Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering
June 10th, 2014
In diesem Protokoll demonstrieren wir die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten, die aus zwei unterschiedlichen Polymermaterialien mittels Kapillarkraftlithographie hergestellt werden. Die beschriebenen Methoden bieten eine skalierbare, kostengünstige Technik, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe für in vitro und in vivo Anwendungen zu entwickeln.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung biomimetischer Zellkultursubstrate, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe zu beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Silikonmaster mit der gewünschten topographischen Architektur durch tiefes reaktives Ionenätzen hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das gewünschte topographische Muster mit Hilfe der UV-gestützten Kapillarkraftlithographie vom Silikonmaster auf eine PUA-Form zu übertragen.
Anschließend wird die PUA-Form als Schablone verwendet, um Zellkultursubstrate aus verschiedenen polymeren Materialien je nach gewünschter Anwendung mittels UV-gestützter oder lösungsmittelvermittelter Kapillarkraftlithographie herzustellen. Der letzte Schritt besteht darin, entweder aus Primär- oder Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten für die anschließende Analyse auf das Nanomuster-Zellkultursubstrat aufzubringen. Letztendlich werden Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um Veränderungen in der Zellmorphologie und der vertraglichen Proteinanordnung innerhalb der Kardiomyozyten aufzuzeigen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. dem Mikrokontaktdruck, besteht darin, dass die Kapillarkraftlithographie Zellkultursubstrate mit Nanomuster erzeugt, die eine strukturelle Ausrichtung von Monoschichten des Herzgewebes induzieren können, ohne auf Zellproliferation oder -migration angewiesen zu sein. Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung von Herzgeweben zu erhalten, kann sie auch auf andere Systeme wie die Krebsmechanobiologie angewendet werden. Um den Einfluss der Matrixtopographie auf die Zellmigration zu untersuchen, beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Silizium-Masteroberfläche mit 100 % Ethanol oder Xylol reinigen und unter Sauerstoff-Stickstoffgas trocknen.
Legen Sie als Nächstes das Silikon-Mastermuster mit der Seite nach oben in eine Petrischale für ein Silikon-Master, auf das Sie mit einem zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter großen Oberflächenmuster 40 Mikroliter PUA pipettieren können. Legen Sie dann ein Blatt von vier Zentimetern x vier Zentimeter transparenter Polyesterfolie über die abgegebene PUA, drücken Sie auf die PET-Folie und verteilen Sie die PUA unter der Folie mit einer Walze oder einer flachen Kantenoberfläche auf der Musterfläche, so dass das gesamte Muster vom PUA-Prepolymer bedeckt ist. Legen Sie dann das Silikon-Master-Prepolymer und PET für 50 Sekunden etwa 10 Zentimeter unter ein 20 Watt UV-Licht.
Entfernen Sie die PET-Folie nach dem Aushärten langsam mit einer Pinzette. PUA sollte mit einem Negativ des Silicon Master Nano-Musters an der PET-Folie befestigt werden. Anschließend härten Sie die P-U-A-P-E-T-Nanomuster vor der Verwendung mindestens 12 Stunden unter UV aus.
Um die Silicon Master zu reinigen, legen Sie eine weitere PET-Folie ohne Zusatz von PUA auf den Master. Setzen Sie diese 50 Sekunden lang dem UV-Licht aus und entfernen Sie die PET-Folie. Spülen Sie dann den Silicon Master mit 100%Ethanol oder Xylol und trocknen Sie ihn unter Sauerstoff-Stickstoffgas.
Behandeln Sie bei diesem Verfahren kreisförmige Objektträger mit einem Durchmesser von 18 Millimetern, indem Sie sie 10 Minuten lang in eine Ozonkammer legen. Platzieren Sie anschließend die Objektträger auf PDMS-Blöcken, um sie für eine einfache Handhabung vorübergehend zu sichern. Tragen Sie anschließend eine Schicht Glasgrundierung auf die Oberfläche des Objektträgers auf.
Lassen Sie die Grundierung 30 Minuten lang an der Luft trocknen. Lege nun die Objektträger auf ein Stück Druckerpapier. Geben Sie 10 Mikroliter Polyurethan-Prepolymer in die Mitte jedes Objektträgers und stellen Sie sicher, dass keine Blasen entstehen.
Legen Sie dann das PUA-Formmuster mit der Vorderseite nach unten auf den Objektträger, verteilen Sie das PU-Prepolymer gleichmäßig über die Oberfläche des Glasobjektträgers, indem Sie eine Gummizylinderwalze entlang der PUA-Form rollen. Das Druckerpapier absorbiert den Polymerüberlauf und härtet sie anschließend 60 Sekunden lang unter einer 20-Watt-UV-Lampe aus. Entfernen Sie anschließend die Probe von der UV-Lichtquelle und schälen Sie die PUA-Form vorsichtig vom PU-beschichteten Objektträger, die Polymerisation des PU gilt als abgeschlossen.
Wenn sich die PUA-Form sauber von der Probe ablöst und der PU-Glasobjektträger ein schillerndes Aussehen hat, legen Sie die Proben zur Lagerung bis zu einem Monat in ein Trockenmittel. Befestigen Sie nun A NFS-Deckgläser an einer 35-Millimeter-Gewebekultur-Polystyrolschale, pipettieren Sie 20 Mikroliter NOA am Boden der Schale. Legen Sie den NPPU-Deckslip vorsichtig auf die NOA und lassen Sie den Kleber verteilen und bedecken Sie die gesamte Unterseite des Deckglases, nachdem Sie NOA ausgehärtet haben, indem Sie die Schale 10 Minuten lang der UV-Strahlung aussetzen.
Anschließend sterilisieren Sie das NP SUBSTRATA, indem Sie es zweimal fünf Minuten lang mit zwei Millilitern 70%iger wässriger Ethanollösung spülen. Entfernen Sie das Ethanol durch Aspiration. Lassen Sie das A NFS ca. eine Stunde lang unter der UV-Entkeimungslampe in der biologischen Sicherheitswerkbank vollständig an der Luft trocknen.
Um die Zelladhäsion zu verbessern, beschichten Sie das A NFS über Nacht mit Fibronektin, indem Sie das Fibronektin zuerst in Di-Wasser auf fünf Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Pipettieren Sie anschließend zwei Milliliter Fibronektinlösung in eine Schale. Legen Sie dann den A NFS über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 in den Inkubator.
Entnehmen Sie NR VMs, HESC CMS oder andere kardiale Zellen von Interesse, zentrifugieren Sie die Zellprobe drei Minuten lang bei 1000 U/min, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Danach resuspendieren Sie die Zellen in Kulturmedien auf eine Konzentration von 4,6 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter.
Pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikroliter Zellsuspension auf das sterilisierte A NFS und stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension auf dem Deckglas verbleibt. Legen Sie die Zellen anschließend vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in den Inkubator, damit sich die Zellen an das A-NFS anheften können. Geben Sie dann zwei Milliliter zusätzliches warmes Nährmedium in die Schale und legen Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen erneut in den Inkubator.
Entfernen Sie nach 24 Stunden das Medium und waschen Sie es zweimal mit zwei Millilitern DPBS, um überschüssige Zellen zu entfernen. Geben Sie danach zwei Milliliter warmes Nährmedium in die Schale. Legen Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen und in der gleichen Kultur in einen Inkubator.
Die Zellen, die zusammenfließen, ersetzen die Medien alle zwei Tage. Diese Abbildung zeigt die repräsentativen Hellfeldbilder von NR-VMs nach sieben Tagen Kultur und HESC-CMS. Nach 48-stündiger Kultivierung zeigen NR VMs und HESC CMS auf den NP-Oberflächen eine offensichtliche strukturelle Anisotropie und Ausrichtung, während Kardiomyozyten auf UN-Musteroberflächen zufällig orientiert sind.
Immunhistochemische Analysen unterstreichen den Einfluss der Nanotopographie auf die Ausrichtung des Zellzytoskeletts, Aktin-Mikrofilamente und alpha-sarkomerisches Aktin in Zellen, die auf dem A-NFS kultiviert wurden, werden entlang der Nanokämme ausgerichtet, bleiben aber zufällig in Zellen auf unstrukturierten Substraten verteilt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihr Substrat vor dem Sitzen der Zellen zu sterilisieren, da eine Kontamination nach seiner Entwicklung ein großes Problem darstellen kann. Diese Technik ebnete Forschern in der kardiovaskulären Biologie den Weg, um die kardiale Reifung und aus Stammzellen gewonnene Kardiomyozyten zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein biomimetisches Zellkultursubstrat mittels Kapillarkraftlithographie für kardiale Tissue-Engineering-Anwendungen herstellt.
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Überblick
Dieses Protokoll zeigt die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten mittels Kapillarkraft-Lithografie. Die beschriebenen Methoden bieten einen skalierbaren und kostengünstigen Ansatz zur Herstellung makroskopischer Herzgewebe für verschiedene Anwendungen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsgebiet
- Herzgewebe-Engineering
- Zellkulturtechniken
- Polymere Materialien
Hintergrund
- Biomimetische Substrate sind für die Untersuchung von Herzzellen unerlässlich.
- Kapillarkraft-Lithografie ermöglicht eine präzise Musterung.
- Die Herstellung von Herzgewebe kann In-vitro- und In-vivo-Studien verbessern.
- Die Verwendung verschiedener polymerer Materialien kann Anwendungen anpassen.
Zweck der Studie
- Herstellung von biomimetischen Zellkultursubstraten.
- Konstruieren der Struktur und Funktion von Herzgeweben.
- Erleichterung der Analyse des Verhaltens von Kardiomyozyten.
Verwendete Methoden
- Herstellung eines Silikonmasters mittels tiefer reaktiven Ionenätzung.
- Übertragung topographischer Muster auf eine PUA-Form mittels UV-gestützter Kapillarkraft-Lithografie.
- Herstellung von Zellkultursubstraten aus verschiedenen polymeren Materialien.
- Beschichten von Kardiomyozyten für die Analyse mittels Mikroskopietechniken.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Übertragung von topographischen Mustern auf Zellkultursubstrate.
- Beobachtung von Veränderungen in der Zellmorphologie.
- Analyse der kontraktilen Proteinanordnung in Kardiomyozyten.
- Demonstration der Wirksamkeit der biomimetischen Substrate.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Herstellung biomimetischer Substrate.
- Kapillarkraft-Lithografie ist eine vielseitige Technik für das Gewebe-Engineering.
- Weitere Studien können das Verständnis des Verhaltens von Herzzellen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Capillary force lithography enables scalable fabrication of biomimetic substrata that replicate nanoscale extracellular matrix cues critical for cardiac tissue maturation. This approach supports predictive modeling of cardiomyocyte structure-function relationships, reducing reliance on empirical screening in early discovery. By providing reproducible, alignment-inducing platforms, the method enhances target validation confidence and translational continuity in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of nanotopography effects on cardiomyocyte alignment and contractile protein organization.
- Operational Value: Provides cost-effective, scalable substrates for high-throughput assessment of matrix-mediated cellular responses.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by isolating topographic variables in cardiac maturation pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological and cytoskeletal readouts via brightfield and immunofluorescence microscopy.
- Operational Value: Delivers reproducible nanopatterned surfaces compatible with primary and stem cell-derived cardiomyocytes.
- Assay Readiness: Facilitates standardized evaluation of compound effects on tissue-level electromechanical coupling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges nanoscale ECM mimicry to functional tissue phenotypes relevant to disease modeling.
- Preclinical Utility: Enables risk-adjusted assessment of regenerative candidates using aligned cardiomyocyte monolayers.
- Mechanistic Insight: Clarifies structure-function relationships without confounding effects from cell proliferation or migration.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling hypothesis-driven evaluation of matrix topography effects prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports functional target validation through controlled nanotopography-induced phenotypic modulation.
- Screening: Delivers standardized, alignment-inducing substrata for consistent compound screening in cardiac assays.
- Analytics: Provides quantitative imaging-based readouts for assessing cytoskeletal alignment and sarcomeric organization.
- Translational Research: Connects nanoscale substrate design to preclinical-relevant tissue maturation endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiovascular target validation across multiple therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue engineering by decoupling topographic cues from biochemical signals.
- Operational Value: Ensures batch-to-batch reproducibility via UV-assisted and solvent-mediated capillary force lithography processes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing predictive, human-relevant in vitro models.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified advancement of cardiac regenerative candidates based on functional tissue metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanofabrication, polymer chemistry, and cell culture techniques.
- Depends on UV curing equipment, precision molding tools, and sterile tissue culture infrastructure.
- Necessitates standardization of fibronectin coating and sterilization protocols across teams.
- Involves adaptation considerations when extending to non-cardiac cell types or disease models.
- Limited by the need for specialized masters and molds, though scalable via replication.
