Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone

Ziel des folgenden Experiments ist es, die Entwicklung von Schwan-Zellen entlang wachsender Axone, ihrem natürlichen Lebensraum, zu analysieren. Dies wird erreicht, indem in einem zweiten Schritt zunächst die oberen Zervixganglien oder S cgs von Mausembryonen auf Kollagenmatrizen aufgefüllt werden. Die S cgs werden mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) behandelt, der das axonale Wachstum der SCG-Neuronen auf koronale Weise erleichtert.

Neben dem axonalen Wachstum aus dem X-Explan können endogene Schwanenzellen beobachtet werden, die entlang der verlängerten Axone in Richtung Peripherie wandern. Die Entwicklung der Schwan-Zellen kann sowohl durch Zeitraffer-Bildgebung als auch durch Endpunktanalyse des fixierten Gewebes analysiert werden, was Entfernungsmessungen ermöglicht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dem Scratch-Migration-Assay, besteht darin, dass der natürliche Lebensraum der Schwanenzellen in diesen Assay einbezogen wird.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Denn die korrekte Zusammenstellung der Kollagenmetriken und die korrekte Dissektion der SGs sind der Schlüssel zum Erfolg. Diese Schritte sind nicht besonders schwer zu erlernen.

Sie brauchen nur zuerst Übung. Während der Arbeit in einer Gewebekultur verstand Hood unsere Bedingungen mit allen Lösungen auf Eis. Bereiten Sie das Stammkulturmedium und das Rattenschwanzkollagen gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll vor.

Mischen Sie 800 Mikroliter Rattenschwanzkollagen mit 210 Mikrolitern des Stammmediums. Ohne Blasenbildung sollte die Lösung eine rote Farbe behalten. Wenn die Lösung gelb wird, ist die Ratal-Kollagenlösung zu sauer und muss mit einer größeren Konzentration von Natriumhydroxidpipette neu hergestellt werden. 100 Mikro Freisetzung der Lösung in jede Vertiefung eines Multi-Well-Objektträgers und stellen Sie sicher, dass der Boden jeder Vertiefung vollständig bedeckt ist.

Stellen Sie die Schalen zwei Stunden lang in einen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist. Unsere Embryonen nach der Entnahme werden E 16 bis E 18 in eine Petrischale mit PBS gelegt, dann aus dem Amnion präpariert und auf Höhe des Corals des C-Schlüsselbeins geköpft. Die Kopf- und Halsregion werden dann auf eine Silikonbodenschale übertragen, und beim Blick durch ein Präpariermikroskop werden Insektennadeln verwendet, um das Gewebe in der Unterkiefer- und Schlüsselbeinregion festzunageln.

Entfernen Sie nun mit einer Pinzette die Haut und das Unterhautgewebe der Unterkieferregion. Entfernen Sie dann die submandibulären Speicheldrüsen, um die Muskeln supra hyoideus, infra hial und sternocleidomastoideus freizulegen. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette vorsichtig die infraialen und sternocleidomastoiden Muskeln, um den Kehlkopf und die Luftröhre freizulegen.

Fassen Sie die Luftröhre mit der Pinzette und heben Sie die Luftröhre und den Kehlkopf heraus. Nach der Entfernung des Kehlkopfes und der Luftröhre sind die Halsschlagadern sichtbar, die sich auf beiden Seiten der prävertebralen Muskeln befinden. Die Ganglien Halswirbelsäule superior befinden sich in der Bifurkation der Halsschlagadern und sind als ovale Form zu erkennen.

Verwenden Sie eine Pinzette und einen Nadelhalter, der mit einer Insektennadel befestigt ist, um die oberen Gebärmutterhalsganglien zu entfernen, und legen Sie sie in eine frische Schale, die PBS enthält, und präparieren Sie dann alle Blutgefäße oder verbundenes Gewebe aus den Ganglien. Entfernen Sie mit Hilfe von Spritzennadeln die gelatinierten Kollagengele aus dem Inkubator und übertragen Sie mit Spritzennadeln, die auf Spritzen montiert sind, die Ganglien auf die Gele. Legen Sie die Explantate für ein bis zwei Stunden in den auf 37 Grad Celsius eingestellten Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und feuchten Bedingungen.

Nach ein bis zwei Stunden Inkubation werden die Explantate des oberen Zervixgangliens aus dem Gewebekultur-Inkubator entnommen und 100 Mikroliter neuro-Basalmedium mit B 27-Supplement, Glutamin und Antibiotika werden zu jedem x Explan hinzugefügt. Anschließend 200 Mikroliter neuronales Basalmedium mit 60 Nanogramm pro Milliliter. NGF wird auch zu den Vertiefungen hinzugefügt, um das axonale Wachstum zu erleichtern.

Zu diesem Zeitpunkt, der als Tag in vitro Null definiert ist, können auch Testsubstanzen hinzugefügt werden, um die Wirkung auf Schwanenzellen zu untersuchen, die bereits mit der Wanderung begonnen haben. Axonsubstanzen können nach drei Tagen in vitro verabreicht werden, indem 180 Mikroliter des vorhandenen Mediums entfernt und durch 200 Mikroliter Medien ersetzt werden, die die Substanz von Interesse und NGF in doppelter Endkonzentration enthalten. Die Zeitrafferbildgebung wird mit einem inversen Mikroskop durchgeführt, das eine parallele Zellkulturinkubation und eine Zeitrafferbildgebung ermöglicht, um verschiedene Testsubstanzen zu vergleichen. In einem Experiment wird eine Einstellung mit mehreren Positionen am Endpunkt des Experiments empfohlen.

Nachdem Sie die Explantate drei bis vier Stunden lang mit 4 % PFA in den Kulturobjektträgern fixiert und mit PBS gewaschen haben, führen Sie die Immunhistochemie durch, um das X-Explantat zu validieren, da die SCG das Gewebe mit PBS blockieren, das 10 % normales Eselsserum und 2 % Tritton X 100 für zwei Stunden enthält. Anschließend erfolgt die Inkubation des Primärantikörpers in einer Blockierungslösung über Nacht. Am nächsten Tag nach der Inkubation des primären Antikörpers wird das X-Explan, das die Gele enthält, auf eine 24-Well-Platte übertragen, nachdem man es mit PBS gewaschen hat, zwei Stunden lang lichtgeschützt mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern inkubiert, dann mit PBS gewaschen und 10 Minuten lang mit Pappy-Lösung inkubiert hat.

Nach mehrmaligem Waschen die Kollagengele mit dem X explan auf ein Mikroskop legen, Objektträger, die Objektträger trocknen und anschließend mit Kalbfleisch montieren. Verwenden Sie ein Standard-Fluoreszenzmikroskop, um Bilder für die spätere quantitative Analyse zu erhalten. Hilfreich ist es, wenn die Mikroskopsoftware in der Lage ist, Metadaten aufzuzeichnen.

Die quantitative Analyse der erhaltenen Bilder kann mit der Software Fiji oder ImageJ durchgeführt werden, die kostenlos für wissenschaftliche Anwendungen verwendet werden kann. In diesem Film wird das axonale Wachstum aus einem schematischen SCGX EXPLAN über vier Tage in vitro demonstriert. Die Immunhistochemie kann am vierten Tag in vitro durchgeführt werden, um das explantierte Ganglion eindeutig zu identifizieren.

Als sympathisches Ganglion kann beobachtet werden, wie Schwan-Zellen entlang des Axons wandern und sich vom Ganglion cervicalis superior in die Peripherie bewegen. Dieses Video zeigt das gleiche Migrationsmuster wie gerade in einer höheren Vergrößerung. Migrationsabstände können leicht an Proben gemessen werden, die auf Zellkerne mit DPI gegengefärbt werden, indem der Abstand zwischen den Kernen der führenden Schwan-Zellen und dem Rand des explantierten SCG an mehreren Stellen gemessen wird, wie im Schema und im Bild einer DPI-markierten NGF-behandelten Probe nach vier Tagen in vitro dargestellt.

Die Kombination von Hellfeld und Fluoreszenz ermöglicht die Visualisierung von S 100 GFP-positiven Schwanenzellen und den Axonen. Schließlich zeigt dieser Film die Wanderung von Schwanzellen an der Grenze eines Ganglions cervicalis superior ex explan. Hier ist nur der Fluoreszenzkanal dargestellt, was eine einfachere Interpretation von S 100 GFP-positiven Schwanenzellen ermöglicht.

Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche quantitative Analysen durchgeführt werden, wie z.B. die Quantifizierung der Zellproliferation oder die Quantifizierung der Apoptose einer Zelle. Natürlich muss die adäquate Immunhistochemie für die Endpunktanalyse durchgeführt werden oder die spezifischen transgenen Tiere müssen verwendet werden, um die Auswirkungen im lebenden Kontext zu zeigen.