul 7,5% NaHCO 3, 50 ul Glutamin und NaOH. Die Konzentration und die Menge der NaOH hängt vom Rattenschwanz Kollagenzubereitung (siehe 1.2), das Endvolumen des Mediums, das Lager 1000 ul. </li><li> Planen Rattenschwanz Kollagen nach Ebendal (1). Bewahren Sie die Collagen-Lösung bei 4 ° C. Ein Abbau der Kollagen-Lösung konnte nicht beobachtet werden. Nach der Vorbereitung einer neuen Charge, schätzen die NaOH-Konzentration für die Aktie Medium benötigt (siehe 1.1). Verwenden des pH-Indikators des Mediums zur Titration der Menge und Konzentration der NaOH. 800 ul sauren Rattenschwanz Kollagen muss ein Schatten von rot färben, wenn sie mit 210 ul der Aktie Medium vermischt. Wenn die Konzentration der NaOH zu niedrig ist die Kollagenlösung wird gelb aufgrund der pH-Indikator des Mediums. Fügen Sie den Kollagen zu mittel-und Mix ohne Proucing Blasen. Führen Sie diese Schritte auf dem Eis. Die Polymerisation innerhalb von 2 Stunden nach der Kollagenlösung und der Vorrat Mediums gemischt worden und die neue Lösung wird bei 37 ° C inkubiert Testen Sie dies, bevor Sie ein Experiment. 1,3) Mix 800 ul Kollagenlösung mit 210 ul auf Lager Medium (siehe 1.2). Platz 100 ul dieser Lösung in den Vertiefungen einer 8 gut Kammerobjektträgers. Inkubieren Sie die Objektträger bei 37 ° C, 5% CO 2 und feuchten Bedingungen in einem Zellkulturbrutschrank. Bereiten Sie die Kollagengelen unter einer Zellkultur Bank und sterilen Bedingungen. Das Kollagen verkleistert innerhalb von 2 Stunden. </li></ol> 2. Dissection embryonaler Standardkapitalbeihilfen <ol><li> Ernte Embryonen Zeit trächtigen Mäusen (E16-18) aus der Gebärmutter und halten sie in PBS bis auf weiteres benötigt. </li><li> Sezieren ein Embryo aus dem Amnion. Enthaupten den Embryo caudal des clavicular Ebene. Befestigen Sie den Kopf auf einem Silizium unteren Schale mit &quot;Insekten-Nadeln&quot;. Die Bauchseite des Kopfes zu Ihnen stehen eind Sie haben die Submandibulärregion sehen. Die Fixierung ermöglicht eine einfachere Vorbereitung. </li><li> Entfernen Sie die Haut des Submandibulärregion links und rechts und mit ihm die subkutane Bindegewebe. </li><li> Entfernen Sie die Glandula Speicheldrüse von ihrem Standort, um den Blick auf das Zungenbein, die infrahyoidal Muskeln und der M. sternocleidomastoideus löschen. </li><li> Entfernen Sie diese Muskeln sorgfältig, um die Sicht auf den Kehlkopf und die Luftröhre zu löschen. Entfernen Sie die Luftröhre und des Kehlkopfes. Die Halsschlagadern werden dann auf beiden Seiten sichtbar auf den prävertebralen Muskeln. Die SCG ist in der Bifurkation der Halsschlagadern und hat eine ovale Form. Entfernen Sie vorsichtig die Ganglien und legen Sie sie in PBS. Entfernen Sie die Ganglien sanft von den Dissektion Werkzeuge, wenn sie zu ihnen kleben werden. Es ist vorteilhaft, Zangen sowie ein Nadelhalter mit einem &quot;Insekt Nadel&quot; für die SCG Entfernung montiert verwenden. </li><li> Einmal in PBS, speichern die Ganglien bei Raumtemperatur in PBS, bis Sie seziert enough Ganglien. Danach reinigen Sie die Ganglien von Blutgefäßen und Bindegewebe. Durchführen der SCG Dissektion und Reinigung unter einem Präpariermikroskop unter einer laminaren Strömung Werkbank gelegt. </li><li> Schließlich stellen die explantierten Ganglien auf die gelatinierte Kollagengelen mit Hilfe Spritzennadeln auf einer Spritze zur leichteren Handhabung montiert sind. </li><li> Inkubieren Sie die SCG Explantate auf dem gelatinierte Kollagen in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 und feuchten Bedingungen. </li></ol> 3. Behandlung von SCG Explantate <ol><li> Nach 1-2 h Inkubation abdecken SCG Explantats mit Kollagen mit 100 ul Neurobasal Zellkulturmedium mit B27 Ergänzung, Glutamin und Antibiotika. Nun werden die Vertiefungen der Kammer Folien enthalten ein Volumen von 200 ul (100 ul Gel und 100 ul Medium). + 200 ul des Mediums, aber jetzt mit NGF (60 ng / ml), die axonale Wachstum zu ermöglichen. Dementsprechend die endgültige NGF-Konzentration von 30 ng / ml. </li><li><ol class="lalpha"><li> Um das Einsetzen von SC Migration zu untersuchen, zusätzliche Faktoren, die direkt am Tag in vitro 0 (DIV0). Man löst die Faktoren in der NGF enthaltenden Medium in doppelter Konzentration nötig (2). </li><li> Um die Auswirkungen auf die SCs, die bereits begonnen Migration entlang Axone analysieren, zusätzliche Faktoren DIV3 bis DIV4 (potenzielle Stopp des Experiments). Zu diesem Zweck vorsichtig 180 ul der Lösung, bei DIV3, und 200 ul neue Medium mit NGF und die zusätzlichen Faktoren von Interesse bei der doppelten Konzentration (2). </li></ol></li></ol> 4. Zeitraffer-Imaging Verwenden Sie eine inverse Mikroskop für Analysen. Verschiedene Ziele verwendet werden, Definieren des Sichtfeldes und Vergrößerung. Ein wichtiger Aspekt ist jedoch der Arbeitsabstand des verwendeten Objektivs, wie die Abbildung der SCG Explantate durch den Glasobjektträger und dem Kollagen durchgeführt wirdGel. Die Bildrate der 1/10-30 Minuten zeigten gute Ergebnisse (2). Dies hat jedoch Aspekt der wissenschaftlichen Fragestellung angepasst werden. Eine normale CCD-Kamera kann zur Bildaufnahme verwendet werden. Für Zeitablauf Abbilden einer Zellkultur Inkubationskammer muss dem Tisch des Mikroskops angebracht werden. Inkubieren des Gewebes während der Bildgebung bei 37 ° C mit 5% CO 2 und feuchten Bedingungen. Starten Sie den Inkubationssystem 1 Stunde vor Beginn der Bildgebung. Dies ermöglicht die Mikroskop-Teile (zB Ziel) einschließlich der Kammer Folie, um die Temperatur einzustellen und verhindert temperaturbedingte Drifts. Definieren spezifischen Bereichen von Analysen (innerhalb von Explantat und zwischen verschiedenen Explantaten) mit Hilfe des Mikroskops Software und einer Software-gesteuerten motorisierten Tisch (Multipositionsventil setup) zur gleichzeitigen Analysen verschiedener angewendeten Bedingungen zu den SCG Explantaten. Für Zeitraffer-Aufnahmen Wildtyp Gewebe sowie Gewebe aus transgenen Tieren verwendet werden kannMarkieren des SCs (S100b: GFP) (3). Zum Abbilden Fluorophore eine fluoreszierende Lichtquelle muss im micropscope Setup implementiert werden. Verwenden Sie Standard-Filter. 5. Quantifizierung der SC Wanderdistanzen <ol><li> Am Endpunkt (DIV4 zum Beispiel), fixieren die Kollagengelen mit 4% PFA in der Kammer Rutsche für 3-4 Stunden. Nacheinander waschen Die Kollagengelen 5 mal für 10 min mit PBS. Anwenden Standardprotokolle für Immunzytochemie (2). Wenn Sie neu in der Vorbereitung der SCG sind, überprüfen die Identität des Ganglion als sympathischen Ganglion durch Immunhistochemie gegen Tyrosin-Hydroxylase (TH) eine gemeinsame Marker für katecholaminerge Zellen. Während Immunohistochemie (nach dem primären Antikörper), übertragen die Explantat enthaltenden Kollagengelen zu 24-Well-Platten, die ein größeres Volumen, was vorteilhaft für das Waschen der Gele ist zu haben. </li><li> Nach Immunhistochemie, legen sorgfältig die Kollagengelen auf Glasträger. Vorsichtigentfernen Sie die restliche Lösung und lassen das Kollagen getrocknet / verkleinern auf zwei Dimensionen. Dies erlaubt eine einfache Messung von Entfernungen (2). Danach montieren Sie die Proben. </li><li> Schließlich messen Migration Entfernungen mit Hilfe von Fidschi (NIH) Software. Keine besonderen Plugins sind zu diesem Zweck erforderlich ist. Um korrekte Messungen in um zu ermöglichen, überprüfen Sie die korrekte Abbildung von Metadaten und die Einstellungen unter den Fidschi-, Bild-und Skala. Verwenden Fiji auch für die Quantifizierung von Zellen. </li></ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
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<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
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<li>Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+growth+factor+2%2C+a+soluble+neuregulin%2C+directly+increases+Schwann+cell+motility+and+indirectly+promotes+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).</li>
<li>Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+regulate+Schwann+cell+migration+by+activating+divergent+signaling+pathways+dependent+on+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).</li>
<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Entwicklung des peripheren Nervensystems ist ein spannender Prozess. Wenn die Entwicklung beendet ist, werden Axone von SCs entlang der gesamten Länge, die beim Menschen können, oft mehr als 100 cm betragen umhüllt. Zu diesem Zweck die richtige Anzahl der benötigten SCs muss während der Entwicklung festgelegt und die SCs müssen auch entlang bewegen erstreckt Axone an den Rand, um die vollständige axonalen Abdeckung zu gewährleisten. Dies gilt für myelinisierten sondern auch für unmeylinated Axone. In beiden Fällen k...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 10x MEM </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbikarbonat (7,5%) </td><td> Gibco </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Merck </td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Roche </td><td> 1058231 </td><td> R &amp; D # 556-NG-100 </td></tr><tr><td> Neurobasal Medium </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Gibco </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotika </td><td> Gibco </td><td> 15640 </td><td></td></tr><tr><td> d-PBS </td><td> Gibco </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> Insekten Nadeln </td><td> FST </td><td> 26002-20 </td><td></td></tr><tr><td> Spritzennadel </td><td> Braun </td><td></td><td> BD # 300013 </td></tr><tr><td> 8 gut Kammerobjektträgers </td><td> Lab tek </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse murine schwann zell entwicklung entlang wachsenden axone

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

Die Entwicklung der peripheren Nerven ist eine faszinierende Prozess. Neuronen senden Axone um spezifische Ziele, die Menschen sind oft mehr als 100 cm vom soma des Neurons innervieren. Neuronale Überleben während der Entwicklung hängt Target-Wachstumsfaktoren, sondern auch auf dem Träger von Schwann-Zellen (SCs). Zu diesem Zweck sind SC umhüllen Axone vom Bereich des neuronalen Soma (oder der Übergang von der zentralen zu peripheren Nervensystem) auf der Synapse oder neuromuskulären Verbindung. Schwann-Zellen sind Derivate des Neuralleiste und migrieren als Vorprodukte entlang austretenden Axone bis die gesamte Axons mit SCs bedeckt ist. Dies zeigt die Bedeutung der SC Migration für die Entwicklung des peripheren Nervensystems und unterstreicht die Notwendigkeit, diesen Prozess zu untersuchen. Um SC Entwicklung zu analysieren, wird ein Setup benötigt, die neben den SCs auch ihrer physiologischen Substrat für Migration, das Axon. Aufgrund intrauterine Entwicklung <em&gt; in vivo Zeitraffer-Aufnahmen, ist jedoch nicht in der Plazenta Wirbeltieren wie Maus möglich (mus musculus). Um dies zu umgehen, passten wir die Ganglion cervicale superius (SCG) Explantat-Technik. Bei der Behandlung mit nerve growth factor (NGF) SCG Explantate erweitern Axone von SC Vorstufen Migration entlang der Axone aus dem Ganglion an die Peripherie gefolgt. Der Vorteil bei diesem System ist, dass die SC aus einem Pool von endogenen SC und dass sie entlang ihrem eigenen physiologischen Axone, die zur gleichen Zeit wachsen migrieren abgeleitet sind. Dieses System ist besonders interessant, weil die SC Entwicklung entlang Axonen von Zeitraffer-Aufnahmen analysiert werden können, eröffnet weitere Möglichkeiten, Einblicke in SC Migration gewinnen.

Axonale Wachstum von SCG Explantate nach der Behandlung mit NGF (4) (Film-Schema S1 Abbildung 1 Schema) erleichtert. Dieser Vorgang ist leicht sichtbar durch jedes inversen Mikroskop und kann durch Zeitraffer-Bildgebung (Film S2) folgen. Wenn ein Wissenschaftler ist neu Sezieren SCG von Maus-Embryonen empfehlen wir eine Validierung der Technik durch eine einfache Anti-Tyrosin-Hydroxylase (TH) Immunhistochemie. TH ist eine häufige Marker für katecholaminerge Neuronen (in diesem Fall symp...

Hier beschreiben wir eine Schwann-Zellen (SC) Migration Assay, in dem SCs sind in der Lage zu entwickeln entlang erstreckt Axone.

Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

Ziel des folgenden Experiments ist es, die Entwicklung von Schwan-Zellen entlang wachsender Axone, ihrem natürlichen Lebensraum, zu analysieren. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt zunächst die oberen Zervixganglien oder S cgs von Mausembryonen auf Kollagenmatrizen aufgefüllt werden. Die S cgs werden mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) behandelt, der das axonale Wachstum der SCG-Neuronen auf koronale Weise erleichtert.Neben dem axonalen Wachstum aus dem X-Explan können endogene Schwanenzellen beobachtet werden, die entlang der verlängerten Axone in Richtung Peripherie wandern. Die Entwicklung der Schwan-Zellen kann sowohl durch Zeitraffer-Bildgebung als auch durch Endpunktanalyse des fixierten Gewebes analysiert werden, was Entfernungsmessungen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dem Scratch-Migration-Assay, besteht darin, dass der natürliche Lebensraum der Schwanenzellen in diesen Assay einbezogen wird.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Denn die korrekte Zusammenstellung der Kollagenmetriken und die korrekte Dissektion der SGs sind der Schlüssel zum Erfolg. Diese Schritte sind nicht besonders schwer zu erlernen.Sie brauchen nur zuerst Übung. Während der Arbeit in einer Gewebekultur verstand Hood unsere Bedingungen mit allen Lösungen auf Eis. Bereiten Sie das Stammkulturmedium und das Rattenschwanzkollagen gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll vor.Mischen Sie 800 Mikroliter Rattenschwanzkollagen mit 210 Mikrolitern des Stammmediums. Ohne Blasenbildung sollte die Lösung eine rote Farbe behalten. Wenn die Lösung gelb wird, ist die Ratal-Kollagenlösung zu sauer und muss mit einer größeren Konzentration von Natriumhydroxidpipette neu hergestellt werden. 100 Mikro Freisetzung der Lösung in jede Vertiefung eines Multi-Well-Objektträgers und stellen Sie sicher, dass der Boden jeder Vertiefung vollständig bedeckt ist.Stellen Sie die Schalen zwei Stunden lang in einen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Unsere Embryonen nach der Entnahme werden E 16 bis E 18 in eine Petrischale mit PBS gelegt, dann aus dem Amnion präpariert und auf Höhe des Corals des C-Schlüsselbeins geköpft. Die Kopf- und Halsregion werden dann auf eine Silikonbodenschale übertragen, und beim Blick durch ein Präpariermikroskop werden Insektennadeln verwendet, um das Gewebe in der Unterkiefer- und Schlüsselbeinregion festzunageln.Entfernen Sie nun mit einer Pinzette die Haut und das Unterhautgewebe der Unterkieferregion. Entfernen Sie dann die submandibulären Speicheldrüsen, um die Muskeln supra hyoideus, infra hial und sternocleidomastoideus freizulegen. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette vorsichtig die infraialen und sternocleidomastoiden Muskeln, um den Kehlkopf und die Luftröhre freizulegen.Fassen Sie die Luftröhre mit der Pinzette und heben Sie die Luftröhre und den Kehlkopf heraus. Nach der Entfernung des Kehlkopfes und der Luftröhre sind die Halsschlagadern sichtbar, die sich auf beiden Seiten der prävertebralen Muskeln befinden. Die Ganglien Halswirbelsäule superior befinden sich in der Bifurkation der Halsschlagadern und sind als ovale Form zu erkennen.Verwenden Sie eine Pinzette und einen Nadelhalter, der mit einer Insektennadel befestigt ist, um die oberen Gebärmutterhalsganglien zu entfernen, und legen Sie sie in eine frische Schale, die PBS enthält, und präparieren Sie dann alle Blutgefäße oder verbundenes Gewebe aus den Ganglien. Entfernen Sie mit Hilfe von Spritzennadeln die gelatinierten Kollagengele aus dem Inkubator und übertragen Sie mit Spritzennadeln, die auf Spritzen montiert sind, die Ganglien auf die Gele. Legen Sie die Explantate für ein bis zwei Stunden in den auf 37 Grad Celsius eingestellten Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und feuchten Bedingungen.Nach ein bis zwei Stunden Inkubation werden die Explantate des oberen Zervixgangliens aus dem Gewebekultur-Inkubator entnommen und 100 Mikroliter neuro-Basalmedium mit B 27-Supplement, Glutamin und Antibiotika werden zu jedem x Explan hinzugefügt. Anschließend 200 Mikroliter neuronales Basalmedium mit 60 Nanogramm pro Milliliter. NGF wird auch zu den Vertiefungen hinzugefügt, um das axonale Wachstum zu erleichtern.Zu diesem Zeitpunkt, der als Tag in vitro Null definiert ist, können auch Testsubstanzen hinzugefügt werden, um die Wirkung auf Schwanenzellen zu untersuchen, die bereits mit der Wanderung begonnen haben. Axonsubstanzen können nach drei Tagen in vitro verabreicht werden, indem 180 Mikroliter des vorhandenen Mediums entfernt und durch 200 Mikroliter Medien ersetzt werden, die die Substanz von Interesse und NGF in doppelter Endkonzentration enthalten. Die Zeitrafferbildgebung wird mit einem inversen Mikroskop durchgeführt, das eine parallele Zellkulturinkubation und eine Zeitrafferbildgebung ermöglicht, um verschiedene Testsubstanzen zu vergleichen. In einem Experiment wird eine Einstellung mit mehreren Positionen am Endpunkt des Experiments empfohlen.Nachdem Sie die Explantate drei bis vier Stunden lang mit 4 % PFA in den Kulturobjektträgern fixiert und mit PBS gewaschen haben, führen Sie die Immunhistochemie durch, um das X-Explantat zu validieren, da die SCG das Gewebe mit PBS blockieren, das 10 % normales Eselsserum und 2 % Tritton X 100 für zwei Stunden enthält. Anschließend erfolgt die Inkubation des Primärantikörpers in einer Blockierungslösung über Nacht. Am nächsten Tag nach der Inkubation des primären Antikörpers wird das X-Explan, das die Gele enthält, auf eine 24-Well-Platte übertragen, nachdem man es mit PBS gewaschen hat, zwei Stunden lang lichtgeschützt mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern inkubiert, dann mit PBS gewaschen und 10 Minuten lang mit Pappy-Lösung inkubiert hat.Nach mehrmaligem Waschen die Kollagengele mit dem X explan auf ein Mikroskop legen, Objektträger, die Objektträger trocknen und anschließend mit Kalbfleisch montieren. Verwenden Sie ein Standard-Fluoreszenzmikroskop, um Bilder für die spätere quantitative Analyse zu erhalten. Hilfreich ist es, wenn die Mikroskopsoftware in der Lage ist, Metadaten aufzuzeichnen.Die quantitative Analyse der erhaltenen Bilder kann mit der Software Fiji oder ImageJ durchgeführt werden, die kostenlos für wissenschaftliche Anwendungen verwendet werden kann. In diesem Film wird das axonale Wachstum aus einem schematischen SCGX EXPLAN über vier Tage in vitro demonstriert. Die Immunhistochemie kann am vierten Tag in vitro durchgeführt werden, um das explantierte Ganglion eindeutig zu identifizieren.Als sympathisches Ganglion kann beobachtet werden, wie Schwan-Zellen entlang des Axons wandern und sich vom Ganglion cervicalis superior in die Peripherie bewegen. Dieses Video zeigt das gleiche Migrationsmuster wie gerade in einer höheren Vergrößerung. Migrationsabstände können leicht an Proben gemessen werden, die auf Zellkerne mit DPI gegengefärbt werden, indem der Abstand zwischen den Kernen der führenden Schwan-Zellen und dem Rand des explantierten SCG an mehreren Stellen gemessen wird, wie im Schema und im Bild einer DPI-markierten NGF-behandelten Probe nach vier Tagen in vitro dargestellt.Die Kombination von Hellfeld und Fluoreszenz ermöglicht die Visualisierung von S 100 GFP-positiven Schwanenzellen und den Axonen. Schließlich zeigt dieser Film die Wanderung von Schwanzellen an der Grenze eines Ganglions cervicalis superior ex explan. Hier ist nur der Fluoreszenzkanal dargestellt, was eine einfachere Interpretation von S 100 GFP-positiven Schwanenzellen ermöglicht.Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche quantitative Analysen durchgeführt werden, wie z.B. die Quantifizierung der Zellproliferation oder die Quantifizierung der Apoptose einer Zelle. Natürlich muss die adäquate Immunhistochemie für die Endpunktanalyse durchgeführt werden oder die spezifischen transgenen Tiere müssen verwendet werden, um die Auswirkungen im lebenden Kontext zu zeigen.

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Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung von Motoneuron-Projektion und Axon Arborization in transgenen Hb9::GFP -Maus-Embryonen. Nach Immunostaining für Motoneuronen verwendeten wir Fluoreszenz lichtblattmikroskopie Bild Embryonen für anschließende Quantitative Analyse. Dieses Protokoll gilt für andere Neuron Navigation Prozesse in das zentrale Nervensystem.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Im Kokultursystem von dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen kann die Myelinisierung des peripheren Nervensystems untersucht werden. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten zur Beobachtung und Quantifizierung der peripheren Myelinisierung und zur Untersuchung der Auswirkungen von Wirkstoffen auf die Myelinscheide.

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

Während der Entwicklung der Großhirnrinde stammen Neuronen und Gliazellen aus der ventrikulären Zone, die den Ventrikel auskleidet, und wandern zur Gehirnoberfläche. Viele Gene sind an diesem Prozess beteiligt. Dieses Protokoll stellt die Technik für die Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen vor.

Zeitraffer-Bildgebung von migrierenden Neuronen und glialen Vorläuferzellen in embryonalen Hirnschnitten von Mäusen

Erfahren Sie die Analyse der Schwann-Zell-Entwicklung entlang wachsender Axone in ihrer natürlichen Umgebung. Diese Methode nutzt Kollagenmatrizen und NGF zur Untersuchung der Zellmigration in vitro.

Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone

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