Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung biomimetischer Zellkultursubstrate, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe zu beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Silikonmaster mit der gewünschten topographischen Architektur durch tiefes reaktives Ionenätzen hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das gewünschte topographische Muster mit Hilfe der UV-gestützten Kapillarkraftlithographie vom Silikonmaster auf eine PUA-Form zu übertragen.

Anschließend wird die PUA-Form als Schablone verwendet, um Zellkultursubstrate aus verschiedenen polymeren Materialien je nach gewünschter Anwendung mittels UV-gestützter oder lösungsmittelvermittelter Kapillarkraftlithographie herzustellen. Der letzte Schritt besteht darin, entweder aus Primär- oder Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten für die anschließende Analyse auf das Nanomuster-Zellkultursubstrat aufzubringen. Letztendlich werden Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um Veränderungen in der Zellmorphologie und der vertraglichen Proteinanordnung innerhalb der Kardiomyozyten aufzuzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. dem Mikrokontaktdruck, besteht darin, dass die Kapillarkraftlithographie Zellkultursubstrate mit Nanomuster erzeugt, die eine strukturelle Ausrichtung von Monoschichten des Herzgewebes induzieren können, ohne auf Zellproliferation oder -migration angewiesen zu sein. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung von Herzgeweben zu erhalten, kann sie auch auf andere Systeme wie die Krebsmechanobiologie angewendet werden. Um den Einfluss der Matrixtopographie auf die Zellmigration zu untersuchen, beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Silizium-Masteroberfläche mit 100 % Ethanol oder Xylol reinigen und unter Sauerstoff-Stickstoffgas trocknen.

Legen Sie als Nächstes das Silikon-Mastermuster mit der Seite nach oben in eine Petrischale für ein Silikon-Master, auf das Sie mit einem zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter großen Oberflächenmuster 40 Mikroliter PUA pipettieren können. Legen Sie dann ein Blatt von vier Zentimetern x vier Zentimeter transparenter Polyesterfolie über die abgegebene PUA, drücken Sie auf die PET-Folie und verteilen Sie die PUA unter der Folie mit einer Walze oder einer flachen Kantenoberfläche auf der Musterfläche, so dass das gesamte Muster vom PUA-Prepolymer bedeckt ist. Legen Sie dann das Silikon-Master-Prepolymer und PET für 50 Sekunden etwa 10 Zentimeter unter ein 20 Watt UV-Licht.

Entfernen Sie die PET-Folie nach dem Aushärten langsam mit einer Pinzette. PUA sollte mit einem Negativ des Silicon Master Nano-Musters an der PET-Folie befestigt werden. Anschließend härten Sie die P-U-A-P-E-T-Nanomuster vor der Verwendung mindestens 12 Stunden unter UV aus.

Um die Silicon Master zu reinigen, legen Sie eine weitere PET-Folie ohne Zusatz von PUA auf den Master. Setzen Sie diese 50 Sekunden lang dem UV-Licht aus und entfernen Sie die PET-Folie. Spülen Sie dann den Silicon Master mit 100%Ethanol oder Xylol und trocknen Sie ihn unter Sauerstoff-Stickstoffgas.

Behandeln Sie bei diesem Verfahren kreisförmige Objektträger mit einem Durchmesser von 18 Millimetern, indem Sie sie 10 Minuten lang in eine Ozonkammer legen. Platzieren Sie anschließend die Objektträger auf PDMS-Blöcken, um sie für eine einfache Handhabung vorübergehend zu sichern. Tragen Sie anschließend eine Schicht Glasgrundierung auf die Oberfläche des Objektträgers auf.

Lassen Sie die Grundierung 30 Minuten lang an der Luft trocknen. Lege nun die Objektträger auf ein Stück Druckerpapier. Geben Sie 10 Mikroliter Polyurethan-Prepolymer in die Mitte jedes Objektträgers und stellen Sie sicher, dass keine Blasen entstehen.

Legen Sie dann das PUA-Formmuster mit der Vorderseite nach unten auf den Objektträger, verteilen Sie das PU-Prepolymer gleichmäßig über die Oberfläche des Glasobjektträgers, indem Sie eine Gummizylinderwalze entlang der PUA-Form rollen. Das Druckerpapier absorbiert den Polymerüberlauf und härtet sie anschließend 60 Sekunden lang unter einer 20-Watt-UV-Lampe aus. Entfernen Sie anschließend die Probe von der UV-Lichtquelle und schälen Sie die PUA-Form vorsichtig vom PU-beschichteten Objektträger, die Polymerisation des PU gilt als abgeschlossen.

Wenn sich die PUA-Form sauber von der Probe ablöst und der PU-Glasobjektträger ein schillerndes Aussehen hat, legen Sie die Proben zur Lagerung bis zu einem Monat in ein Trockenmittel. Befestigen Sie nun A NFS-Deckgläser an einer 35-Millimeter-Gewebekultur-Polystyrolschale, pipettieren Sie 20 Mikroliter NOA am Boden der Schale. Legen Sie den NPPU-Deckslip vorsichtig auf die NOA und lassen Sie den Kleber verteilen und bedecken Sie die gesamte Unterseite des Deckglases, nachdem Sie NOA ausgehärtet haben, indem Sie die Schale 10 Minuten lang der UV-Strahlung aussetzen.

Anschließend sterilisieren Sie das NP SUBSTRATA, indem Sie es zweimal fünf Minuten lang mit zwei Millilitern 70%iger wässriger Ethanollösung spülen. Entfernen Sie das Ethanol durch Aspiration. Lassen Sie das A NFS ca. eine Stunde lang unter der UV-Entkeimungslampe in der biologischen Sicherheitswerkbank vollständig an der Luft trocknen.

Um die Zelladhäsion zu verbessern, beschichten Sie das A NFS über Nacht mit Fibronektin, indem Sie das Fibronektin zuerst in Di-Wasser auf fünf Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Pipettieren Sie anschließend zwei Milliliter Fibronektinlösung in eine Schale. Legen Sie dann den A NFS über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in den Inkubator.

Entnehmen Sie NR VMs, HESC CMS oder andere kardiale Zellen von Interesse, zentrifugieren Sie die Zellprobe drei Minuten lang bei 1000 U/min, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Danach resuspendieren Sie die Zellen in Kulturmedien auf eine Konzentration von 4,6 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter.

Pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikroliter Zellsuspension auf das sterilisierte A NFS und stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension auf dem Deckglas verbleibt. Legen Sie die Zellen anschließend vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in den Inkubator, damit sich die Zellen an das A-NFS anheften können. Geben Sie dann zwei Milliliter zusätzliches warmes Nährmedium in die Schale und legen Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen erneut in den Inkubator.

Entfernen Sie nach 24 Stunden das Medium und waschen Sie es zweimal mit zwei Millilitern DPBS, um überschüssige Zellen zu entfernen. Geben Sie danach zwei Milliliter warmes Nährmedium in die Schale. Legen Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen und in der gleichen Kultur in einen Inkubator.

Die Zellen, die zusammenfließen, ersetzen die Medien alle zwei Tage. Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Hellfeldbilder von NR-VMs nach sieben Tagen Kultur und HESC-CMS. Nach 48-stündiger Kultivierung zeigen NR VMs und HESC CMS auf den NP-Oberflächen eine offensichtliche strukturelle Anisotropie und Ausrichtung, während Kardiomyozyten auf UN-Musteroberflächen zufällig orientiert sind.

Immunhistochemische Analysen unterstreichen den Einfluss der Nanotopographie auf die Ausrichtung des Zellzytoskeletts, Aktin-Mikrofilamente und alpha-sarkomerisches Aktin in Zellen, die auf dem A-NFS kultiviert wurden, werden entlang der Nanokämme ausgerichtet, bleiben aber zufällig in Zellen auf unstrukturierten Substraten verteilt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihr Substrat vor dem Sitzen der Zellen zu sterilisieren, da eine Kontamination nach seiner Entwicklung ein großes Problem darstellen kann. Diese Technik ebnete Forschern in der kardiovaskulären Biologie den Weg, um die kardiale Reifung und aus Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein biomimetisches Zellkultursubstrat mittels Kapillarkraftlithographie für kardiale Tissue-Engineering-Anwendungen herstellt.