Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging
19. November 2012
Wir stellen eine Methode zur Schaffung eines ausgedünnten Schädel kortikale Fenster (TSCW) in einem Mausmodell für In vivo OCT-Bildgebung der Großhirnrinde.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein dünnes Schädelschädelfenster in einem Mausmodell für die optische Kohärenztomographie des Gehirns in vivo zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem das Tier zunächst betäubt und auf die Operation vorbereitet wird. Als nächstes dünnen Sie den Schädel mit verschiedenen Zahnfräsern aus.
Der letzte Schritt besteht darin, OCT-Bilder des Gehirns in vivo durch das dünne Schädelschädelfenster zu erhalten. Letztendlich können aus den resultierenden OCT-Bildern strukturelle und funktionelle Informationen über das Gehirn gewonnen werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Kraniektomie oder Deckglasfenstern besteht darin, dass das Finical Window weniger invasiv ist und mit größerer Wahrscheinlichkeit die biologische Integrität und Lebensfähigkeit des Gehirns erhält.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose neurologischer Erkrankungen, da die OCT eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung bietet und im Vergleich zur konfokalen und Zwei-Photonen-Mikroskopie eine überlegene Tiefenpenetration bietet. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, eine gleichmäßig dünne Schädeloberfläche zu schaffen, ohne Schädelfrakturen oder subdurale Blutungen zu verursachen. Um dieses Verfahren zu beginnen, betäuben Sie eine Zöliakie-1-Maus im Alter von sechs bis acht Wochen mit einer intraperitonealen Injektion einer Kombination aus Ketamin und Xylazin.
Legen Sie dann die Maus auf ein homöo-themisches Pad oder eine Decke, um während der chirurgischen Vorbereitung die optimale Körpertemperatur von ca. 37 Grad Celsius zu gewährleisten, überwachen Sie kontinuierlich das Anästhesieniveau, indem Sie die Reflexe des Tieres testen, und injizieren Sie bei Bedarf mehr Anästhesie. Als nächstes befeuchten Sie beide Augen mit der künstlichen Tränensalbe. Entfernen Sie die Haare auf der Kopfhaut mit der Haarschneidemaschine.
Entfernen Sie dann die restlichen abgeschnittenen Haare mit einem verheirateten Pad oder Tupfer. Tragen Sie danach eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die Kopfhaut auf. Wischen Sie nach zwei Minuten die Creme und die restlichen Haare vorsichtig mit Kochsalzlösung, angefeuchteten Wattestäbchen und Alkoholvorbereitungskiden ab.
Desinfizieren Sie nun die Kopfhaut mit einem Betadine-Tupfer und reinigen Sie sie mit 70%igen Ethanol-Vorbereitungspads. Montieren Sie dann das Tier auf einen stereotaktischen Rahmen, um den Schädel ruhig zu stellen. Klopfen Sie leicht auf den Schädel, um seine Stabilität zu gewährleisten.
Beginnen Sie bei diesem Verfahren den Schnitt der Kopfhaut an der Mittellinie zwischen den Augen. Fahren Sie mit dem Schwanz weiter bis zum Mittelpunkt zwischen den Ohren, die Haut wird mit einer Pinzette gelappt. Lokalisieren Sie als Nächstes den Bereich, der ausgedünnt werden soll, unter einem Präpariermikroskop.
Kratzen Sie den Schädel mit einer Pinzette ab, um alle Faszienreste zu entfernen. Trocknen Sie dann den Schädel mit sterilen Wattestäbchen, bevor Sie ein vier mal vier Millimeter dünnes, kortikales Fenster etwa einen Millimeter hinteres und laterales Torema erstellen. Verwenden Sie einen chirurgischen Handbohrer mit einem runden Hartmetallfräser in einer leicht schwingenden Bewegung, um den Schädel zu verdünnen.
Üben Sie keinen direkten Druck auf den Schädel aus. Hören Sie alle 20 bis 30 Sekunden auf zu bohren, um Knochenstaub mit steriler Kochsalzlösung und Wattestäbchen zu entfernen und eine Überhitzung des Schädels zu vermeiden. Die Kochsalzlösung hilft auch dabei, die Wärme im gesamten Schädel abzuleiten.
Sobald die äußere Schicht des kompakten Knochens vollständig entfernt ist, sollte die mittlere schwammige Knochenschicht sichtbar sein. Es kann zu leichten Blutungen kommen, da die Blutgefäße in der schwammigen Knochenschicht deutlicher sichtbar sind. Wechseln Sie zu einem grünen Steingrat und bohren Sie mit besonderer Vorsicht weiter.
Da die schwammige Schicht empfindlicher ist, entfernt der grüne Steingrat weniger Knochenmaterial und sorgt gleichzeitig für Ebenheit im gesamten Schädelfenster. Hören Sie gelegentlich auf zu bohren, um Knochenstaub zu entfernen und den Schädel zu kühlen. Schließlich, wenn der Schädel durchsichtiger geworden ist und das Gefäßsystem am Gehirn sichtbar ist, beginnen Sie, den Schädel mit einem Polierbohrer zu polieren, überprüfen Sie die Dicke des Schädels, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette darauf klopfen, und hören Sie auf zu polieren.
Wenn der Schädel leicht flexibel wird, sollte das ausgedünnte Schädelfenster nun völlig glatt und reflektierend sein und bereit für die Bildgebung sein. Aufgrund der Beschaffenheit des stark zerstreuten Gewebes des Gehirns sollte der Schädel für eine optimale Tiefenpenetration auf mindestens 55 Mikrometer verdünnt werden. Überprüfen Sie nach Abschluss der Operation die Atemfrequenz des Tieres durch visuelle Inspektion und Reflexe, um das richtige Anästhesieniveau sicherzustellen, und verabreichen Sie eine zusätzliche Anästhesie. Falls erforderlich, legen Sie das Tier unter die OCT-Kamera und positionieren Sie dann das dünne Schädelschädelfenster unter dem optischen Strahl.
Eine Schnittansicht des Schädels und des Gehirns kann nun visualisiert werden. Die Datenerfassung kann beginnen. Sobald der interessierende Bereich für die Bildgebung lokalisiert ist, haben wir den OCT-Strahl über ein bildgebendes kortikales Fenster mit einer Breite von 4,0 Millimetern gescannt und erhalten eine Bildtiefe von zwei Millimetern mit sechs Milliwatt einfallender Leistung und einem Brennpunkt von 0,1 Millimetern unterhalb des dünnen Schädels.
Jeder Querschnitt bestand aus 2048 axialen Scans mit einer Erfassungsrate von 0,14 Sekunden pro Bild. Diese spezielle Methode hat es uns ermöglicht, bestimmte Strukturen in unseren OCT-Schnittbildern zu identifizieren. Diese Abbildung zeigt ein para-sagittales OCT-Bild des Kortex unter einem normalen Schädel, und hier ein para-sagittales OCT-Bild unter einem dünnen Schädel.
Die Strukturen des Gehirns sind unter einem dünnen Schädelfenster visuell besser sichtbar als unter einem normalen Schädel. Zusätzlich wird ein koronales Querschnittsbild der OCT erstellt, um die Identifizierung von Mittellinienstrukturen zu erleichtern. Volumetrische Scans des Gehirns können auch durch Sammeln einer Reihe von 2D-Schnittbildern erhalten werden, indem zwei Sätze von Gal-O-Spiegeln für die XY-Abtastung verwendet werden, wobei der erste Gal-O-Spiegel den Strahl in sagittaler Richtung und der zweite Gal-Spiegel die koronale Richtung abtastet.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in 10 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, den Schädel gleichmäßig zu verdünnen, um eine ausreichende Signaldurchdringung während der OCT-Bildgebung zu gewährleisten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein dünnes kortikales Schädelfenster für OCT-Bildgebungszwecke vorbereiten.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Erstellung eines dünnwandigen Schädel-Fensters (TSCW) in einem Mausmodell vor, die die in-vivo-Bildgebung der Hirnrinde mittels optischer Kohärenztomographie (OCT) ermöglicht. Die Technik ist so konzipiert, dass sie weniger invasiv ist als herkömmliche Methoden und die biologische Integrität des Gehirns erhält.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Bildgebende Verfahren
- In-vivo-Studien
Hintergrund
- Die optische Kohärenztomographie (OCT) ist eine nichtinvasive Bildgebungstechnik.
- Herkömmliche Methoden wie die Kraniectomie können invasiver und schädlicher sein.
- Die Aufrechterhaltung der Gehirnviabilität während der Bildgebung ist entscheidend für genaue Ergebnisse.
- Die dünnschädelige Methode zielt darauf ab, diese Probleme zu adressieren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer weniger invasiven Methode zur Bildgebung des Gehirns.
- Verbesserung der Lebensfähigkeit des Gehirns während bildgebender Verfahren.
- Gewinnung struktureller und funktioneller Informationen aus OCT-Bildern.
Verwendete Methoden
- Anästhesie des Mausmodells vor der Operation.
- Ausdünnen des Schädels mit Zahnbohrern.
- Gewinnung von OCT-Bildern durch den ausgedünnten Schädel.
- Beurteilung struktureller und funktioneller Informationen des Gehirns anhand der Bilder.
Hauptergebnisse
- Die Methode mit dem dünn geschliffenen Schädel ermöglicht erfolgreich die In-vivo-Bildgebung.
- Die gewonnenen Bilder liefern wertvolle strukturelle und funktionelle Erkenntnisse.
- Die Technik zeigt vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich der Aufrechterhaltung der Gehirnviabilität.
- Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ist sie weniger invasiv und verursacht dadurch weniger Schäden.
Schlussfolgerungen
- Das dünngeschliffene kortikale Fenster ist eine geeignete Alternative für die Bildgebung des Gehirns.
- Diese Methode verbessert die Möglichkeit, die Gehirnfunktion in vivo zu untersuchen.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf verschiedene neurologische Studien ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Technik ermöglicht eine minimalinvasive, longitudinale Bildgebung der kortikalen Struktur und Funktion in vivo und unterstützt die Zielvalidierung in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen. Durch die Erhaltung der Gehirnintegrität erhöht sie das Vorhersagevertrauen in präklinischen Studien und verringert die biologische Variabilität, die die Beurteilung von Arzneimittelwirkungen verfälschen kann. Die Methode stellt eine wiederverwendbare Plattform für die mechanistische Risikominderung in frühen Entdeckungsprozessen dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch longitudinelle strukturelle und funktionelle kortikale Bildgebung.
- Operationaler Wert: Bietet ein krankheitsrelevantes System zur Beurteilung der Zielstrukturen und der Modulation von Signalwegen über die Zeit.
- Predictive Value: Unterstützt die Biomarker-Korrelation und die Bereitschaft für phänotypische Screening-Verfahren, indem quantitative, hochauflösende strukturelle Messwerte bereitgestellt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoffbewertung mit konsistentem optischem Zugang vor.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays durch einheitliches Schädelverdünnen und stabile Bildgebungsfenster.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg und reduziert so den Aufwand pro Versuchstier.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem Bildgebung in intakten, physiologisch aktiven kortikalen Netzwerken ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Unterstützt die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mit minimalem prozeduralen Drift.
- Risikominderung: Verringert störende Variablen durch chirurgisches Trauma und verbessert so die Datenzuverlässigkeit für Go/No-Go-Entscheidungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein und liefert strukturelle und funktionelle Bildgebungsdaten, die zum mechanistischen Verständnis und zu den Wirkungen von Verbindungen beitragen.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch wiederholte in-vivo-Bildgebung kortikaler Reaktionen auf Störungen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Fensterpräparation und stabile Signalpenetration für langzeitliche Wirkstoffscreenings.
- Analytik: Erzeugt quantitative abhängige Messgrößen, einschließlich Kortikaldicke, vaskuläre Dichte und Abgrenzung struktureller Schichten, für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem die kortikale Vitalität erhalten bleibt und eine Korrelation mit verhaltensbezogenen oder molekularen Endpunkten ermöglicht wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Bildgebungsplattform statt als terminales Verfahren und unterstützt langzeitliche Studiendesigns über mehrere experimentelle Ansätze hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unschärfen durch direkte, wiederholte Visualisierung der kortikalen Mikrostruktur verringert werden.
- Operativer Wert: Verbessert Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch definierte Ausdünnungsprotokolle und visuelle Endpunkt-Kriterien.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitalnutzungseffizienz, indem mehrere Datenpunkte pro Versuchstier ermöglicht werden, was den Tierversuchseinsatz reduziert und die statistische Aussagekraft erhöht.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem frühe strukturelle und funktionelle Messgrößen bereitgestellt werden, die mit dem Potenzial zur Krankheitsmodifikation korrelieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrochirurgischen Techniken sowie Erfahrung mit stereotaktischer Fixierung und der Anwendung eines Zahnbohrers.
- Basiert auf dem Zugang zu spektralbereichsbasierten OCT-Systemen mit geeigneter Scan-Software und galvanometrischer Spiegelsteuerung für die volumetrische Aufnahme.
- Benötigt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen chirurgischen, bildgebenden und analytischen Teams, um eine gleichbleibende Qualität der Fenster und eine konsistente Dateninterpretation sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungen bei verschiedenen Mausstämmen und Altersgruppen, da sich die Schädeldicke und die Heilungsreaktion unterscheiden können.
- Eingeschränkt durch den Bedarf an technischem Geschick, um beim Ausdünnen des Schädels Frakturen oder subdurale Blutungen zu vermeiden, die die Signalqualität und das Wohlergehen der Tiere beeinträchtigen können.
