Name: Whole Berg RNA Fluorescent In situ Hybridisierung Drosophila Embryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Lernen Sie die optimierte FISH-Methode zur Analyse von RNA-Expression und -Lokalisation in Drosophila melanogaster-Embryonen. Diese Technik ermöglicht hochaufgelöste Visualisierung räumlicher und zeitlicher Expressionsmuster.

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Arbeiten durchgeführt im Lécuyer Labor wird durch Mittel aus dem Nationalen Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), dem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und dem Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) unterstützt. Fabio Alexis Lefebvre und Gaël Moquin-Beaudry von NSERC Undergraduate Research studentships unterstützt, während Carole Iampietro vom Angelo Pizzagalli Postdoc-Stipendium unterstützt wird.

Ein. RNA Probe Vorbereitung Übersicht: Der folgende Abschnitt beschreibt die erforderlichen Schritte zum Digoxigenin (DIG)-markierten RNA-Sonden für FISH machen. Der erste Schritt beinhaltet das Klonen oder PCR Amplifikation einer Sequenz entsprechend der transkribierten Region eines Gens von Interesse, die verwendet werden, um eine Sequenz-spezifische Sonde erzeugt wird. Dies kann durch Klonieren der erste Genabschnitt in ein Plasmid, in dem die multiple Klonierungsstelle von Bakteriophagen Promotorelemente (T7, T3 oder SP6), die dann als Matrize für eine PCR mit flankierenden Primer dienen, die die Promotor-Sequenzen flankiert wird integrieren können erreicht werden , wodurch eine lineare PCR-Produkt mit unterschiedlichen Promotorsequenzen an jedem Ende (1A). Alternativ, den Klonierungsschritt zu vermeiden, kann man auch eine PCR-Amplifikation von genomischer DNA oder cDNA unter Verwendung von Oligonukleotiden, die T7-, T3 oder SP6-Sequenzen an ihrem 5&#39;-Enden (zB T7 umfassen:5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3: 5&#39;-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3&#39;; Sp6: 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 &#39;). Die lineare PCR-Produkte werden dann als Matrizen verwendet, um Dig-markierten Sense oder Antisense-RNA-Sonden durch Abfließen in vitro-Transkription mit der geeigneten Polymerase (1B) zu machen. Bei der Sonden für spezifische Gene, bereiten wir sowohl Sense-und Antisense-RNA-Sonden empfehlen verschiedene Polymerasen, die hilfreich sein für die Beurteilung der FISH-Signal Spezifität (dh, wenn das Gen von Interesse in Antisense-Orientierung transkribiert wird, wird die RNA-Sonde zeigen, die Pegel der Hintergrundgeräusche Signal). In all der folgenden Schritte aus, sollte man große Sorgfalt, um potenzielle Abbau durch Kontamination Ribonukleasen (RNasen) zu vermeiden, indem Sie zunächst die Reinigung aller Bank Flächen und Geräte mit 70% Ethanol oder kommerzielle RNAse Dekontaminationslösungen und durch die Verwendung RNAse-freie Versorgung (zB Wasser, Tipps, Mikrozentrifugenröhrchen). MaMaterialien <ul><li> 1,5 ml Reaktionsgefäße (Abgene, Rochester, NY, USA Cat. No 0900) </li><li> Gel-Extraktions-Kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada;. Art.-Nr. 28706). </li><li> RNAse freiem Wasser (Wisent, Inc. Cat. Nr. 809-115-CL) </li><li> RNA-Polymerasen (T7, T3 oder SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. No EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> RNAse-OUT Ribonuclease-Inhibitoren (40 U / ul) (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nr. 10777-019). </li><li> Digoxigenin (DIG) Nukleotid Mixe (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Kanada. Cat. No.11209256910). </li></ul> Ausrüstung <ul><li> Tischplatte Mikro-Zentrifuge </li><li> Gel-Elektrophoresegerät </li></ul><ol><li> PCR amplifizieren genspezifischen Sequenz aus genomischer DNA, cDNA, oder Plasmid-DNA, um eine lineare PCR-Produkts durch Bakteriophagen T7, T3 oder SP6-Promotor flankiert erzeugen. Folgen Sie den Empfehlungen des Herstellers für die PCR-Bedingungen. </li><li> Überprüfen Sie die Qualität und size des PCR-Produkts durch Agarosegelelektrophorese. Verbrauchsteuern und reinigen PCR-Produkt mit einem Standard-Gel-Extraktions-Kit nach den Herstellern Empfehlungen und eluieren das Produkt in 50 ul Puffer. </li><li> Fällung des PCR-Produkt durch Zugabe von 5 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 150 pl eiskaltem 100% Ethanol, und legen die Röhrchen bei -70 ° C über Nacht. Zentrifugenröhrchen bei 13.000 xg für 10 min bei 4 ° C waschen und das Pellet mit 70% Ethanol. Spin wieder zu entfernen alle Spuren von Ethanol und Luft trocknen das Pellet. Resuspendieren in 25-50 ul RNAse-freiem Wasser. </li><li> Transkribieren Dig-markierten Sonde mit 200-500 ng gereinigtes PCR-Produkt in einem 20 ul Reaktion wie folgt: 2 ul 10X T7 Transkription Puffer (Invitrogen), 1 ul (20 U / ul) RNAse-Inhibitor, 2 ul Dig-NTP-Mix und 2 ul T7-RNA-Polymerase (20 U / ul). Bringen Sie das Endvolumen 20 ul mit RNAse-freiem Wasser. Die Transkription bei 37 ° C für 3-4 Stunden. </li><li> Passen TRANSCription Mix zu 50 ul mit RNAse-freies Wasser und Ausfällen des Dig-markierten RNA-Sonde, wie in Schritt 4 beschrieben. Resuspendieren der gewaschenen RNA-Pellet in 100 ul RNAse-freiem Wasser. Bewahren Sie die resuspendierten Proben bei -70 ° C. </li><li> Quantifizierung der Sonde mit einem nanodrop Spektralphotometer. Um die Sonde Qualität zu überprüfen, führen Sie eine 1-2 ul Probe auf einem 1-2% igen Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt. </li></ol> 2. Sammlung und Fixierung von Drosophila-Embryonen Übersicht: Dieser Abschnitt beschreibt die Schritte für die Ernte und Verarbeitung inszeniert Drosophila-Embryo. Abhängig von der Anzahl von Embryonen Bedarf können Fliegen in Käfigen Population verschiedener Größe aufrechterhalten werden. Die folgenden Schritte sind für Sammlungen durchgeführt mit 900 cm 3 zylindrischen Käfige mit 100mm Apfelsaft Sammlung Platten. Ordnungsgemäße Fixierung erfordert die Entfernung von zwei Schutzschichten umgibt den Embryo: die äußere und die innere Chorion Vitelline Membran 13. Nach der Ernte werden die Embryonen werden zunächst in einem 50% Bleichlösung auf das Chorion entfernen getaucht, dann werden sie in einer zweiphasigen Lösung mit Heptan (permeabilisiert die Vitellin-Membran) und PBS mit 3,7% Formaldehyd versetzt. Die Membran wird dann Vitellin rissig und entfernt durch Übertragen der Embryonen in einem zweiphasigen Gemisch aus Heptan und Methanol. Ordnungsgemäße Embryo Fixierung und Entfernen des Dotterhaut ist kritisch für den Erfolg des stromabwärtigen FISH-Verfahren. Materialien <ul><li> Apfelsaft Agarplatten (40% Apfelsaft, 4% Saccharose, 3,5% Agar, 0,3% Methylparaben) mit Dime-Größe Hefepaste (Bäckerhefe mit Wasser auf Butterkonsistenz gemischt) </li><li> Powdered Paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA;. Art.-Nr. 19208) </li><li> Heptan </li><li> Methanol </li><li> 3% Bleach-Lösung </li><li> 20 ml Glasszintillationsröhrchen (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada;. Best.-Nr. 03-337-15). </li></ul> Ausrüstung <ul><li> Bevölkerung Käfigen </li><li> Sammelkörbe (hergestellt unter Verwendung eines Nitex mesh und den oberen Teil des Schnittes 50 ml Polypropylen-Rohr, in dem ein Loch im Deckel geschnitten worden ist). </li><li> Kleinen Pinsel </li><li> Tischplatte Wirbel </li></ul><ol><li> Pre-Clear wohlgenährten Bevölkerung Käfige mit einem frischen Apfelsaft / Hefe Platte für 1 Stunde bei 25 ° C. </li><li> Fügen Sie einen neuen Apfelsaft / Hefe Platte an den Käfig, um Embryonen im Frühstadium zu ernten. Inkubieren den Käfig für 4 Stunden bei 25 ° C (beachten Sie, dass Abholzeiten eingestellt werden je nach den gewünschten Stufen werden). </li><li> Eine frische 37% Formaldehyd-Lösung durch Kombinieren 3,7 g Paraformaldehyd Pulver, 70 ul 2N KOH und 7,3 ml Milli-Q Wasser in einem Glasszintillationsröhrchen unter einer chemischen Haube. Kochen Sie die Lösung bis der Paraformaldehyd Pulver vollständig gelöst ist, dann auf Raumtemperatur abkühlen und filtriert in neue Szintillationsfläschchen. </li><li> Bereiten Sie eine biphasische Fixierung LösungKombinieren 2,25 ml 1X PBS mit 250 ml 37% Formaldehyd in einem Szintillationsfläschchen, dann Zugabe von 7,5 ml Heptan. </li><li> Ernten den Apfelsaft Platte aus dem Käfig und sammeln die Embryonen, die durch Zugabe von ein wenig Raumtemperatur Leitungswasser und zart Bürsten der Embryonen aus der Platte mit dem Pinsel. Übertragen Sie die resuspendierten Embryonen in einem Korb und mit lauwarmem Leitungswasser. </li><li> Dechorionate Embryonen für 90 sec durch Baden die Sammlung Körbe in Bleichlösung, dann gründlich mit lauwarmem Leitungswasser (bis Bleiche Geruch verschwunden ist). </li><li> Demontieren Sie den Auffangkorb, sammeln Embryonen vorsichtig mit einem Pinsel und übertragen sie in der zweiphasigen Fixierung Lösung. Die Embryonen werden an der Grenzfläche zwischen dem PBS und Heptan Schichten anreichern. </li><li> Seal Szintillationsgefäße und befestigen zu einem Vortex-Mischer. Schütteln für 20 min am niedrigsten Einstellung. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die meisten der unteren PBS und oberen Heptan Phasen mit einer Pasteurpipette. Aspirierendie verbleibende PBS / Heptan / Embryonen Mischung in die Pipette. In tropfenweise, entsorgen Sie die unteren PBS-Phase aus der Pipette, kümmert sich nicht um die Embryonen zu beseitigen. Hinterlegen die Embryonen in ein 1,5 ml Röhrchen, das eine zweiphasige Lösung von 500 ul Heptan (obere Phase) und 500 ul Methanol (untere Phase). </li><li> Schütteln Rohre von Hand kräftig für 30-45 Sek. vitelline Membranen zu knacken. Einmal geknackt, werden die Embryonen in die Methanol sinken. </li><li> Entsorgen Sie die oberen Heptanphase und ungerissenen Embryonen im Heptan / Methanol Interphase, und 500 ul Methanol. Schütteln für 5 sek. </li><li> 3 x waschen mit Methanol und speichern die Embryonen bei -20 ° C (an dieser Stelle Embryonen können für Wochen / Monate gespeichert werden). </li></ol> 3. Postfixierung Processing, Hybridisierung und Post-Hybridisierung Washes Übersicht: In diesem Abschnitt werden die Bearbeitungsschritte für den Embryo Permeabilisierung vor FISH, pre-HybridisierungHybridisierung mit den Sonden und RNA Posthybridisierung Wäschen. Für die anfänglichen Schritte Permeabilisierung die Embryonen als Pool in einem einzigen Rohr (Schritte 1-9 unter dem Ziel für 10-15 ul ständiger Embryonen / Probe) gehandhabt, aber sie werden in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte PCR aliquotiert bevor mit der Vorhybridisierung Schritt (Schritt 10). Dies hilft, die gleichmäßige Bearbeitung aller Embryonen in den ersten Phasen des Experiments zu gewährleisten. Beim Einrichten einer FISH Experiments ist es wichtig, negative Kontrollen umfassen, um den Pegel des Hintergrundsignals in einzelnen Experimente bestimmen. Hierzu empfehlen wir auch ein &quot;no-Sonde&quot; Probe und, wie in Abschnitt 1, eine Probe mit dem &quot;Sinn&quot;-RNA-Sonde, die in der Regel geben ein Signal vergleichbar mit der &quot;no-Sonde&quot; Bedingung hybridisiert festgestellt. Materialien: <ul><li> Methanol </li><li> Phosphatgepufferte mit 0,1% Tween-20 (PBT) Kochsalzlösung </li><li> Proteinase-K 1 mg / ml Stammlösung (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Kanada. Katalog Nr. P2308) </li><li> Glycine (20 mg / ml Stammlösung) </li><li> Hybridisierungslösung: 50% Formamid, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml gescherte Lachssperma-DNA, 100 ug / ml Heparin. </li><li> 0,2 ml halfskirted 96-well PCR-Platten, Abgene, Rochester, NY, USA Cat. Kein 0900) </li></ul> Ausrüstung <ul><li> Hybridisierungsofen, digitale Heizblock oder Wasserbad einstellbaren bis 56 ° C, 80 ° C oder 100 ° C, oder eine PCR-Maschine. </li><li> Mehrkanalpipetten (empfohlen Waschschritte vereinfacht) </li><li> Taumelmischer </li></ul><ol><li> Spülen der Embryos in Methanol, dann in einem 1:1-Gemisch von Methanol: PBT, und dann zweimal in PBT. </li><li> Fixierung der Embryonen für 20 min in 1 ml PBT mit 3,7% Formaldehyd (frisch zubereitet, wie in Schritt 11 beschrieben) mit konstanter Schaukeln auf einem Kolbenpendel. </li><li> Waschen Embryonen für 3 mal 2 min in PBT, während schaukeln. </li><li> Bereiten Sie eine Lösung von 3 g / ml Proteinase K (PK) in PBT verdünnt und fügen500 ul Lösung, um Proben. Inkubieren Proben für 10 min bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Mix Embryonen alle 2 min durch Strahlen mit einer Pipette oder durch vorsichtiges Umdrehen der Rohre. </li><li> Übertragen Embryonen Proben auf Eis für 1 Stunde. </li><li> Bewegen Proben auf Raumtemperatur und entfernen PK Lösung. Waschen 2 mal für 2 min mit 1 ml PBT + 2 mg / ml Glycin. </li><li> Fix Proben 20 min in 1 ml PBT + 3,7% Formaldehyd mit Schaukeln. Spülen Embryonen 5 mal in PBT. </li><li> Spülen Embryonen mit 1 ml einer 1:1-Mischung von PBT und Hyb Lösung. Ersetzen mit 0,5-1 ml 100% Hyb Lösung (bei diesem Schritt werden die Embryonen können für mehrere Tage / Wochen bei -20 ° C gelagert werden). </li><li> Aliquot Embryonen in einzelnen Wells einer 96-Well-Platte (Ziel für ~ 10-15 ul angesiedelt Embryonen / well, kümmern sich um große Blende Tipps verwenden, um eine Beschädigung der Embryonen). </li><li> Kochen Sie 100 ul / Stichprobe von Hyb-Lösung für 5 min und dann kühl auf Eis für 5 min. Diese Lösung wird für die Probe vor Hybridisierung verwendet (Pre-Hyb). </li><li> Fügen Sie 100 ul / Stichprobe von Pre-Hyb-Lösung und Inkubation für mindestens 2 Stunden bei 56 ° C. </li><li> Für jede Probe verdünnen ~ 100 ng Sonde in 100 ul Hyb Lösung. Wärme bei 80 ° C für 3 min, dann cool auf Eis für 5 min (beheizte Sonden können auf Eis für mehrere Stunden aufbewahrt werden). </li><li> Entfernen Sie die Pre-Hyb-Lösung aus den Embryonen und ersetzen mit dem RNA-Sonde Lösung. </li><li> Hybridisieren bei 56 ° C für 12-16 Stunden. </li><li> Pre-warm die folgenden Waschlösungen bei 56 ° C: (A) 200 ul / Stichprobe von Hyb Lösung; (B) 100 ul / Probe einer 3:1 Mischung aus Hyb: PBT; (C) 100 ul / Probe ein 1:1-Mischung aus Hyb: PBT, (D) 100 ul / Probe von einer 1:3 Mischung aus Hyb: PBT, (E) 400 ul / Probe von PBT. </li><li> Spülen Proben mit 100 ul Waschlösung A, dann die Waschschritt mit 100 ul / Probe von Lösungen AD bei 56 ° C für 15 min jeden. Dann waschen Proben 4 mal für 5 min mit 100 ul / Probe der Lösung E bei 56 ° C. </li><li> Proben kühle auf Raumtemperatur. </li></ol> Übersicht: In diesem Abschnitt werden die Antikörper und Nachweisreagenzien zum Nachweis und zur Visualisierung der Verteilung der RNA Sondensignal folgende Hybridisierung. Diese Schritte sind schematisch in Abbildung 2 dargestellt. Hier präsentieren wir nur die Standard Nachweisreagenzien, die wir verwenden zur robusten Signalverstärkung, sondern es existiert eine Vielzahl im Handel erhältlichen Reagenzien, die als Alternativen verwendet werden können, vor allem beim Durchführen Doppel-FISH-Experimente zur Zusammenarbeit erkennen verschiedene RNAs gleichzeitig für Protein-RNA Doppel Färbung. Beispiele von Ergebnissen mit diesem Protokoll sind in der mRNA-Expression / Lokalisierung Muster Mosaik in Abbildung 3 dargestellt. Materialien <ul><li> HRP-konjugierten monoklonalen anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nr. 200-032-156) </li><li> Biotin-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nr. 200-062-156) </li><li> Streptavidin-HRP-Konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Cat. No.S991) </li><li> Cy3-Tyramid Konjugate (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. No SAT704A) </li><li> DABCO Montage Lösung: In einem 50-ml-Tube, verdünnen 1,25 g DABCO (1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan; Sigma D-2522) in 15 ml 1X PBS, dann fügen Sie 35 ml Glycerin und Mischung bis zur vollständigen homogen. Durch Vormischung mit PBS wird das DABCO Pulver löste sich sehr schnell. Shop Montage Lösung bei -20 ° C. </li><li> Objektträger, Deckgläser </li></ul> Ausrüstung <ul><li> Taumelmischer </li><li> Mehrkanalpipette </li><li> Fluoreszenzmikroskop </li></ul><ol><li> Planen PBTB Lösung, enthaltend PBT + 1% fettfreie Trockenmilch (üblicherweise 50 bis 100 ml ausreichend für alle Nachweisreagenz Inkubations-und Waschschritte). </li><li> Blockieren Proben für 10 min bei Raumtemp in 100 ul PBTB / Probe während Schaukeln auf Kolbenpendel. </li> &lt;li&gt; entfernen Blocking-Lösung aus Embryonen und inkubieren Proben für 1,5-2 Stunden bei Raumtemperatur mit 100 ul / Probe des monoklonalen Biotin Anti-DIG-Antikörper-Lösung (verdünnt 1/400 ab Lager in PBTB) mit Schaukeln. </li><li> Waschen Proben 6 mal für jeweils 5 min mit 100 ul PBTB / Probe mit Schaukeln. </li><li> Inkubieren 1,5 Stunden bei Raumtemperatur mit 75 ml / Probe von Streptavidin-HRP-Lösung (verdünnt 1/100 ab Lager PBTB, 10 ug / ml Endkonzentration) mit Schaukeln. </li><li> Waschen Proben 6 mal für 5 min Jeweils 100 ul PBTB / Probe mit Schaukeln (für die DNA-Gegenfärbung, verdünnter DAPI auf 1X Arbeitskonzentration in PBTB und diese Lösung im ersten Waschschritt). </li><li> Spülen Embryonen mit PBT, dann waschen 2 mal für 5 min mit PBS. </li><li> Inkubieren Proben für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf der Kolbenpendel mit 50 ul / Probe von Cy3-Tyramid Lösung (verdünnt 1/50 in Tyramid Amplifikationspuffer). Von diesem Schritt auf, stellen Sie sicher, um Proben in einem Licht abgeschirmt Behälter halten. &lt;/ Li&gt; <li> Waschen Proben 6 mal für jeweils 5 min mit 100 ul PBS / Probe auf Kolbenpendel. </li><li> Entfernen PBS und fügen 100-125 ul / Probe der Montage Lösung mit 70% Glycerin und 2,5% (DABCO). Proben bei 4 ° C. Diese Proben können für mehrere Jahre gelagert werden. </li><li> Mit einem breiten Bohrung Spitze, resuspendieren Embryonen durch vorsichtiges Pipettieren der Proben und übertragen 25 ul von Embryonen auf einen Objektträger aus Glas, dann ein Deckglas über die Embryonen und Dichtung auf dem Objektträger mit Nagellack. </li><li> Analysieren Embryos Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Für Sonde Syntheseschritte, wir erzeugen typischerweise Run-off-Antisense-RNA-Sonden durch in vitro Transkription von full-length Drosophila cDNAs von Plasmiden in der Drosophila Gene Collection (DGC), eine Ressource auf der folgenden Website detailliert gefunden amplifiziert: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Dieser Ansatz wurde ausgiebig in großem Maßstab ISH Studium an Mapping-Genexpression und ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> T7, T3 oder SP6-RNA-Polymerase </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Die Kits enthalten Reaktionspuffer. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3M Natriumacetat </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kalter 100% Ethanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kaltem 70% Ethanol. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chlorbleichlauge 1:1 mit Wasser verdünnt. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptan </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada </td><td> Katalog Nr. P2308 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Formaldehyd-Lösung, frisch zubereitet </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS-Tween-Lösung (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Glycinlösung </td><td></td><td> 2 mg / ml Glycin in PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 Verdünnung einer 1 mg / ml Stammlösung in PBTB </td></tr><tr><td> HRP-konjugiertem Schaf-monoklonalen anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 Verdünnung der Stocklösung in PBTB </td></tr><tr><td> Biotin-konjugierten Maus-monoklonalen anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 Verdünnung einer 1 mg / ml Stammlösung in PBTB </td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP-Konjugat </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, USA </td><td> S991 </td><td> (1/100 Verdünnung einer 1 ug / ml Brühe </td></tr></tbody></table>

whole berg rna fluorescent<em&gt; in situ</em&gt; hybridisierung<em&gt; drosophila</em&gt; embryonen

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Beurteilung der Expression eines Gens, sowie der subzellulären Lokalisation Eigenschaften seiner transkribierte RNA, sind wesentliche Merkmale für das Verständnis seine biologische Funktion während der Entwicklung. RNA in situ Hybridisierung (RNA-ISH) ist eine leistungsfähige Methode zur Visualisierung von RNA Verteilung Eigenschaften verwendet, sei es bei den Organismen, Zellen oder subzellulären Ebene 1. RNA-ISH basiert auf der Hybridisierung einer markierten Nukleinsäure-Sonde (z. B. Antisense-RNA, Oligonukleotiden) komplementär zu der Sequenz eines mRNA oder eines nicht-kodierende RNA Ziel von Interesse 2 basiert. Da das Verfahren erfordert Primärsequenz Information allein zur sequenzspezifischen Sonden zu erzeugen, kann es allgemein zu einem breiten Spektrum von Organismen und Gewebeproben 3 angewendet werden. In der Tat, eine Reihe von großen ISH Studien durchgeführt wurden, um die Genexpression zu dokumentieren und RNA Lokalisation Dynamik in verschiedenen Modellorganismen hat sich auf das führteAufbau wichtiger Community-Ressourcen 4-11. Während eine Vielzahl von Sonden-Markierung und zum Nachweis Strategien im Laufe der Jahre entwickelt worden sind, bieten die kombinierte Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nachweisreagenzien und enzymatische Signalverstärkung Schritte signifikante Verbesserungen der Empfindlichkeit und Auflösung des Verfahrens 12. Hier beschreiben wir eine optimierte Fluoreszenz in situ Hybridisierung Verfahren (FISH) unter Verwendung Tyramid Signalverstärkung (TSA), die RNA Expression und Lokalisation Dynamik inszeniert Drosophila-Embryonen zu visualisieren. Das Verfahren wird in 96-well PCR-Platte-Format, das erleichtert die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Zahl von Proben durchgeführt.

Wenn erfolgreich durchgeführt, bietet dieses Verfahren eine auffallend erhöhtes Maß an Detail in der räumlich-zeitlichen Analyse von Genexpression und mRNA Lokalisation Dynamik in der frühen Drosophila Embryogenese. In der Tat, wie in 3A für die klassische Pair-rule-Gens runt (run) dargestellt, kann man dieses Protokoll, um die Genexpression Veranstaltungen über den Nachweis des entstehenden transcript Herde in Gruppen zum Ausdruck Kerne beobachten. Zusätzlich, wie im Embryo Mosaik <st...

Hier beschreiben wir eine ganze-mount fluoreszierende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH)-Protokoll für die Bestimmung der Expression und Lokalisation Eigenschaften von RNAs während der Embryogenese in der Fruchtfliege ausgedrückt,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Dieses Verfahren beschreibt eine optimierte Fischmethode zur Beurteilung von Expressions- und Lokalisationsmerkmalen von RNA in ganzen Drosophila-Embryonen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine markierte RNA-Sonde synthetisiert wird, die komplementär zu einer Mr NA oder einer nicht beschichteten RNA von Interesse ist, indem in vitro eine entsprechend ausgewählte DNA-Matrize transkribiert wird. Parallel dazu werden Käfige für Fliegenpopulationen verwendet, um Embryonen des gewünschten Entwicklungsstadiums zu entnehmen, zu fixieren und zu permeieren.Nach mehreren Schritten nach der Fixierung werden die Embryonen mit der markierten Antisense-RNA-Sonde hybridisiert. Nach ausgiebigem Waschen der Proben wird die hybridisierte Sonde schließlich durch Immunmarkierung mit einem spezifischen Antikörper und Fluorochrom-konjugierten Detektionsreagenzien detektiert, wodurch eine empfindliche Auslesung der Ziel-RNA-Verteilung ermöglicht wird. Letztendlich liefern die Ergebnisse hochaufgelöste Fluoreszenzsignale, die mit Hilfe der Standard-Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden, um die räumlichen und zeitlichen Expressionsmerkmale der Ziel-RNA während der Drosophila-Embryogenese zu dokumentieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Northern Blot oder R-T-P-C-R besteht darin, dass die RNA-Expression in intakten Gewebeproben beurteilt werden kann. Während diese Methode für die Analyse der RNA-Expressionseigenschaften in frühen Drosophila-Embryonen gedacht ist, kann sie auch für die Analyse von Embryonen in späteren Entwicklungsstadien von Gewebe eingesetzt werden, das von Larven oder adulten Fliegen präpariert wurde. Ein wichtiger Aspekt unseres Verfahrens ist die Hochskalierung der Probenzahl, die wir durch die Durchführung von Fischen im PCR-Ort erreichen können, was den Durchsatz des Ansatzes erheblich erhöht.Zu den Mitgliedern des Labors, die dieses Verfahren demonstrieren, gehören Studenten im Grundstudium, Doktoranden und Postdoktoranden. Beginnen Sie mit gut gefütterten Käfigen. Ersetze den Teller durch einen Apfelsaft-Hefeteller und lass die Fliegen eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius stehen.Setze dann die Apfelsaft-Hefeplatte wieder auf, um Embryonen im Frühstadium zu entnehmen. Inkubieren Sie den Käfig bei 25 Grad Celsius und warten Sie, bis das gewünschte Entwicklungsstadium der Embryonen erreicht ist, während Sie in einer chemischen Haube warten, und mischen Sie die Chemikalien, um 37% Formaldehyd in einem Inhalationsfläschchen aus Glas herzustellen. Kochen Sie die Lösung, bis sich das PFA-Pulver vollständig aufgelöst hat.Kühlen Sie es dann auf Raumtemperatur ab und filtrieren Sie es in ein neues Szintillationsfläschchen. Bereiten Sie als Nächstes eine zweiphasige Fixierungslösung vor. Kombinieren Sie PBS mit 37 % Formaldehyd in einem Szintillationsfläschchen und fügen Sie dann Heptan hinzu, wenn es fertig ist.Ernten Sie die Embryonen von der Apfelsaftplatte mit Zimmertemperatur, Leitungswasser und vorsichtigem Kehren mit einem feinen Pinsel. Übertragen Sie die resuspendierten Embryonen in einen Korb und spülen Sie sie mit lauwarmem Leitungswasser ab. Enthüllen Sie nun die Embryonen für 90 Sekunden, indem Sie den Korb in einer frischen 3%igen Bleichlösung baden.Anschließend entfernst du das Bleichmittel mit lauwarmem Leitungswasser, bis der Bleichmittelgeruch verschwunden ist. Um die Embryonen zu entnehmen, zerlegen Sie den Entnahmekorb und übertragen Sie die Embryonen vorsichtig in die biphasische Fixierlösung. Mit dem Pinsel sammeln sich die Embryonen an der Grenzfläche zwischen der PBS- und der Heptanschicht an.Verschließen Sie nun die Szintillationsfläschchen, befestigen Sie sie an einem Vortex-Mischer und schütteln Sie sie 20 Minuten lang auf niedrigster Stufe. Entsorgen Sie nach dem Schütteln die meisten der unteren PBS- und oberen Heane-Phasen mit einer Weidepipette. Aspirieren Sie dann die restliche Mischung in die Pipette und lassen Sie die untere Phase vorsichtig aus, ohne die Embryonen zu verlieren.Geben Sie die Embryonen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, das eine biphasische Lösung aus 500 Mikrolitern Heptan und 500 Mikrolitern Methanol enthält. Schütteln Sie den Schlauch 30 bis 45 Sekunden lang kräftig, um die Patellamembranen zu knacken. Nach dem Knacken sinken die Embryonen in das Methanol.Entsorgen Sie die obere Phase und die uncrackten Embryonen und fügen Sie einen Milliliter Methanol hinzu. Schütteln Sie nun das Röhrchen fünf Sekunden lang kurz und waschen Sie die Embryonen dreimal mit Methanol. Nach den Waschungen können die Embryonen mehrere Monate bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.Beginnen Sie damit, jedem Embryo 500 Mikroliter PK hinzuzufügen und inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, ohne sie zu schütteln. Achten Sie sehr darauf, die Proben durch Überverdauung mit Protein a k oder durch schlampige Manipulation zu beschädigen. Während der PK-Inkubation mischen Sie die Embryonen alle zwei Minuten, indem Sie sie mit einer Pipette bespritzen.Legen Sie die Embryonen nach 10 Minuten eine Stunde lang auf Eis. Entfernen Sie die PK-Lösung nach einer Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Embryonen zweimal zwei Minuten lang mit Glycin in PBT.Fixieren Sie nun die Proben für 20 Minuten in einem Milliliter 3,7% Formaldehyd in PBT unter Schaukeln. Waschen Sie das Formaldehyd mit fünf Spülgängen in PBT aus. Spülen Sie dann die Embryonen mit einem Milliliter PBT- und HI-Lösung zu gleichen Volumina und ersetzen Sie die Mischung durch 0,5 bis 1 Milliliter reine Lösung.Zu diesem Zeitpunkt können die Embryonen mehrere Tage bis Wochen bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. In einer 96-Well-Platte aliquotieren Sie 10 bis 15 Mikroliter abgesetzter Embryonen pro Well. Verwenden Sie eine Spitze mit breiter Bohrung, um die Embryonen nicht zu beschädigen.Bereiten Sie nun die Vorhybridisierungslösung vor, indem Sie 100 Mikroliter Hype-Lösung pro Probe kochen. Fünf Minuten lang gut abkühlen lassen, die Pre-Hype-Lösung fünf Minuten lang auf Eis abkühlen lassen und dann 100 Mikroliter davon in jede Plattenvertiefung geben, die die Embryonenproben enthält. Entnehmen Sie die vorbereitete RNA-Sonde, die mit einem NanoDrop-Spektralphotometer quantifiziert wurde.Um die Qualität der Sonde zu überprüfen, lassen Sie ein bis zwei Mikroliter davon auf ein Agrogel laufen. Verdünnen Sie nun für jede Probe etwa 100 Nanogramm der Sonde in 100 Mikrolitern HI-Lösung. Es ist wichtig, unter RNA-freien Bedingungen zu arbeiten.Beim Umgang mit der Sonde. Erhitzen Sie die Lösung drei Minuten lang auf 80 Grad Celsius. Dann mindestens fünf Minuten auf Eis abkühlen lassen.Es kann mehrere Stunden gekühlt werden. Entnehmen Sie die Platte und entfernen Sie die Pre-Hype-Lösung durch Aspiration aus den Embryonen. Fügen Sie dann jeweils 100 Mikroliter Hype-Lösung mit der RNA-Sonde hinzu.Nun, hybridisieren Sie die Sonde am nächsten Tag 12 bis 16 Stunden lang bei 56 Grad Celsius. Eine Reihe von fünf Lösungen wird bei 56 Grad Celsius vorgewärmt. Die erste ist eine reine Hype-Lösung, und die letzte ist reines PBT.Die anderen drei sind die Verdünnung von HI in PBT. Nach dem Erwärmen die Proben schnell einmal in reiner Hype-Lösung abspülen. Führen Sie als Nächstes drei 15-minütige Waschgänge durch, beginnend mit der am wenigsten verdünnten Hype-Lösung, gefolgt von jeder der aufeinanderfolgenden Verdünnungen.Zum Schluss waschen Sie die Proben viermal für fünf Minuten in reinem PBT. Bringen Sie die Proben dann auf Raumtemperatur. Fahren Sie nun mit der Anwendung von Antikörpern fort, um die Sonde zu detektieren und die Probenmischung zu verbessern.Während dieser Schritte kann die Platte in eine kleine Box gelegt werden, die an einem mutierenden Mischer befestigt werden kann, wobei das beschriebene Protokoll verwendet wird, die klassische Paarregel Genrunt wurde in verschiedenen Stadien der Embryogenese analysiert. Die Analyse von Fischen zeigte, wie die anfängliche breite Expression im mittleren Teil des Embryos im embryonalen Stadium vier zu einem segmentierten Streifenmuster verfeinert wird. In späteren Stadien wurden Fische mit verschiedenen diggenen und markierten Antisense-RNA-Sonden durchgeführt, die mit null bis vier Stunden alten Drosophila-Embryonen hybridisiert wurden.Die hybridisierten Sonden wurden durch sequentielle Inkubationen mit einem biotinylierten Antigen und dem Antikörper Streptokokken avid in HRP und Ceramid nachgewiesen. Die Proben wurden montiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Bei diesen Embryonen im vierten bis siebten Stadium wurde ein breites Mosaik von Fischergebnissen beobachtet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Vorsichtsmaßnahmen in verschiedenen Schritten zu treffen, z. B. beim Schutz Ihrer RNA-Sonden und des Abbaus durch das Arbeiten unter RNA-freien Bedingungen und die Verwendung von RNA-freien Vorräten.Sobald diese Grundlagen beherrscht sind, können der Methode zusätzliche Schritte hinzugefügt werden, um eine Multi-Labeling-Erfahrung zu machen, um verschiedene RNAs oder spezifische Proteinmarker in derselben Probe zu visualisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, haben Sie eine gute Vorstellung davon, wie Sie eine Fluoreszenz in C-2-Hybridisierung durchführen können, um die Expression oder subzelluläre Lokalisationsdynamik Ihrer Lieblings-RNA während der Drosophila-Embryogenese zu dokumentieren.

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Whole mount in situ Hybridisierung ist eine der am häufigsten verwendeten Techniken in der Entwicklungsbiologie. Hier präsentieren wir ein hochauflösendes Doppel-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung Protokoll zur Analyse der genauen Expressionsmuster eines einzelnen Gens und zur Bestimmung der Überlappung der Ausdruck Domains von zwei Genen. Wir gehören eine Propidiumiodid nukleare Gegenfärbung des Gewebes Organisation hervorzuheben.

Zebrafisch Whole Mount High-Resolution Doppel Fluorescent In-situ Hybridisierung

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Der Zebrafisch, einem kleinen tropischen Fischen, hat sich zu einem beliebten Modell zum Studium der Genfunktion während Wirbeltiere Entwicklung und Krankheit. Die zeitliche und räumliche Expression von Zielgenen kann bestimmt werden...

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

Wir beschreiben eine Multi-Target-chromogenen ganze-mount in situ Hybridisierung (MC-WISH) Verfahren in intakten Drosophila-Embryos eine gleichzeitige und spezifischen Nachweis von drei verschiedenen mRNA-Verteilungsmuster durch Kontrastfarbe Niederschläge.

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet  Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung, Detektion, Analyse und Verfolgung des endogenen mRNA-Handels in der lebenden Drosophila melanogaster Eikammer mit molekularen Baken, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und Open-Source-Analyse vor. software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Nachweis und zur Lokalisierung von Drosophila-Embryoprotein und RNA von der Sammlung bis zur Voreinbettung und Einbettung, Immunfärbung und mRNA-in-situ-Hybridisierung.

Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Lernen Sie die optimierte FISH-Methode zur Analyse von RNA-Expression und -Lokalisation in Drosophila melanogaster-Embryonen. Diese Technik ermöglicht hochaufgelöste Visualisierung räumlicher und zeitlicher Expressionsmuster.

Whole Berg RNA Fluorescent

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