Name: Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung biomimetischer Zellkultursubstrate mittels Kapillar-Force-Lithographie für das Herz-Tissue-Engineering. Diese Methode ermöglicht präzise Strukturierung für Kardiomyozyten-Analysen.

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D. H. Kim dankt dem Department of Bioengineering an der University of Washington für den neuen Gründungsfonds der Fakultät. D. H. Kim wird auch durch den Perkins Coie Award for Discovery, den Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, den Washington State Life Science Discovery Fund und den American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076) unterstützt. J. Macadangdang und A. Jiao danken der Unterstützung durch das NIH Bioengineering Stipendium für kardiovaskuläres Training. Zusätzliche Unterstützung für diese Arbeit kommt durch das Stipendium der National Institutes of Health (NIH), das M. Regnier R01HL111197 wurde.

Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur (~ 23 ° C) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. 1. Herstellung von Silicon-Master <ol><li> Saubere Silizium-Wafer mit 100% Ethanol oder Xylol und trocken unter O 2 / N 2-Gas. </li><li> Zeigen Silizium-Wafer in Spin-Coater bei Drehzahlen von 2.000-4.000 Umdrehungen pro Minute, um eine 0,3-0,5 um dicken Film zu produzieren. </li><li> Strukturieren der Photoresistschicht mit den richtigen Dimensionen unter Verwendung eines Photolithographiesystem </li><li> Vollständig eintauchen, die strukturierte Photoresist-beschichtete Siliziumwafer in einem geeigneten Volumen von Photoresistentwicklerlösung. </li><li> Spülen Sie die entwickelte Photoresist beschichteten Silizium-Wafer mit VE-Wasser. </li><li> Arrays von Sub-Mikrometer-Maßstab Rippen mit fast vertikalen Seitenwänden, tiefes reaktives Ionenätzen der freiliegenden Silizium unter Verwendung eines Ätz-System zu bilden. </li><li> Entfernen Sie die verbleibende Photoresist, indem die Silizium-Wafer in einem Plasmaverascher-System. </li><li> Schneiden Sie die Silizium wAfers mit einem Diamantschneider in die entsprechend dimensioniert Silizium-Meister für die anschließende Replik Form. </li></ol> 2. Herstellung von PUA-Mold von Silicon Meister HINWEIS: Volumen auf Silizium-Master zur Nanofabrikation zugesetzt werden in Abhängigkeit von der Fläche der nano Master als auch repliziert werden, da die Viskosität des Polyurethanacrylat (PUA)-Lösung variieren. <ol><li> Saubere Silizium-Master-Oberfläche mit 100% Ethanol oder Xylol und trocken unter O 2 / N 2-Gas. </li><li> Zeigen Silizium-Master-Muster Seite nach oben in eine Petrischale. </li><li> Für eine Silizium-Master mit einer 2 cm x 2 cm Flächenmuster, Pipette 40 ul PUA auf die Musteroberfläche. </li><li> Legen Sie ein Blatt von 4 cm x 4 cm transparentem Polyester (PET) über das abgegebene PUA. </li><li> Drücken Sie auf die PET-Folie und die Ausbreitung der PUA unter dem Bogen über die Musterfläche mit einer Rolle oder Flachkantige Oberfläche (wie eine Karte), so dass der gesamteMuster durch die PUA-Prepolymer bedeckt. </li><li> Zeigen Silizium-Master, Prepolymer und PET etwa 10 cm unter einer 20 Watt (115 V) UV-Licht (λ = 365 nm) für 50 Sekunden. Um wirksam zu sein, kann das UV-Licht der Wellenlänge 310 bis 400 nm irgendwo zwischen sein. Die Intensität des Lichts 10-15 mW / cm 2 an der Oberfläche des Substrats. </li><li> Nach dem Aushärten entfernen PET-Folie mit einer Pinzette langsam. PUA sollte auf die PET-Folie mit einer negativen des Silizium-Master Nano befestigen. </li><li> Cure PUA / PET Nano unter UV für mindestens 12 Stunden vor der Verwendung. Überbelichtung ist nicht ein Problem. </li><li> So reinigen Silizium Meister, legen Sie eine weitere Folie aus PET auf dem Master ohne Zusatz von PUA und setzen UV-Licht (λ = 365 nm) für 50 sec und PET-Folie entfernen. Dadurch werden alle nicht umgesetzten Monomere zu entfernen. </li><li> Spülen Silizium-Master mit 100% Ethanol oder Xylol und trocken unter O 2 / N 2-Gas. </li></ol> 3a. Nanostrukturierung Polyurethan-Polymer </p&gt; <ol><li> Bereiten Durchmesser von 25 mm runden Glasobjektträger, indem sie in einer Ozonbehandlungskammer für 10 min. </li><li> Zeigen Ozon-behandelten Glasobjektträger auf kleine PDMS-Block für einfache Handhabung. </li><li> Eine dünne Schicht von Oberflächenhaftvermittler mit Pinsel auf Glasobjektträger. Air trockenen Glasobjektträger für 30 min. </li><li> Setzen Sie den Glasobjektträger auf einem Stück Druckerpapier. </li><li> Lassen Sie verzichten 10 ul von Polyurethan (PU) Pre-Polymer (NOA 76) bis zur Mitte des Glasträger. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind nach der Zugabe. </li><li> Platz PUA Form, Muster Gesicht nach unten, auf den Glasträger. Dispergieren des PU gleichmäßig über die Oberfläche der Glasplatte durch Walzen eines Walzengummizylinder entlang der PUA Form. Druckerpapier wird Polymer Lauf absorbieren. </li><li> Watt UV Lampe. Polymerisation Zeitpunkt der PU ist abhängig von Leistung von UV-Quelle. </li><li> Entfernen Sie die Probe von UV-Lichtquelle und vorsichtig schälen die PUA-Form aus PU-beschichteten Objektträger. Die Polymerisation des PU wird als complete wenn die PUA Formschalen sauber von der Probe und die PU-Objektträger aus Glas hat eine schillernde Erscheinung. </li><li> Platzieren abgeschlossen Proben Exsikkator zur Lagerung solange einen Monat. </li></ol> 3b. Nano Poly (lactid-co-glycolid)-Hydrogel <ol><li> Erstellen Sie einen Flach PDMS-Form durch kräftiges Mischen Silikonelastomer Basis-und Silikon-Elastomer Härter in einem Verhältnis von 10:1. </li><li> Gießen gemischten Vorläufer PDMS-Lösung in eine Petrischale, so dass der PDMS-Vorstufe erreicht 5 mm den Rand der Schale (also so, dass die PDMS ist 5 mm dick). </li><li> Zeigen Petrischale und PDMS-Vorläufer in einem Exsikkator für 1 h entgast. </li><li> Petrischale bewegen und PDMS-Vorläufers in einem 65 ° C Ofen für mindestens 2 Stunden aushärten. </li><li> Nach PDMS ausgehärtet ist, verwenden Sie einen Rasierer, um die flachen PDMS in 3 cm x 3 cm quadratische Abschnitte geschnitten. Diese werden die flachen Formen PDMS später in der Strukturierungsprozess verwendet wird. </li><li> Saubere 25 mm Durchmesser kreisförmige Glasobjektträger durch placing in Isopropylalkohol für 30 Minuten in einem Wasserbad-Beschallungs. </li><li> Trocken gereinigt Glasobjektträger unter O 2 / N 2-Gas. </li><li> Drop werden 100 ul PLGA-Lösung (15% w / v PLGA in Chloroform) auf Glasobjektträger. </li><li> Legen Sie einen flachen PDMS-Form auf der Oberseite der abgegebenen PLGA, um das Lösungsmittel zu absorbieren und zu erhalten, eine flache Oberfläche PLGA. Tragen Sie einen leichten Druck (~ 10 kPa), indem Sie einen 200 g Gewicht auf der PDMS für 5 min. </li><li> Langsam lösen sich flach PDMS-Form und legen Sie das Deckglas auf einer vorgewärmten Platte (120 ° C) für 5 min auf Restlösemittel zu entfernen und erhöhen die Haftung zwischen der PLGA und dem Deckglas. </li><li> Setzen Sie den NP PUA Form auf der Oberseite des Flach PLGA und gelten konstanten Druck (~ 100 kPa) und Hitze (120 ° C), indem Sie einen 1 kg-Gewicht auf der Oberseite des PUA-Form, während auf der Heizplatte für 15 min. </li><li> Entfernen Sie das Gewicht von PLGA Deckglas und lassen Sie die Substrate auf Raumtemperatur abkühlen. Sie PUA Form erst entfernen, wenn die Substrate wurdenabgekühlt. </li><li> Nachdem die Substrate ausreichend abgekühlt sind, vorsichtig abziehen der NP PUA Form und enthüllt die PLGA NP Substrat. Der NP PLGA Substrat sollte ein schillerndes Aussehen haben. </li><li> Platzieren abgeschlossen Proben Exsikkator zur Lagerung solange einen Monat. </li></ol> 4. Zellaussaat und Kultur HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Kultur der neonatalen Ratten-Kardiomyozyten (NRVMs) und H7 mit menschlichen embryonalen Stammzellen abgeleitete Kardiomyozyten (hES-CMs), aber andere Zellquellen verwendet werden. <ol><li> Bringen Sie die Deckgläser ANF (PU oder PLGA) zu einem 35-mm-Gewebekulturschale Polystyrol. Je 20 ul Norland Optical Adhesive (NOA83H) an den Boden der Schale und vorsichtig platzieren Sie die ANF Deckglas auf der NOA. Lassen Leim, um sich auszubreiten und decken gesamte Deckboden. Cure NOA indem Gericht für 10 min UV. </li><li> Sterilisieren ANF durch Spülen mit 2 ml 70% ige wässrige Ethanollösung für 5 Minuten, zweimal. E entfernenthanol durch Aspiration. Lassen ANF vollständig an der Luft trocknen für ca. 1 Stunde unter der UV-Sterilisationslampe (λ = 200-290 nm) in der biologischen Sicherheitsschrank. </li><li> Zelladhäsion wird durch Beschichten der in Fibronektin ANF Nacht verbessert. Verdünnen Fibronektin in DI Wasser auf 5 ug / ml. Pipette 2 ml Fibronektin-Lösung in die Schüssel. Legen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht (mindestens 6 h). </li><li> Erhalten NRVMs, hES-CMs oder andere Herzzellen von Interesse nach den bisherigen Protokollen 22. </li><li> Zentrifuge Zellprobe bei 1.000 UpM für 3 Minuten, um die Zellen zu pelletieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration. Stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht zu stören. </li><li> Die Zellen in geeigneten Kulturmedien in einer Konzentration von 4,6 × 10 6 Zellen / ml. </li><li> Beim Pipettieren von 200 ul Zellsuspension auf sterilisiert ANF. Stellen Sie sicher, Zellsuspension auf dem Deckglas bleibt. </li><li> Platzieren Zellen bei 37 ° C und 5%CO 2 für 4 Stunden, damit Zellen auf ANF befestigen. </li><li> 2 ml warmes Kulturmedien unter den gleichen Bedingungen austeilen und ersetzen Zellen im Inkubator. </li><li> Nach 24 Stunden zu entfernen Medien und waschen mit 2 ml DPBS zweimal, um überschüssige Zellen zu entfernen. </li><li> 2 ml warmes Kulturmedien unter den gleichen Bedingungen austeilen und ersetzen Zellen im Inkubator. Kultur die Zellen bis zur Konfluenz. Ersetzen Medien jeden zweiten Tag. </li></ol>

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+cues+regulate+the+structure+and+function+of+macroscopic+cardiac+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).</li>
<li>Tulloch, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Engineered+Human+Myocardium+With+Mechanical+Loading+and+Vascular+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture.</a> Circulation Research. 109, 47-59 (2011).</li>
<li>Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Cultures+With+Controlled+Macroscopic+Anisotropy%3A+A+Model+for+Functional+Electrophysiological+Studies+of+Cardiac+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle.</a> Circulation Research. 91, (2002).</li>
<li>Fink, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stretch+of+engineered+heart+tissue+induces+hypertrophy+and+functional+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement.</a> The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).</li>
<li>Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+Engineering+the+Cell+Surface+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exploring and Engineering the Cell Surface Interface.</a> Science. 310, (2005).</li>
<li>Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+engineering+of+biomimetic+surfaces%3A+cues+from+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix.</a> Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).</li>
<li>Lü, J. -M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+research+and+clinical+applications+of+PLGA-based+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).</li>
<li>Kim, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+nanotopography+as+a+regulator+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrix nanotopography as a regulator of cell function.</a> The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).</li>
<li>Park, J., Kim, H. -N., Kim, D. -H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Combined+Effect+of+Substrate+Rigidity+and+Topographic+Guidance+on+Cell+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.on+Nanobioscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology.</a> IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).</li>
<li>Kim, D. -H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -M., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Nanopatterns+as+Enabling+Tools+for+Analysis+and+Control+of+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells.</a> Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).</li>
<li>Kim, D. -H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+Platforms+for+Cell+Mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).</li>
<li>Kim, D. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopatterned+cardiac+cell+patches+promote+stem+cell+niche+formation+and+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration.</a> Integr Biol. 4, 1019 (2012).</li>
<li>Kim, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+nanostructures+of+polyethylene+glycol+for+applications+to+protein+adsorption+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion.</a> Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).</li>
<li>Hwang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Assays+of+Endothelial+Cells+on+Nanopatterned+Surfaces+within+a+Microfluidic+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel.</a> Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).</li>
<li>Heidenreich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forecasting+the+Future+of+Cardiovascular+Disease+in+the+United+States%3A+A+Policy+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, 933-944 (2011).</li>
<li>Legrice, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+structure+of+the+heart%3A+ventricular+myocyte+arrangement+and+connective+tissue+architecture+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).</li>
<li>Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+MR+tractography+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Diffusion MR tractography of the heart.</a> J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Fluxes+Involved+in+Control+of+Cardiac+Myocyte+Contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction.</a> Circulation Research. 87, 275-281 (2000).</li>
<li>Mohrman, D. E., Heller, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohrman%2C+DE+%22Cardiovascular+Physiology%22">Cardiovascular Physiology</a>. , McGraw Hill Medical. (2010).</li>
<li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+De+Novo+Cardiomyocytes%3A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation+and+Direct+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming.</a> Stem Cell. 10, 16-28 (2012).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Cardiomyocytes+Derived+From+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Circulation Research. 104, (2009).</li>
<li>Qian, J. -Y., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cytosolic+Ca2%2B+dynamics+in+cultured+Guinea+pig+cardiomyocytes+as+an+in+vitro+model+to+identify+potential+cardiotoxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants.</a> Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).</li>
<li>You, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistically+Enhanced+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+by+Culture+on+Nanostructured+Surfaces+with+Induction+Media%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media.</a> Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).</li>
<li>Kim, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotopography-guided+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).</li>
<li>Mannix, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomagnetic+actuation+of+receptor-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction.</a> Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).</li>
<li>Karuri, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+length+scale+topography+enhances+cell-substratum+adhesion+of+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells.</a> J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).</li>
<li>Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+cell+adhesion+by+nanoscale+RGD+organization+and+mechanical+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus.</a> J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).</li>
<li>Yim, E. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern-induced+changes+in+morphology+and+motility+of+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).</li>
<li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+human+mesenchymal+cell+differentiation+using+nanoscale+symmetry+and+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder.</a> Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).</li>
<li>Park, J., Bauer, S., Mark, von der K., Schmuki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanosize+and+Vitality%3A+TiO+2Nanotube+Diameter+Directs+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate.</a> Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).</li>
<li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).</li>
<li>Tung, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+arrhythmias+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of arrhythmias in tissue culture.</a> Journal of Electrocardiology. 39, (2006).</li>
<li>Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+arrhythmias+in+the+cardiomyocyte+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer.</a> Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).</li>
<li>Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+dynamic+in+vivo+environments+with+stimuli-responsive+materials+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture.</a> Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).</li>
<li>Henderson, D. J., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+and+Structure+of+the+Ventricles+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart.</a> Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).</li>
<li>Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Micropatterned+Cardiac+Cell+Cultures+with+Realistic+Ventricular+Microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysj%22%5BJournal%5D)">Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure.</a> Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).</li>
<li>Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+Assembly+by+Rotary+Jet-Spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning.</a> Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).</li>
<li>Rao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microgrooved+culture+substrates+on+calcium+cycling+of+cardiac+myocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).</li>
</ol>

Autoren haben nichts offenzulegen.

Funktionell reifen Herzgewebe fehlen sowohl in vivo und in-vitro-Anwendungen von Herzgewebe Technik. Die hier beschriebenen Methoden sind CFL Nanofabrikation robuste Techniken zur Erreichung zelluläre Ausrichtung und Einfluss makroskopischen Gewebefunktion aufgrund der Skalierbarkeit des Systems. Große Flächen können einfach strukturiert und für die Zellkultur eingesetzt werden. Makroskopische zelluläre Ausrichtung ist notwendig, um biomimetische, funktionelles Gewebe, da sie sowohl mechanische und ele...

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in der Welt und stellen eine gewichtige sozioökonomische Belastung für eine bereits angespannte globale Gesundheitssystem 1,17. Cardiac Tissue Engineering hat zwei unterschiedliche Ziele: (1), um beschädigte Herzmuskel nach einem ischämischen Kardiomyopathie Krankheit oder regenerieren oder (2), um eine High-Fidelity-Modell des Herzens für die in vitro Wirkstoff-Screening oder Krankheit Modellierung zu erstellen. Das Herz ist ein komplexes Organ, das ständig arbeiten muss, um Blut in den Körper zu versorgen. Dicht gepackte Schichtstrukturen von Kardiomyozyten und Stützgewebe werden in spiralförmigen Muster in der gesamten Herzwand 18,19 angeordnet. Das Herz wird auch elektromechanisch in einem sehr koordiniert, effizient Blut auswerfen, um den Körper 20 21 gekoppelt. Mehrere große Hürden angesprochen werden, jedoch vor komplizierten Design der Natur zuverlässig in vitro rekapituliert werden.Erste, wenn auch robust Kardiomyozytendifferenzierung Methoden weiterentwickelt werden 22, hpSC-CMs noch zeigen eher unreifen Phänotypen. Die elektromechanischen Eigenschaften und Morphologie am ehesten entsprechen fetalen Ebenen 23. Zweitens, wenn in der traditionellen Kulturbedingungen gehalten, sowohl Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen und Grund nicht, in native, gewebeartigen Strukturen zusammenzubauen. Vielmehr Zellen werden zufällig ausgerichtet und nicht die gebändert stabförmige Aussehen der Erwachsenenherzmuskel 24 aufweisen. Die extrazelluläre Matrix (ECM), mit der Umgebung interagieren Zellen spielt eine wichtige Rolle bei zahlreichen zellulären Prozessen 11,13,25. Das ECM aus komplexen, gut definierte Molekular und topographischen Signale, die die Struktur und Funktion von Zellen 6,26 signifikant beeinflussen. Innerhalb des Herzens, sich eng an die zugrunde liegenden zellulären Ausrichtung Nanometerbereich ECM Fasern 2. Die Auswirkungen dieser nanotopographsche Signale auf Zell-und Gewebefunktion ist jedoch weit von vollständig verstanden. Voruntersuchungen der Nanometerskala zell Biomaterial Interaktion zeigen die potentielle Bedeutung und Auswirkung Submikrometerbereich topographischen Signale für Zellsignal 27, 28-30 Adhäsion, Wachstum 31 und Differenzierung 32,33. Jedoch aufgrund der Schwierigkeit bei der Entwicklung von reproduzierbaren und skalierbaren nanofabricated Substrate, wie Untersuchungen konnte die Multiskalen zellulären Effekte des Komplexes in vivo ECM-Umgebung zu reproduzieren. In diesem Protokoll wird ein einfacher und kostengünstiger Nanofabrikation Technik, um Zellkultur Gerüste imitiert nativen Herz ECM Faserausrichtung erzeugen beschrieben, so dass für eine breite Palette von neuen Untersuchungen von Kardiomyozyten-Biomaterial-Interaktionen. Verstehen, wie Kardiomyozyten interagieren mit dem nanoskaligen ECM-Umfeld konnte für die Fähigkeit, das Zellverhalten zu nativem Gewebe genauer nachahmen Funktionen steuern könnention. Darüber hinaus sind Zellmonoschichten eine vereinfachte Experimentalsystem im Vergleich zu 3D-Strukturen, aber immer noch komplexen mehrzelligen Verhalten für aufschlussreiche Untersuchungen und funktionelles Screening 2,34-36 aufweisen. Schließlich könnten solche Gerüste verwendet, um zelluläre Transplantatfunktion zu verbessern, wenn in das Herz für regenerative Zwecke 37 implantiert werden.

<table><tbody><tr><td>Fibronektin</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>NOA 76</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>7606B</td><td></td></tr><tr><td>Oberflächenhaftungspromotor (Glasgrundierung)</td><td>Minuta Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PUA</td><td>Minuta Tech</td><td>MINS-311RM</td><td></td></tr><tr><td>Soft Rubber Roller Speedball</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafers</td><td>NOVA Electronic Materials</td><td>FA01-9900</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>Shipley</td><td>SPRT510</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist Entwickler</td><td>Shipley</td><td>MF320</td><td></td></tr><tr><td>Elektronenstrahl-Lithographie-System</td><td>JEOL</td><td>JBX-9300FS</td><td></td></tr><tr><td>Ätzsystem</td><td>Surface Technology Systems</td><td>NP10 8UJ</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Asher-System</td><td>BMR Technology Co.</td><td>DSF-200</td><td></td></tr><tr><td>Ozon-Härtungssystem</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-O- 08</td><td></td></tr><tr><td>Fusion Cure System</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-A 11</td><td></td></tr><tr><td>NOA 83H</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Laurel Technology</td><td>WS-400-6NPP</td><td></td></tr><tr><td>Skyrol PET Folie</td><td>SKC Co., Ltd.</td><td>23038-59-9</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Objektträger</td><td>Corning</td><td>2948</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>6/5/2553</td><td></td></tr><tr><td>Poly(D,L-Lactid-co-glycolid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978-1L</td><td></td></tr><tr><td>500 g Gewichte</td><td>Global Insustrial</td><td>T9FB503120</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Branson</td><td>B2510MTH</td><td></td></tr></tbody></table>

kapillar-force-lithographie für herz-tissue engineering

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Herz-Kreislauf-Krankheit bleibt die führende Todesursache weltweit ein. Cardiac Tissue Engineering hält viel Versprechen, bahnbrechende medizinische Erkenntnisse mit den Zielen der Entwicklung von funktionalen Geweben für die Herzregeneration sowie in-vitro-Screening-Tests zu liefern. Allerdings hat die Fähigkeit, High-Fidelity-Modelle von Herzgewebe zu erzeugen schwierig erwiesen. Das Herz der extrazellulären Matrix (ECM) ist eine komplexe Struktur, bestehend aus beiden biochemischen und biomechanischen Signale im Bereich von der Mikro-bis Nanometerskala 2. Lokale mechanische Belastung und der Zell-ECM-Interaktionen wurden vor kurzem als wichtige Komponenten in der Herzgewebetechnik 3-5 anerkannt. Ein Großteil des Herz ECM von ausgerichteten Kollagenfasern mit Durchmessern im Nanomaßstab, die Gewebearchitektur und elektromechanische Kupplung 2 maßgeblich beeinflusst besteht. Leider haben nur wenige Methoden have in der Lage gewesen, die Organisation der ECM-Fasern bis in den Nanometerbereich zu imitieren. Jüngste Fortschritte in der Nano Techniken haben jedoch die Konstruktion und Herstellung von skalierbaren Gerüste, die die in vivo strukturelle Steifigkeit und Substrat Signale des ECM im Herzen 6-9 imitieren aktiviert. Hier die Entwicklung stellen wir zwei reproduzierbar, kostengünstig und skalierbar Nano Verfahren zur funktionellen Ausrichtung der Herzzellen mit dem biokompatiblen Polymer Poly (lactid-co-glycolid) (PLGA) 8 und ein Polyurethan (PU)-basierten Polymers. Diese anisotrop nanohergestellte Substrate (ANF) imitieren die zugrunde liegenden ECM gut organisiert, ausgerichtet Gewebe und kann verwendet werden, um die Rolle der Nanotopographie auf die Zellmorphologie und Funktion 14.10 untersuchen. Mit Hilfe eines nanostrukturierten (NP) Silizium-Master als Vorlage wird eine Polyurethan-Acrylat (PUA) Form hergestellt. Diese PUA Form wird dann verwendet, pattern die PU-oder PLGA Hydrogel über UV-unterstützte oder Lösungsmittel-vermittelte Kapillarkraft Lithographie (CFL), bzw. 15,16. Kurz gesagt, PU-oder Pre-PLGA-Polymer-Fall auf einem Deckglas und der PUA Form wird auf die Spitze verzichtet. Für UV-unterstützte CFL, die PU wird dann mit UV-Strahlung (λ = 250-400 nm) zur Härtung ausgesetzt wird. Für Lösungsmittel-vermittelte CFL wird die PLGA mit Hitze (120 ° C) und Druck (100 kPa) eingeprägt. Nach dem Aushärten wird die Form PUA abgezogen und hinterließ eine ANF für die Zellkultur. Primärzellen wie neugeborenen Ratten Kardiomyozyten, sowie menschliche pluripotente Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen, kann auf der ANF 2 gehalten werden.

Fig. 1 ist eine schematische Übersicht des Herstellungsverfahrens für die beiden Herstellungsverfahren. Durch die Beugung des Lichts durch die nanoskaligen Topographie verursacht werden, sollten Nanostrukturierung in einem schillernden Oberfläche zu der ANF führen. Abbildung 2 zeigt diese irisierende Oberfläche auf einer gut strukturierten 25 mm NP-PU-Deckglas (2A) mit 800 nm Kamm und Nut Breite (Figur 2B). Die schillernde Erscheinung des ANF etwas abhä...

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten, die aus zwei unterschiedlichen Polymermaterialien mittels Kapillarkraftlithographie hergestellt werden. Die beschriebenen Methoden bieten eine skalierbare, kostengünstige Technik, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe für in vitro und in vivo Anwendungen zu entwickeln.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, biomimetische Zellkultursubstrate herzustellen, um die Struktur und Funktion makroskopischer kardialer Gewebe zu beeinflussen. Dies wird zunächst erreicht, indem ein Silikon-Abformkörper mit der gewünschten topografischen Architektur durch Tiefen-Reaktivionenätzen hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das gewünschte topografische Muster vom Silikon-Abformkörper mittels UV-unterstützter kapillarbasierter Kraftlithografie auf eine PUA-Form zu übertragen.Anschließend dient die PUA-Form als Vorlage zur Herstellung von Zellkultursubstraten aus verschiedenen polymeren Materialien – je nach gewünschter Anwendung – mittels UV-unterstützter oder lösungsvermittelter Kapillarkraftlithographie. Im letzten Schritt werden entweder primäre oder aus Stammzellen abgeleitete Kardiomyozyten auf die nanostrukturierten Zellkultursubstrate ausgesät, um anschließend analysiert zu werden. Abschließend werden Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um Veränderungen in der Zellmorphologie sowie in der Anordnung kontraktiler Proteine innerhalb der Kardiomyozyten sichtbar zu machen.Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie dem Mikro-Druckverfahren besteht darin, dass die Kapillarkraft-Lithografie nanostrukturierte Substrate für die Zellkultur erzeugt, die eine strukturelle Ausrichtung von Herzmuskelgewebe-Monolayern induzieren können, ohne auf Zellproliferation oder -migration angewiesen zu sein. Obwohl diese Methode Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung von Herzmuskelgewebe ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme wie die Krebs-Mechanobiologie angewendet werden. Um den Einfluss der Matrixtopographie auf die Zellmigration zu untersuchen, reinigen Sie zunächst die Oberfläche des Silikon-Abdrucks mit 100 % Ethanol oder Xylol und trocknen Sie sie unter Sauerstoff-Stickstoff-Gas. Als Nächstes das Silikon-Original mit der Musterseite nach oben in eine Petrischale legen; bei einem Silikon-Original mit einer zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter großen Oberflächenstruktur 40 Mikroliter PUA darauf pipettieren. Anschließend ein vier Zentimeter mal vier Zentimeter großes Stück transparente Polyesterfolie über das applizierte PUA legen, leicht auf die PET-Folie drücken und das PUA unter der Folie über die gesamte Musterfläche mit einer Rolle oder einer flachen Kante verteilen, sodass die gesamte Struktur mit dem PUA-Prepolymer bedeckt ist. Danach das Silikon-Original mit Prepolymer und PET-Folie etwa 10 Zentimeter unter eine 20-Watt-UV-Lampe stellen und 50 Sekunden belichten.Nach der Aushärtung die PET-Folie langsam mit einer Pinzette entfernen. PUA sollte an der PET-Folie mit einem Negativ des nanostrukturierten Silikon-Originals haften. Anschließend die P-U-A-P-E-T-Nanostrukturen vor der Verwendung mindestens 12 Stunden unter UV-Licht aushärten.Um die Silikon-Abformungen zu reinigen, legen Sie eine weitere PET-Folie auf den Abdruck, ohne PUA hinzuzufügen. Belichten Sie ihn 50 Sekunden lang mit UV-Licht und entfernen Sie anschließend die PET-Folie. Spülen Sie die Silikon-Abformung dann mit 100 % Ethanol oder Xylol und trocknen Sie sie unter Sauerstoff-Stickstoff-Gas ab. Behandeln Sie in diesem Verfahren kreisförmige Glasobjektträger mit einem Durchmesser von 18 mm, indem Sie sie 10 Minuten lang in eine Ozonkammer geben. Danach legen Sie die Objektträger auf Blöcke aus PDMS, um sie vorübergehend zur leichteren Handhabung zu sichern. Anschließend tragen Sie eine Schicht Glasprimer auf die Oberfläche des Glasobjektträgers auf.Lassen Sie den Primer 30 Minuten an der Luft trocknen. Legen Sie nun die Objektträger auf ein Stück Druckerpapier. Geben Sie 10 µL Polyurethan-Präpolymer in die Mitte jedes Objektträgers und stellen Sie sicher, dass keine Blasen entstehen.Danach das PUA-Formmuster mit der Musterseite nach unten auf den Objektträger legen und das PU-Präpolymer durch Abrollen einer Gummizylinderwalze entlang der PUA-Form gleichmäßig auf der Oberfläche des Objektträgers verteilen. Das Papier wird anschließend das überschüssige Polymer aufnehmen; danach erfolgt die UV-Aushärtung für 60 Sekunden unter einer 20-Watt-UV-Lampe. Anschließend die Probe von der UV-Lichtquelle entfernen und die PUA-Form vorsichtig von dem mit PU beschichteten Objektträger ablösen; die Polymerisation des PU gilt als abgeschlossen.Wenn sich die PUA-Form sauber von der Probe löst und die PU-Glasküvette einen irisierenden Glanz aufweist, stellen Sie die Proben zur Lagerung bis zu einem Monat in einen Trockenschrank. Befestigen Sie nun NFS-Deckgläser auf einer 35-Millimeter-Zellkulturschale aus Polystyrol und pipettieren Sie 20 Mikroliter NOA auf den Boden der Schale. Legen Sie das NPPU-Deckglas vorsichtig auf das NOA und lassen Sie den Klebstoff sich ausbreiten, sodass er die gesamte Unterseite des Deckglases bedeckt. Danach härten Sie das NOA aus, indem Sie die Schale 10 Minuten lang UV-Licht aussetzen.Als Nächstes sterilisieren Sie die NP-SUBSTRATE, indem Sie diese zweimal mit jeweils zwei Milliliter 70%iger wässriger Ethanol-Lösung über fünf Minuten spülen. Entfernen Sie das Ethanol durch Absaugen. Lassen Sie das A NFS etwa eine Stunde lang vollständig an der Luft unter der UV-Sterilisationslampe im biologischen Sicherheitswerkbank trocknen.Um die zelluläre Adhäsion zu verbessern, beschichten Sie das A NFS über Nacht mit Fibronectin, indem Sie Fibronectin zunächst mit destilliertem Wasser auf fünf Mikrogramm pro Milliliter verdünnen. Geben Sie anschließend zwei Milliliter der Fibronectin-Lösung mit einer Pipette in eine Petrischale. Stellen Sie dann das A NFS über Nacht in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2.NR-VMS, HESC-CMS oder andere gewünschte Herzzellen gewinnen, die Zellprobe drei Minuten lang mit 1000 U/min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren. Vorsichtig durch Absaugen den Überstand entfernen und darauf achten, das Pellet nicht aufzuwirbeln. Danach die Zellen in Kulturmedium erneut suspendieren, sodass eine Konzentration von 4,6 × 10⁶ Zellen pro Milliliter erreicht wird.Pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikroliter Zellsuspension auf die sterilisierte A NFS und stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension auf dem Deckglas verbleibt. Danach werden die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 in den Inkubator gestellt, damit sie sich an der A NFS anheften können. Anschließend werden zwei Milliliter zusätzliches, warmes Kulturmedium der Schale zugegeben und die Zellen erneut unter denselben Bedingungen in den Inkubator gestellt.Nach 24 Stunden das Medium entfernen und zweimal mit je zwei Milliliter DPBS waschen, um überschüssige Zellen zu entfernen. Danach zwei Milliliter warmes Kulturmedium in die Schale geben. Die Zellen unter den gleichen Bedingungen in den Inkubator stellen und weiterkultivieren.Die Zellen bis zur Konfluenz benötigen einen Medienwechsel alle zwei Tage. Diese Abbildung zeigt repräsentative Hellfeldaufnahmen von NR-Ventrikulomyozyten nach sieben Tagen Kultur und hESC-CMs. Nach 48 Stunden Kultur zeigen NR-Ventrikulomyozyten und hESC-CMs auf den NP-Oberflächen eine offensichtliche strukturelle Anisotropie und Ausrichtung, während Kardiomyozyten auf unstrukturierten Oberflächen zufällig orientiert sind.Die immunhistochemische Analyse verdeutlicht die Auswirkung der Nano-Topographie auf die zelluläre Zytoskelett-Ausrichtung, Aktin-Mikrofilamente und alpha-sarkomerisches Aktin. Auf A NFS kultivierte Zellen zeigen eine Ausrichtung entlang der Nano-Rillen, während sie auf ungeordneten Substraten zufällig verteilt bleiben. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Substrate vor der Zellseeding zu sterilisieren, da Kontaminationen nach der Entwicklung erhebliche Probleme verursachen können. Diese Technik ebnete Forschern in der kardiovaskulären Biologie den Weg, um die Herzmaturierung und aus Stammzellen abgeleitete Kardiomyozyten zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine biomimetische Zellkultur-Substrate mittels Kapillarkraftlithographie für Anwendungen im Bereich des kardialen Gewebe-Engineering herstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Wir stellen eine Methode zur mikrofluidischen Abscheidung von gemustertem Genipin und Fibronektin auf PDMS-Substraten vor, die eine erweiterte Lebensfähigkeit von Geweben mit vaskulären glatten Muskelzellen ermöglicht. Diese Gewebeherstellungsmethode wird mit der bisherigen vaskulären muskulären Dünnschichttechnologie kombiniert, um die Gefäßkontraktilität über krankheitsrelevante Zeitverläufe zu messen.

Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films

Dieses Manuskript beschreibt die Erstellung von definiertem manipuliertem Herzgewebe unter Verwendung von Oberflächenmarker-Expression und Zellsortierung. Die definierten Gewebe können dann in einem Multigewebe-Bioreaktor verwendet werden, um Mechanismen der kardialen Zelltherapie zu untersuchen, um ein funktionsfähiges, aber dennoch kontrolliertes Modellsystem des menschlichen Herzens bereitzustellen.

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

Wir bieten ein generalisiertes Protokoll basiert auf einer mikrofluidische Bioprinting Strategie für engineering-ein Microfibrous Kreislauf Bett, wo eine sekundäre Zelle Art weiter in den interstitiellen Raum dieser Microfibrous Struktur, vaskularisierte Gewebe und Organellen zu generieren ausgesät werden konnte.

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode zur Herstellung von benutzerdefinierten Polydimethylsiloxan-Formen, die für die Herstellung von Hydrogel-basierte Technische Gewebe mit komplexen Geometrien verwendet werden können. Wir beschreiben außerdem Ergebnisse aus mechanischen und histologischen Bewertungen auf veränderter kardialen Gewebe hergestellt, mit dieser Technik durchgeführt.

Custom-Engineered Tissue Culture Formen von gelasert meistern

Dieses Protokoll führt eine lithographiefreie Mikromustermethode ein, die einfach und zugänglich für Personen mit einem begrenzten Bioengineering-Hintergrund ist. Diese Methode verwendet maßgeschneiderte lasergeschnittene Schablonen, um extrazelluläre Matrixproteine in einer Form von Interesse für die Modulation von Zellmorphologien mikromustern zu lassen. Das Verfahren zur Mikromusterung wird mit induzierten pluripotenten Stammzellabgeleiteten Kardiomyozyten demonstriert.

Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Künstliche Gewebe sind stark auf geeignete vaskuläre Netzwerke angewiesen, um lebenswichtige Nährstoffe und Gase bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. In dieser Arbeit erstellt ein schrittweises Seeding-Protokoll von Endothelzellen und Stützzellen hochorganisierte vaskuläre Netzwerke in einer Hochdurchsatzplattform, um das Entwicklung des Gefäßverhaltens in einer kontrollierten 3D-Umgebung zu untersuchen.

Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße

Dreidimensionale Herzgewebe, die mit aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten biotechnologisch hergestellt wurden, haben sich als vielversprechende Modelle für die Untersuchung von gesundem und krankem menschlichem Myokard in vitro erwiesen und gleichzeitig Schlüsselaspekte der nativen Herznische rekapituliert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Analyse von High-Content-Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden.

Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Die Steuerung von Herzzellen und -gewebe mit Licht ermöglicht eine berührungslose Stimulation, wodurch der natürliche Zustand und die Funktion der Zellen erhalten bleiben, was sie zu einem wertvollen Ansatz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen macht.

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

Es wird eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von 3D-Myokardgeweben vorgestellt, bei der MEW-Gerüste (Melt Electrospinning Writing), Polycaprolacton (PCL)-Gerüste und Fibrin-Hydrogele mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und Fibroblasten kombiniert werden. Diese Technik bietet eine präzise Kontrolle über die Gerüstarchitektur und kann in präklinischen Arzneimitteltests und bei der Modellierung von Herzerkrankungen eingesetzt werden.

3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Erfahren Sie die Herstellung biomimetischer Zellkultursubstrate mittels Kapillar-Force-Lithographie für das Herz-Tissue-Engineering. Diese Methode ermöglicht präzise Strukturierung für Kardiomyozyten-Analysen.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

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