Name: Ein In vivo Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Lernen Sie einen In-vivo-Assay zur Untersuchung der Gefäßpermeabilität bei Mäusen mit blauem Albumin-bindendem Farbstoff. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Endothelbarriere-Störungen.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health, R01CA142928 unterstützt.

Ein. Intravenöse Injektion von Evans Blue in der Maus laterale Schwanzvene <ol><li> Bereiten Sie eine 0,5% sterile Lösung von Evans-Blau in PBS. Falls notwendig, Filter-sterilisiert die Lösung, um Partikel, die nicht aufgelöst hat, zu entfernen. </li><li> Absaugen 200 ul Evans Blue-Lösung in einer Spritze. Vermeiden Sie alle Luftblasen, die in die Spritze entgangen sein könnte. </li><li> Ort Mäusen, 8-12 Wochen alt sind in eine Rückhaltevorrichtung so dass das Tier nicht frei beweglich, sondern mit dem Schwanz gehandhabt werden kann. </li><li> Die Maus Rückhaltevorrichtung auf die Seite, so dass die laterale Schwanzvene gut sichtbar und sind nach oben gerichtet. </li><li> Halten auf das Endstück mit der nicht dominanten Hand zwischen dem Daumen und dem Zeigefinger. </li><li> Sie mit der Nadel (kleine Spurweite, 27-30) bei einer 10 bis 15 Grad Winkel, Abschrägung, voraus in die laterale Schwanzvene in die Richtung des Kopfes. Halten Sie die Nadel und Spritze parallel zum Schwanz. </li><li> Do nicht anwendbar Gegendruck auf die richtige Platzierung zu bestätigen, da dies die Vene zusammenbrechen könnte. </li><li> Langsam spritzen 200 ul Evans-Blau-Lösung in die Schwanzvene der Maus. </li><li> Beachten Sie die Leichtigkeit, mit der der Kolben Fortschritte, denn dies ist der Beweis für die korrekte Platzierung der Nadel in der Vene. </li><li> Legen Sie die Maus wieder in seinen Käfig und beobachten Sie es für 30 min. </li></ol> 2. Orgel Sammlung und Extraktion von Evans Blue von den Organen <ol><li> Opfert die Mäuse durch Genickbruch. For Miles Assayzwecke Genickbruch wird empfohlen, da es wesentliche Beeinflussung begrenzt mit vaskulären Permeabilität. Opfern alle Mäuse gleichzeitig, so schnell wie möglich. Arbeiten Sie mit Kohorten von 6 Mäusen oder weniger, denn kurz nach dem Tod Blutgefäße durchlässiger geworden. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf den Rücken und setzen ihre Füße auf einer weißen Tafel. </li><li> Öffnen Sie die Bauch-und Brusthöhle zu thor aussetzenACIC und Bauchorgane. </li><li> Nehmen repräsentative Bilder von Unterschieden in Evans Blue Extravasation zeigen. Fügen Sie alle Mäuse in dem selben Gebiet, um identische Lichtverhältnisse für alle Mäuse haben. </li><li> Sammle Organe von Interesse und steckte sie in 1,5 ml Röhrchen </li><li> Wiegen Leerhülse und bringen den Saldowert Null. </li><li> Übertragen der Gewebeprobe und gewichtet sie. Wiederholen Sie dies für alle Gewebeproben. Gewebe können luftgetrocknet werden, um den Wassergehalt Variabilität zwischen verschiedenen Organen zu eliminieren. </li><li> . Fügen Sie 500 ul Formamid zu jeder Gewebeprobe Röhre. </li><li> Übertragen Sie alle Rohre mit einem 55 ° C Wasserbad oder Heizblock. Inkubieren 24-48 h bis Evans Blue aus dem Gewebe zu extrahieren. </li></ol> 3. Quantifizierung von Evans Blue extravasierten in interstitiellen Gewebe <ol><li> Zentrifugieren Formamid / Evans Blue Mischung Pellet alle verbleibenden Gewebefragmente. </li><li> Absorption bei 610nm aufweist. Verwenden Sie 500 ul Formamid als leer. </li><li> Calculate ng Evans Blue pro mg Gewebe ausgetretenes. </li><li> Zeichnen Sie alle Daten in einer Grafik. </li><li> Statistische Analysen durchzuführen, um signifikante Unterschiede festzustellen. </li></ol>

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<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+%22endothelium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Konflikt oder konkurrierende finanziellen Interessen.

Gefäßpermeabilität ist ein kritischer Marker für Blutgefäß-Status. Erhöhte Gefäßpermeabilität hat sich gezeigt, dass in mehreren systemischen Erkrankungen, wie Diabetes, Hypertension, und Autoimmunerkrankungen 6,7,8 vorliegt. Erhöhte Gefäßpermeabilität ist gezeigt worden, durch Scherbeanspruchung vermittelt werden, Wachstumsfaktoren wie vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Entzündungsmediatoren wie Serotonin, Histamin und Bradykinin 9. Extravasation von Wasser ...

Bildung und Erhaltung der selektiven permeablen Barrieren für die richtige Entwicklung der Organe und Leistung 1,2 unerlässlich. Endothelzellen Linie das Blutgefäßlumen und bilden eine semi-permeable Barriere, die wesentlich in den selektiven Transport zwischen Blut und dem interstitiellen Raum aller Organe ist. Eine ausreichende Permeabilitätsbarriere wird durch enge Zell-zu-Zell-Verbindungen, die ausschließlich durch Wachstumsfaktoren, Zytokine und andere stressbedingte Moleküle 3 gesteuert werden beibehalten. Störung der Endothelzelle Barriere kann in erhöhter Permeabilität und vaskuläre Leckage führen. Diese Effekte sind in verschiedenen Krankheitsstadien gesehen und das Verständnis der Unterstreichung molekularen Signalwegen erfordert multidisziplinäre Methoden 4,5. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur In-vivo-Verwendung eines Gefäßpermeabilität Mausmodell messen. Der Assay wir beschreiben, auch als Miles-Assay bezeichnet, ist ein gut establIshed Methode, um vaskuläre Permeabilität in vivo zu testen. Der Assay basiert auf der Tatsache, dass unter basalen physiologischen Bedingungen, Albumin passiert nicht die Endothelbarriere basiert. Evans Blue, ein Azofarbstoff mit hoher Affinität für Albumin, wird in den Blutstrom eines Versuchstiers injiziert werden, und unter physiologischen Bedingungen, so wird erwartet, dass sie innerhalb von Blutgefäßen beschränkt werden. Wenn ein Gefäßpermeabilität Reiz hinzugefügt wird, entweder lokal oder systemisch, beginnen die Blutgefäße zu Protein auslaufen und damit auch die Evans Blau, das an Albumin gebunden ist. Dies führt zu einem raschen bläuliche Färbung von Geweben durchlässigen Behälter haben. Erfolgreiche Injektion des Farbstoffes in der Maus laterale Schwanzvene ist entscheidend für die gute Ergebnis des Experiments. Schwanzveneninjektion Technik erfordert umfangreiche Praxis und sollte vor dem Start des Experiments gemeistert werden. Gefäßpermeabilität ist stark abhängig von dem Alter und dem Gewicht des eineimal, so beim Vergleich verschiedener Mausstämmen ist es unerlässlich, dass die Mäuse oder andere Probanden nahezu identisch Geburtsdaten und Gewicht haben. Andere Faktoren, die die Durchlässigkeit der Endothelbarriere beeinflussen Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Feuchtigkeit, was sehr wichtig, die Handhabung Stress der Maus. Aufgrund der Vielzahl von Faktoren, die das Ergebnis des Experiments beeinflussen kann es immer ratsam, dass das Experiment wiederholt wird mindestens dreimal und statistische Analysen durchgeführt. Dieser Assay kann oder verwendet werden, um Gefäßpermeabilität von Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, sowie Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen vergleichen. Permeabilität kann in Gegenwart oder Abwesenheit eines Reizes bewertet werden, in Abhängigkeit von der Funktion des Gens, das moduliert ist. Dieser Assay kann auch verwendet werden, oder um die Wirkung von unterschiedlichen Verbindungen auf Gefäßpermeabilität testen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENT </td></tr><tr><td> EVANS BLUE </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> FORMAMIDE </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 0,2 M Phosphat 1,5 M NaCl pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> SPEKTRALPHOTOMETER </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> MOUSE Rückhaltevorrichtung </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> SPRITZE </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> NADELN </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> Die Spurweite der Nadel hängt von der Größe des Tieres. </td></tr><tr><td> BALANCE </td><td> DENVER INSTRUMENT </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

ein<em&gt; in vivo</em&gt; assay blood vessel durchlässigkeitsprüfung

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Dieses Verfahren basiert auf der intravenösen Injektion von Evans Blue in Mäusen als Versuchstiere Modell. Evans Blau ist ein Farbstoff, der Albumin bindet. Unter physiologischen Bedingungen das Endothel ist undurchlässig für Albumin, so Evans blue gebundene Albumin Überreste innerhalb von Blutgefäßen beschränkt. In pathologischen Bedingungen, die erhöhte Gefäßpermeabilität Endothelzellen fördern teilweise verlieren ihren engen Kontakt und das Endothel durchlässig wird, um kleine Proteine ​​wie Albumin. Dieser Zustand ermöglicht Extravasation von Evans Blue in den Geweben. Eine gesunde Endothel verhindert Extravasation des Farbstoffs in den benachbarten vaskularisierten Geweben. Organe mit einer erhöhten Permeabilität deutlich erhöht Blaufärbung Vergleich zu Organen mit intaktem Endothel zeigen. Das Niveau der Gefäßpermeabilität kann durch einfache Visualisierung oder durch quantitative Messung der Farbstoff pro Milligramm Gewebe Kontrolle gegenüber Versuchstier / Gewebe eingebaut beurteilt werden. Zwei powerful Aspekte dieses Assays sind seine Einfachheit und quantitativen Merkmalen. Evans Blau-Farbstoff kann aus Geweben, die durch Inkubieren eines bestimmten Menge an Gewebe in Formamid extrahiert werden. Evans Blue Absorptionsmaximum liegt bei 620 nm und Absorption Minimum bei 740 nm auf. Durch die Verwendung einer Standardkurve für Evans Blue, können Messungen der optischen Dichte in Milligramm Farbstoff pro Milligramm Gewebe eingefangen umgewandelt werden. Statistische Analyse sollte verwendet werden, um signifikante Unterschiede in Gefäßpermeabilität zu beurteilen.

Wir haben eine in vivo Durchlässigkeit Assay zum Schiff Leck in Mäusen 8-12 Wochen alt zu testen. Dieser Test ist nützlich beim Vergleich der relativen Gefäßpermeabilität zwischen Tieren unterschiedlicher genetischer Hintergrund oder in einem einzelnen Stamm von Mäusen unterworfen Behandlungen, die das Gefäßsystem beeinflussen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ein Stamm von genetisch veränderten Mäusen wir in unserem Labor erstellt eine durchlässige Endothel im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen hat. Diese Veränderungen...

Wir präsentieren ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blutgefäß Durchlässigkeit zu testen. Dieser Assay basiert auf intravenöse Injektion eines Farbstoffes und nachfolgender Visualisierung dessen Diffusion in Zwischenräume basiert.

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Dieses Video stellt einen In-vivo-Assay zur Untersuchung der Durchlässigkeit von Blutgefäßen vor. Bei Mäusen werden die Blutgefäße von endothelialen Zellen ausgekleidet, die eine semipermeable Barriere bilden. Unter physiologischen Bedingungen ist das Endothel für die meisten Proteine undurchlässig, sodass diese auf den Blutfluss beschränkt bleiben.Bei pathologischen Zuständen, die eine erhöhte Gefäßpermeabilität fördern, verlieren Endothelzellen teilweise den Kontakt zueinander. Das Endothel wird für kleine Proteine wie Albumin durchlässig. Bei diesem Assay injizieren wir intravenös einen blauen Farbstoff, der sich unter Bedingungen erhöhter endothelialer Permeabilität an Albumin bindet.Der D durchquert die endotheliale Barriere und diffundiert in den interstitiellen Raum. Dies führt letztendlich zu einer bläulichen Verfärbung des betroffenen Gewebes, bevor das Experiment begonnen wird. Bereiten Sie alle benötigten Materialien vor, pipettieren Sie und verwenden Sie sterile Spitzen.Evans-Blau, sterile Spatel, sterile PBS, sterile Spritze und Nadeln. Mäuse, Maushalterung, Sektionsinstrumente, Sektionsbrett und -nadeln. Waageformular, Wärmeblock für Wasserbad bei 55 Grad Celsius.C.Ve

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Forschung

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Dieses Video beschreibt einen Permeabilitätsassay zur Bewertung der Permeabilität der in vitro Blut-Hirn-Schranke mit Natriumfluoresceinmolekülen.

Assay zur Nachahmbarkeit der Blut-Hirn-Schranke: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Durchlässigkeit von BHS-Nachahmung gegenüber Tracermolekülen

Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen.

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Zwei Methoden werden hier vorgestellt, um intestinale Barrierefunktion zu bestimmen. Eine epitheliale Meter (Volt/Ohm) dient zur Messung des elektrischen Widerstands berührt der kultivierten Epithelien direkt in Gewebekultur Brunnen. Bei Mäusen ist die FITC-Dextran-Magensonde-Methode zur Ermittlung der intestinalen Permeabilität in Vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die vaskuläre Leckage induziert durch intradermale Verabreichung von Durchlässigkeit fördern Wirkstoffen in der murinen Haut zu messen. Diese Technik kann verwendet werden, um festzustellen, die Fähigkeit von Molekülen zu fördern bzw. hemmen vaskulären Leckage oder die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die vaskuläre Permeabilität zu regulieren.

Bewertung von vaskulären Hyperpermeability-induzierende Wirkstoffe in der Haut mit dem Meilen-Assay

Der Zugang von Nährstoffen, Mikrobiota Metaboliten und Arzneimitteln für den Verkehr wird durch die Darm-Blut-Schranke (GBB) gesteuert. Wir beschreiben eine direkte Methode zur Messung der GBB Durchlässigkeit in Vivo, die im Gegensatz zu gängigen indirekte Methoden praktisch nicht von Leber und Niere Funktionen betroffen ist.

Eine In Vivo -Methode zur Bewertung der Darm-Blut-Schranke und LEBERSTOFFWECHSEL Mikrobiota Produkte

Wir beschreiben zwei Methoden zur Beurteilung der transienten vaskulären Permeabilität im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung der Metastasenfunktion (TMEM) und der Krebszellintravasation unter intravenöser Injektion von hochmolekularem Dextran (155 kDa) bei Mäusen. Die Methoden umfassen intravitale Bildgebung bei lebenden Tieren und feste Gewebeanalyse mittels Immunfluoreszenz.

Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Im vorliegenden Protokoll wurde die endotheliale Barrierefunktion der submandibulären Drüse (SMG) durch Injektion verschiedener molekulargewichteter Fluoreszenztracer in die Winkelvenen von Versuchstiermodellen in vivo unter einem Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop bewertet.

Im lebenden Organismus Nachweis der vaskulären Permeabilität in der submandibulären Drüse der Maus

Die hier vorgestellte Methode kann die Wirkung von Reagenzien auf die Angiogenese oder die Gefäßpermeabilität in vivo ohne Färbung bewerten. Die Methode verwendet die Dextran-FITC-Injektion über die Schwanzvene, um Neogefäße oder Gefäßleckagen sichtbar zu machen.

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Lernen Sie einen In-vivo-Assay zur Untersuchung der Gefäßpermeabilität bei Mäusen mit blauem Albumin-bindendem Farbstoff. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Endothelbarriere-Störungen.

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