Isometrische und exzentrische Krafterzeugung Beurteilung der Skelettmuskulatur Isoliert von Mausmodellen von Muskeldystrophien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die mechanischen Eigenschaften der Skelettmuskulatur zu messen, die von Mäusen isoliert wurde. Dazu wird zunächst der Musculus extensor digitorum longus oder der EDL-Muskel sowie der Zwerchfellmuskel des Tieres präpariert. Nach der Vorbereitung eines Zwerchfellstreifens stecken Sie das EDL und den Zwerchfellstreifen in eine Schale mit sauerstoffhaltiger Ringerlösung und binden dann die Nahtschlaufen an beide Enden der Muskeln.

Als nächstes wird der EDL- oder Zwerchfellstreifen in einem Organbad zwischen zwei Elektroden gesichert, die an einem Ende an einem Kraftaufnehmer oder Hebel befestigt sind, und auf der Grundlage der Zuckenkraft auf seine optimale Länge eingestellt. Der letzte Schritt besteht darin, den Muskel mit einer Reihe von mechanischen Protokollen zu stimulieren und die Kraftproduktion zu messen. Letztendlich werden die Berechnung der Kraftproduktion, des Widerstands gegen Beschädigungen, der Krafthäufigkeit und anderer Eigenschaften verwendet, um die Stärke und Integrität und andere Eigenschaften des Muskels und gegebenenfalls die Auswirkungen einer Behandlung oder genetischen Veränderung zu zeigen.

Diese Technik kann verwendet werden, um potenzielle Therapien für Muskeldystrophien zu testen, da die meisten dieser Therapien darauf abzielen, die Muskelkraft wiederzuerlangen und die Muskelzerbrechlichkeit zu reduzieren. Obwohl wir nicht die ersten sind, die diese Technik anwenden, verwenden wir sie routinemäßig, um eine Reihe verschiedener Mausmodelle zu untersuchen und ihre Muskelfunktion zu beurteilen sowie um mehrere Therapien für die Muskeldystrophien zu charakterisieren und zu bewerten. Neben Dr. Catherine Morewood werden wir dieses Verfahren anhand von zwei Mitgliedern unseres physiologischen Bewertungskerns demonstrieren, Dr. Min Liu, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter, und Herrn Ian, einem Forschungsspezialisten.

Die Mäuse, die bei diesem Verfahren verwendet werden, werden mit Ketamin und Xylazin betäubt, um sicherzustellen, dass sie keine Schmerzen oder Beschwerden verspüren, aber die Muskeln durch den Kreislauf gut mit Sauerstoff versorgt bleiben. Nachdem Sie durch ein Zehenkneifen bestätigt haben, dass das Tier ausreichend betäubt ist, immobilisieren Sie seine hohen Gliedmaßen mit medizinischem Klebeband und entfernen Sie die Haut der unteren vorderen hinteren Extremität, um die Muskeln dieses Bereichs freizulegen, halten Sie die Muskeln in regelmäßigen Abständen mit der Anwendung von PBS feucht. Unter einem Präpariergerät wird ein kleiner Schnitt lateral des Knies vorgenommen, um die proximale Sehne des Musculus extensor digitorum longus oder des EDL-Muskels freizulegen.

In diesem Bereich befinden sich zwei Sehnen, die beide durchtrennt werden sollten, um die Entfernung der EDL am medialen Sprunggelenk zu ermöglichen. Schneiden Sie die Sehne des vorderen Tibial- oder TA-Muskels durch, um die distalen Sehnen des EDL freizulegen, die sich entlang der Mittelfußknochen erstrecken. Hebe den TA-Muskel aus dem Weg.

Achten Sie darauf, dass Sie die darunter liegende EDL nicht schneiden oder berühren. Kehren Sie zu den distalen Sehnen der EDL zurück und schneiden Sie jede einzelne ab. Fassen Sie als Nächstes die Sehnen und ziehen Sie das EDL vorsichtig vom Rest der Gliedmaße weg.

Es sollte sich frei vom proximalen Ende lösen. Entfernen Sie den EDL-Muskel und legen Sie ihn in eine Präparierschale, die mit gekühlten, sauerstoffhaltigen Pressern gefüllt ist. Stecken Sie den Muskel in etwa der Ruhelänge durch die Sehnen, was der Länge in vivo entspricht.

Die Länge ist zu kurz, wenn der Muskel in der Schale geflattert ist, und zu lang, wenn der Muskel an den Präpariernadeln zieht. Binden Sie die Nähte so nah wie möglich an den Muskel an die Sehnen, berühren Sie den Muskel jedoch nicht. Stecken Sie den Muskel mit den Nähten in etwa Ruhelänge fest.

So starten Sie dieses Verfahren. Machen Sie einen Schnitt in der Haut des eingeschläferten Tieres. Zur Freilegung der Bauch- und Brusthöhle.

Öffnen Sie die Bauchhöhle und schneiden Sie die Körperwand knapp unterhalb der Rippen mit einer Knochenschere und beginnend oberhalb des Zwerchfelleinsatzes. Den gesamten Brustkorb entlang der Linie der Rippen umschneiden und die Wirbelsäule durchschneiden. Schneiden Sie Blutgefäße, die durch die Mitte des Zwerchfells verlaufen, damit das Zwerchfell leicht entfernt werden kann.

Entfernen Sie das Zwerchfell von der Maus und legen Sie es in eine Präparierschale, die mit sauerstoffhaltigen Ringern gefüllt ist. Rühren Sie das Zwerchfell in der Schale vorsichtig um, um das Blut wegzuspülen. Aktualisieren Sie die Klingeltonlösung nach Bedarf.

Schneiden Sie als nächstes einen kleinen Streifen des Zwerchfells von der zentralen Sehne bis zu den Rippen entlang der Ausrichtung der Fasern im mittleren Teil der lateralen Halbmembranen. Der Streifen sollte zwischen zwei und vier Millimeter breit sein. Binden Sie Nähte an die zentrale Sehne, binden Sie Nähte an jedes der seitlich hervorstehenden Rippenenden und binden Sie diese dann mit einer Knochenschere zu einer großen Schlaufe zusammen.

Schneiden Sie die Rippe auf beiden Seiten des Streifens ab, so dass auf beiden Seiten der Membran ein bis zwei Millimeter Überstand der Rippe übrig bleibt. Die Beurteilung der Streifenkrafterzeugung der isolierten Skelettmuskulatur wird durch ein In-vitro-Muskeltestsystem durchgeführt, bei dem die Muskeln im Mechanikerbad befestigt werden, die Nähte erfasst und mit diesen an einem Ende an einem starren Pfosten und am anderen Ende an einem Kraftaufnehmer befestigt werden. Eine gute Näherung ist die Länge der ruhenden Muskeln.

Wie bereits gezeigt, wird das Bad mit sauerstoffhaltiger Ringerlösung gefüllt, die bei 22 Grad Celsius gehalten wird. Um die Muskelstabilität zu verlängern, sollten die Muskeln vor dem Funktionstest fünf Minuten in diesem Bad ruhen, so dass die Muskeltemperatur auf 22 Grad Celsius reduziert wird, um supramaximale Stimulationsbedingungen zu schaffen. Nachdem ein Muskel in die Badewanne gelegt wurde, verwenden Sie einzelne Stimulationsimpulse von 0,5 Millisekunden, um ein Zucken zu erzeugen und die Kraftabgabe zu überwachen.

Erhöhen Sie den Strom allmählich, bis die Kraft ein maximales, aber gleichmäßiges Niveau erreicht, erhöhen Sie den Strom auf 10% mehr als dieses Niveau für die verbleibenden Experimente, um die optimale Länge zu ermitteln, stellen Sie zunächst sicher, dass der Muskel nicht schlaff ist, aber auch nicht trainiert. Eine gute Näherung ist die zuvor gezeigte Länge der ruhenden Muskeln. Mit isometrischen Twitch-Stimulationen wird die Länge des Muskels allmählich angepasst, bis eine maximale Kraft erreicht ist.

Ruhen Sie den Muskel zwischen jeder Kontraktion etwa 10 Sekunden aus. Eine optimale Muskellänge wird erreicht, wenn die Zuckenkraft die maximale Muskellänge mit Messschiebern aufzeichnet. Bei der EDL ist es die Länge zwischen den Myosehnenübergängen.

Für das Zwerchfell ist es die Länge zwischen dem zentralen Myosehnenübergang und dem Muskelansatz zur Rippe. Um die maximale isometrische Titanic-Kraft zu bestimmen, stimulieren Sie den Muskel bei optimaler Muskellänge für einen Zeitraum von 500 Millisekunden mit einer Reihe von 0,5-Millisekunden-Impulsen bei supermaximaler Stimulation und bei Fusionsfrequenz. Das Plateau für EDL-Muskeln wird typischerweise mit 120 Hertz erreicht, und für Zwerchfellmuskeln mit 100 Hertz wird dreimal in der jeweiligen Frequenz stimuliert, mit Ruhephasen von fünf Minuten zwischen den Stimulationseinheiten für jeden Muskel nach einer fünfminütigen Pause.

Nachdem Sie isometrische Kontraktionen durchgeführt haben, beginnen Sie mit dem Verfahren für exzentrische Kontraktionen. Stimulieren Sie den Muskel in den ersten 500 Millisekunden isometrisch mit 80 Hertz, gefolgt von einer Dehnung der optimalen Muskellänge von 10 % in den letzten 200 Millisekunden. Wiederholen Sie das Stimulationsmuster mit fünf Minuten Pausen dazwischen.

Für die gewünschte Anzahl exzentrischer Kontraktionen messen Sie die Kraft für jede Kontraktion im Zeitraum vor der Dehnung. Berechnen Sie den Kraftabfall zwischen der ersten und der letzten Kontraktion nach Abschluss des Funktionstests. Verkürzen Sie die Muskellänge und entfernen Sie den Muskel vorsichtig aus dem Schallkopf und dem Stift.

Lege den Muskel wieder in eine Präparierschale mit Ringern. Entfernen Sie die Nähte von den Muskeln für den EDL-Muskel. Blockieren Sie den Muskel zweimal und wiegen Sie ihn dann, bevor Sie ihn weiterverarbeiten.

Dies ist wichtig für die Berechnung der Querschnittsfläche und der spezifischen Kraft für den Zwerchfellmuskel, der 15 bis 20 Minuten lang in 0,1 % Pros und Orange, einer Membran und einem permeten Farbstoff eingeweicht wird. Dies liefert einen Index für Dissektionsschäden, präpariert den Zwerchfellmuskel weg vom knöchernen Ansatz sowie die zentrale Sehne. Dies ist notwendig, um ein genaues Gewicht des Muskelflecks vor dem Wiegen und der anschließenden Vorbereitung bereitzustellen.

Die Querschnittsfläche oder CSA wird nach der folgenden Formel berechnet, wobei L über LO das Verhältnis von Faser zu Muskellänge und 1,06 die Muskeldichte ist. In dieser Abbildung sind die erwarteten Werte für die isometrischen Kräfte bei Wildtyp C 57 und Muskeldystrophie oder M-D-X-E-D-L-Muskeln von 12 Wochen alten Tieren dargestellt. Da MDX-Muskeln eine kompensatorische Hypertrophie aufweisen, kann die Gesamt- bis titanische Kraft im MDX-Muskel höher sein als bei altersangepassten Wildtyp-Kontrollen. Ein geeigneteres Maß für die funktionelle Leistung ist die spezifische Kraft, bei der die Kraft für die Querschnittsfläche normiert wird.

Um diesen Wert zu berechnen, hängt die spezifische Kraft von der inhärenten Funktionsfähigkeit des Muskels ab, wobei die Schwäche bei dystrophischen Muskeln deutlicher wird, wenn sowohl die absolute Kraft als auch die Querschnittsfläche berücksichtigt werden. In dieser Studie wurde beobachtet, dass EDL-Muskeln von MDX-Mäusen etwa 20 bis 25 % geringere spezifische Kräfte erzeugen als die von Wildtyp-Mäusen im Alter von 10 bis 26 Wochen. Für das Zwerchfell ist nur die spezifische Kraft für Vergleiche relevant, da es sich bei der Präparation um ein Stück Muskel handelt, das von der Dissektion abhängig ist.

Ein Vergleich der spezifischen Kraft zwischen dem Wildtyp-Muskel C 57, der durch die blaue Linie gekennzeichnet ist, und dem MDX-Zwerchfellmuskel, der durch die roten Balken gekennzeichnet ist, spiegelt die fortschreitende Pathologie in diesem Gewebe wider. Die isometrische Kraftabgabe nimmt mit zunehmendem Alter ab, so dass die Zwerchfellmuskeln von MDX-Mäusen im Alter von sechs Monaten nicht mehr als die Hälfte der funktionellen Leistung von Zwerchfellstreifen von altersgleichen Wildtyp-Kontrollen produzieren. In dieser Abbildung ist ein Beispiel für exzentrische Kontraktionen aus der Membranprüfung dargestellt.

Mit jeder weiteren exzentrischen Kontraktionskraft nimmt die Kraftabgabe in den Membranstreifen sowohl von Wildtyp C 57 (blau (dargestellt) als auch von MDX-Mäusen (rot dargestellt) ab. In Muskelproben der MDX-Maus ist der Kraftverlust jedoch dramatischer, vermutlich aufgrund des Fehlens von Dystrophin und den damit verbundenen Proteinen, die einmal beherrscht wurden. Diese Technik kann in etwa einer Stunde für einen einzelnen Muskel durchgeführt werden, wenn sie nach dieser Technik richtig ausgeführt wird.

Andere Methoden wie Western Blotting oder andere biochemische Messungen können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Behandlung den Proteinspiegel verändert oder die Muskelintegrität normalisiert hat. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die EDL und das Zwerchfell von der Maus zerlegt und wie man die Kraftproduktion vor und nach exzentrischen Kontraktionen misst und analysiert.