Whole Berg RNA Fluorescent In situ Hybridisierung Drosophila Embryonen

Dieses Verfahren beschreibt eine optimierte Fischmethode zur Beurteilung von Expressions- und Lokalisationsmerkmalen von RNA in ganzen Drosophila-Embryonen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine markierte RNA-Sonde synthetisiert wird, die komplementär zu einer Mr NA oder einer nicht beschichteten RNA von Interesse ist, indem in vitro eine entsprechend ausgewählte DNA-Matrize transkribiert wird. Parallel dazu werden Käfige für Fliegenpopulationen verwendet, um Embryonen des gewünschten Entwicklungsstadiums zu entnehmen, zu fixieren und zu permeieren.

Nach mehreren Schritten nach der Fixierung werden die Embryonen mit der markierten Antisense-RNA-Sonde hybridisiert. Nach ausgiebigem Waschen der Proben wird die hybridisierte Sonde schließlich durch Immunmarkierung mit einem spezifischen Antikörper und Fluorochrom-konjugierten Detektionsreagenzien detektiert, wodurch eine empfindliche Auslesung der Ziel-RNA-Verteilung ermöglicht wird. Letztendlich liefern die Ergebnisse hochaufgelöste Fluoreszenzsignale, die mit Hilfe der Standard-Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden, um die räumlichen und zeitlichen Expressionsmerkmale der Ziel-RNA während der Drosophila-Embryogenese zu dokumentieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Northern Blot oder R-T-P-C-R besteht darin, dass die RNA-Expression in intakten Gewebeproben beurteilt werden kann. Während diese Methode für die Analyse der RNA-Expressionseigenschaften in frühen Drosophila-Embryonen gedacht ist, kann sie auch für die Analyse von Embryonen in späteren Entwicklungsstadien von Gewebe eingesetzt werden, das von Larven oder adulten Fliegen präpariert wurde. Ein wichtiger Aspekt unseres Verfahrens ist die Hochskalierung der Probenzahl, die wir durch die Durchführung von Fischen im PCR-Ort erreichen können, was den Durchsatz des Ansatzes erheblich erhöht.

Zu den Mitgliedern des Labors, die dieses Verfahren demonstrieren, gehören Studenten im Grundstudium, Doktoranden und Postdoktoranden. Beginnen Sie mit gut gefütterten Käfigen. Ersetze den Teller durch einen Apfelsaft-Hefeteller und lass die Fliegen eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius stehen.

Setze dann die Apfelsaft-Hefeplatte wieder auf, um Embryonen im Frühstadium zu entnehmen. Inkubieren Sie den Käfig bei 25 Grad Celsius und warten Sie, bis das gewünschte Entwicklungsstadium der Embryonen erreicht ist, während Sie in einer chemischen Haube warten, und mischen Sie die Chemikalien, um 37% Formaldehyd in einem Inhalationsfläschchen aus Glas herzustellen. Kochen Sie die Lösung, bis sich das PFA-Pulver vollständig aufgelöst hat.

Kühlen Sie es dann auf Raumtemperatur ab und filtrieren Sie es in ein neues Szintillationsfläschchen. Bereiten Sie als Nächstes eine zweiphasige Fixierungslösung vor. Kombinieren Sie PBS mit 37 % Formaldehyd in einem Szintillationsfläschchen und fügen Sie dann Heptan hinzu, wenn es fertig ist.

Ernten Sie die Embryonen von der Apfelsaftplatte mit Zimmertemperatur, Leitungswasser und vorsichtigem Kehren mit einem feinen Pinsel. Übertragen Sie die resuspendierten Embryonen in einen Korb und spülen Sie sie mit lauwarmem Leitungswasser ab. Enthüllen Sie nun die Embryonen für 90 Sekunden, indem Sie den Korb in einer frischen 3%igen Bleichlösung baden.

Anschließend entfernst du das Bleichmittel mit lauwarmem Leitungswasser, bis der Bleichmittelgeruch verschwunden ist. Um die Embryonen zu entnehmen, zerlegen Sie den Entnahmekorb und übertragen Sie die Embryonen vorsichtig in die biphasische Fixierlösung. Mit dem Pinsel sammeln sich die Embryonen an der Grenzfläche zwischen der PBS- und der Heptanschicht an.

Verschließen Sie nun die Szintillationsfläschchen, befestigen Sie sie an einem Vortex-Mischer und schütteln Sie sie 20 Minuten lang auf niedrigster Stufe. Entsorgen Sie nach dem Schütteln die meisten der unteren PBS- und oberen Heane-Phasen mit einer Weidepipette. Aspirieren Sie dann die restliche Mischung in die Pipette und lassen Sie die untere Phase vorsichtig aus, ohne die Embryonen zu verlieren.

Geben Sie die Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das eine biphasische Lösung aus 500 Mikrolitern Heptan und 500 Mikrolitern Methanol enthält. Schütteln Sie den Schlauch 30 bis 45 Sekunden lang kräftig, um die Patellamembranen zu knacken. Nach dem Knacken sinken die Embryonen in das Methanol.

Entsorgen Sie die obere Phase und die uncrackten Embryonen und fügen Sie einen Milliliter Methanol hinzu. Schütteln Sie nun das Röhrchen fünf Sekunden lang kurz und waschen Sie die Embryonen dreimal mit Methanol. Nach den Waschungen können die Embryonen mehrere Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Beginnen Sie damit, jedem Embryo 500 Mikroliter PK hinzuzufügen und inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, ohne sie zu schütteln. Achten Sie sehr darauf, die Proben durch Überverdauung mit Protein a k oder durch schlampige Manipulation zu beschädigen. Während der PK-Inkubation mischen Sie die Embryonen alle zwei Minuten, indem Sie sie mit einer Pipette bespritzen.

Legen Sie die Embryonen nach 10 Minuten eine Stunde lang auf Eis. Entfernen Sie die PK-Lösung nach einer Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Embryonen zweimal zwei Minuten lang mit Glycin in PBT.

Fixieren Sie nun die Proben für 20 Minuten in einem Milliliter 3,7% Formaldehyd in PBT unter Schaukeln. Waschen Sie das Formaldehyd mit fünf Spülgängen in PBT aus. Spülen Sie dann die Embryonen mit einem Milliliter PBT- und HI-Lösung zu gleichen Volumina und ersetzen Sie die Mischung durch 0,5 bis 1 Milliliter reine Lösung.

Zu diesem Zeitpunkt können die Embryonen mehrere Tage bis Wochen bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. In einer 96-Well-Platte aliquotieren Sie 10 bis 15 Mikroliter abgesetzter Embryonen pro Well. Verwenden Sie eine Spitze mit breiter Bohrung, um die Embryonen nicht zu beschädigen.

Bereiten Sie nun die Vorhybridisierungslösung vor, indem Sie 100 Mikroliter Hype-Lösung pro Probe kochen. Fünf Minuten lang gut abkühlen lassen, die Pre-Hype-Lösung fünf Minuten lang auf Eis abkühlen lassen und dann 100 Mikroliter davon in jede Plattenvertiefung geben, die die Embryonenproben enthält. Entnehmen Sie die vorbereitete RNA-Sonde, die mit einem NanoDrop-Spektralphotometer quantifiziert wurde.

Um die Qualität der Sonde zu überprüfen, lassen Sie ein bis zwei Mikroliter davon auf ein Agrogel laufen. Verdünnen Sie nun für jede Probe etwa 100 Nanogramm der Sonde in 100 Mikrolitern HI-Lösung. Es ist wichtig, unter RNA-freien Bedingungen zu arbeiten.

Beim Umgang mit der Sonde. Erhitzen Sie die Lösung drei Minuten lang auf 80 Grad Celsius. Dann mindestens fünf Minuten auf Eis abkühlen lassen.

Es kann mehrere Stunden gekühlt werden. Entnehmen Sie die Platte und entfernen Sie die Pre-Hype-Lösung durch Aspiration aus den Embryonen. Fügen Sie dann jeweils 100 Mikroliter Hype-Lösung mit der RNA-Sonde hinzu.

Nun, hybridisieren Sie die Sonde am nächsten Tag 12 bis 16 Stunden lang bei 56 Grad Celsius. Eine Reihe von fünf Lösungen wird bei 56 Grad Celsius vorgewärmt. Die erste ist eine reine Hype-Lösung, und die letzte ist reines PBT.

Die anderen drei sind die Verdünnung von HI in PBT. Nach dem Erwärmen die Proben schnell einmal in reiner Hype-Lösung abspülen. Führen Sie als Nächstes drei 15-minütige Waschgänge durch, beginnend mit der am wenigsten verdünnten Hype-Lösung, gefolgt von jeder der aufeinanderfolgenden Verdünnungen.

Zum Schluss waschen Sie die Proben viermal für fünf Minuten in reinem PBT. Bringen Sie die Proben dann auf Raumtemperatur. Fahren Sie nun mit der Anwendung von Antikörpern fort, um die Sonde zu detektieren und die Probenmischung zu verbessern.

Während dieser Schritte kann die Platte in eine kleine Box gelegt werden, die an einem mutierenden Mischer befestigt werden kann, wobei das beschriebene Protokoll verwendet wird, die klassische Paarregel Genrunt wurde in verschiedenen Stadien der Embryogenese analysiert. Die Analyse von Fischen zeigte, wie die anfängliche breite Expression im mittleren Teil des Embryos im embryonalen Stadium vier zu einem segmentierten Streifenmuster verfeinert wird. In späteren Stadien wurden Fische mit verschiedenen diggenen und markierten Antisense-RNA-Sonden durchgeführt, die mit null bis vier Stunden alten Drosophila-Embryonen hybridisiert wurden.

Die hybridisierten Sonden wurden durch sequentielle Inkubationen mit einem biotinylierten Antigen und dem Antikörper Streptokokken avid in HRP und Ceramid nachgewiesen. Die Proben wurden montiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Bei diesen Embryonen im vierten bis siebten Stadium wurde ein breites Mosaik von Fischergebnissen beobachtet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Vorsichtsmaßnahmen in verschiedenen Schritten zu treffen, z. B. beim Schutz Ihrer RNA-Sonden und des Abbaus durch das Arbeiten unter RNA-freien Bedingungen und die Verwendung von RNA-freien Vorräten.

Sobald diese Grundlagen beherrscht sind, können der Methode zusätzliche Schritte hinzugefügt werden, um eine Multi-Labeling-Erfahrung zu machen, um verschiedene RNAs oder spezifische Proteinmarker in derselben Probe zu visualisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie eine gute Vorstellung davon, wie Sie eine Fluoreszenz in C-2-Hybridisierung durchführen können, um die Expression oder subzelluläre Lokalisationsdynamik Ihrer Lieblings-RNA während der Drosophila-Embryogenese zu dokumentieren