Name: Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Zellkapselung in PEG-Peptid-Hydrogelen für die Biomaterialforschung mit pankreatischen β-Zellen. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Rückgewinnung von Zellaggregaten für biologische Charakterisierungen.

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Dieses Projekt wurde durch die NIH (R21EB013717) und IUPUI OVCR (RSFG) finanziert. Der Autor dankt Frau Han Shih für ihre technische Unterstützung.

A. Makromer und Peptidsynthese <ol><li> Synthetisieren 4-Arm PEG-Norbornen (PEG4NB) und Photoinitiator Lithium arylphosphanate (LAP) mit etablierten Protokollen. 18,19 </li><li> Synthetisieren Bis-cysteinhaltigen Chymotrypsin-sensitive Peptid CGGY ↓ C (Pfeil zeigt Chymotrypsin-Spaltstelle) unter Verwendung von Standard Festphasenpeptidsynthese in einer Mikrowelle Peptidsynthesizer (CEM Discover SPS). <ol class="lalpha"><li> Den Gehalt an Harz (Rink-Amid-MBHA-Harz) notwendig nach Substitutionsmuster Verhältnis des Harzes und der Synthese-Skala. Aufquellen des Harzes in Dimethylformamid (DMF) in einem Reaktionsgefäß (RV) für 15 min. </li><li> Entfernen Fmoc-Schutzgruppe von dem Harz unter Verwendung einer Entschützung Lösung mit 20% Piperidin und 0,1 M HOBt in DMF. Verwenden Sie die Parameter in der nachstehenden Tabelle für die Mikrowellen-unterstützte Fmoc-Entschützung (für alle Fmoc-Aminosäuren) aufgeführt: <table border="1"><tbody><tr><td> Synthesemaßstab </strong&gt; </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td></tr><tr><td> Power </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatur </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Zeit </td><td> 3 min </td><td> 3 min </td></tr></tbody></table></li><li> Nach Entschützung, spült das Harz mit DMF und führen Ninhydrin-Test, um das Entfernen von Fmoc (Belichtung von N-terminalen Amin) bestätigen. Resin sollte sich nach 2 min blau bei 95 ° C. </li><li> Nach erfolgreicher Entschützung, Koppeln des ersten Fmoc-Aminosäure an den C-Terminus (Synthese läuft vom C-zum N-Terminus) in einem Aktivator Basenlösung (0,28 M Diisopropylethylamin (DIEA) in DMF) mit den Parametern in der nachfolgenden Tabelle aufgelistet . <table border="1"><tbody><tr><td> Synthesemaßstab </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmol </td&gt; </tr><tr><td> Power </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatur * </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Time * </td><td> 5 min </td><td> 5 min </td></tr></tbody></table> * Für Zyste und Sein, verwenden 50 ° C und 10 min zur Racemisierung zu reduzieren. </li><li> Anschließend wird das Harz und führen Ninhydrin zum qualitativen Bestätigung der Vollendung der Kupplung (Verschwinden der N-terminalen Amin). Resin sollte nach 5 min klar bei 95 ° C. Wiederholen Kupplungsschritt (A.2.d), wenn Ninhydrin-Test liefert positives Ergebnis (Farbe blau). </li><li> Wiederholen Schutzgruppenabspaltung (Schritt A.2.b) und Kupplung (Schritt A.2.d) für zusätzliche Aminosäuren in der Sequenz endet mit einem letzten Entschützungsschritt. </li><li> Lassen Sie das RV gründlich Harz mit 25 ml Dichlormethan (DCM). Dieser Schritt ist abzuspülen DMF, der eine Basis ist und Peptidspaltung behindern. </li><li> Bereiten Spaltungscocktail durch Mischen 250 mg Phenol in 4,75 ml Trifluoressigsäure (TFA), 0,125 ml Triisopropylsilan (TIS) und 0,125 ml ddH 2 O. </li><li> Hinzufügen Spaltlösung in die RV und spalten für 30 min in der Mikrowelle Peptidsynthesizer (Leistung = 20 W, Temperatur = 38 ° C). </li><li> Sammeln die Peptidlösung in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung Vakuumkammer. </li><li> Niederschlag gespaltene Peptid in 40 ml Ether, das Röhrchen vortexen und zentrifugieren bei 3.000 rpm für 5 min zu sammeln, die das Peptid. </li><li> Lassen Sie den Überstand und wiederholen Sie Schritt A.2.k zweimal. </li><li> Sammeln und trocknen Peptid im Vakuum. </li><li> Reinige das Peptid mittels HPLC und Charakterisierung mit Massenspektrometrie. </li></ol></li></ol> B. Material Vorbereitung und Sterilisation <ol><li> Bereiten 20 Gew.% PEG4NB Lösung in PBS, Wirbel die Mischung, bis das Makromer vollständig auflöst und sterilisieren das Makromer-Lösung mit einer Spritze Filter. Bewahren Sie den sterilisierten Lösung bei -20 ° C (Aliquotsfür Langzeitlagerung). </li><li> Vorzubereiten und zu sterilisieren 2 Gew.% Photoinitiator (LAP)-Lösung in PBS. Bewahren Sie den sterilisierten Lösung bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. </li><li> Man löst das Peptid (CGGYC) in PBS, das Gemisch Wirbel und Spritze filtrieren zur Sterilisation. Aliquot der Peptid-Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung (zu verhindern Frost-Tau-Zyklen). </li><li> Bestimmen Thiol (-SH)-Konzentration in der vorbereiteten Peptid-Lösung mit Ellman-Reagenz (folgen Sie dem Protokoll des Herstellers). Dieser Schritt gibt genaue Peptidkonzentration (dh [SH] / 2), die zum Berechnen der Menge an Peptid Thiol-En-Foto-Klick Reaktionen verwendet werden benötigt. </li><li> Bereiten Gelierformen, indem Sie den oberen Teil weg von sterilen 1 ml Einwegspritzen mit einer Rasierklinge (offene Spitze für Gel-Entfernung). Sterilisieren Sie die Spritze Formen durch Autoklaven. </li><li> Basierend auf der gewünschten Gel-Formulierung (Thiol En-Verhältnis = 1) und die Konzentrationen der Lager MateMaterialien, berechnen die erforderliche Menge Polymer, Peptid Vernetzer, Photoinitiator und Pufferlösungen erforderlich. </li></ol> C. Cell Preparation <ol><li> Äquilibrieren Zellkulturmedium (high Glucose DMEM, das 10% fötales Rinderserum; Antibiotika-Antimykotisches mit 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 250 ng / ml Fungizon und 50 pM β-Mercaptoethanol), ausgeglichene Hank-Salzlösung ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + frei) und Trypsin-EDTA auf 37 ° C. </li><li> Entfernen Kolben mit MIN6 β-Zellen aus CO 2-Inkubator und die Kolben in der Laminarströmungshaube. </li><li> Absaugen Zellkulturmedien aus den Flaschen und spülen Sie die Zelle mit HBSS. </li><li> Trypsinieren die Zellen mit 3 ml von 2X (0,1%) Trypsin-EDTA und Inkubation der Flaschen für 4 min bei 37 ° C und 5% CO 2. <ul><li> Hinweis: Verwenden Sie 2X Trypsin-Lösung ermöglicht vollständige Dissoziation MIN6 β-Zellen in einzelne Zellen in Suspension. </li></ul> &lt;/ Li&gt; <li> Nach der Inkubation, tippen Sie die Flaschen auf der Oberfläche der Haube vorsichtig vollständig lösen die Zellen. Bestätigen Sie die Ablösung und Dissoziation der Zellen unter dem Mikroskop. </li><li> Hinzufügen gleichen Volumen Zellkulturmedium, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen Sie die Lösung auch durch vorsichtiges Pipettieren, dann die Masse in eine kanonische Rohr und Zentrifuge für 5 min bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Überstand und sanft wieder die Zellen in 4 - 5 ml von Kulturmedien. </li><li> Bestimmen Zelldichte mit 50% Trypanblau Puffer in einer Zählkammer. </li></ol> D. Hydrogel Fabrication and Cell Encapsulation <ol><li> Sobald die Zellen bereit, Mischung (bezogen auf 1:1-ene Thiol-Verhältnis) die erforderlichen Volumina der PEG4NB, CGGYC, LAP, Zelllösung, und HBSS in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Mische die Lösung vorsichtig mit einer Pipette, um eine homogene Mischung zu erhalten und werden 25 ul der resultierenden Lösung mit einer Spritze Form. Setzen der Spritze mit UV-Licht (365nm, 5 mW / cm 2) während 2 min. </li><li> Nach Photopolymerisation, Tauchbecken Gele in einer sterilen 24-Well-Platte mit Zellkulturmedium und bebrüten die Hydrogele in 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Waschen Sie die Zellen beladenen Hydrogele in Zellkulturmedium für 30 min zu spülen locker anhaftenden Zellen und unvernetzten Makromere. Übertragen Sie die Gele in frisches Medium. </li><li> Aktualisieren Zellkulturmedien alle 2 bis 3 Tage. </li></ol> E. Zelllebensfähigkeit Assay Encapsulated Zellmorphologie beobachtet mit Lichtmikroskop (da die synthetisierten Hydrogele transparent sind). Die Lebensfähigkeit der Zellen können visualisiert werden und qualitativ mit Live / Dead-Färbung und quantitativ mit AlamarBlue Reagenz gemessen. E.1. Live / Dead-Färbung <ol><li> Auftauen Live / Dead Färbereagenzien bei Raumtemperatur. </li><li> In kanonischer Rohrs hinzuzufügen PBS gemäß der Anzahl von Abtastungen (n) zu färbenden: <strong&gt; Gesamtvolumen der PBS = n × 500 ul </li><li> Pipette 0,25 ul Calcein AM und 2 ul EthD-1 pro 1 ml PBS auf die kanonische Röhrchen mit PBS. Vortex die Lösung, um die Komponenten zu mischen. </li><li> Inkubieren Zell-beladenen Hydrogele in Live / Dead Färbelösung (0,5 ml / Probe) für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, entfernen Sie die Farbstofflösung und spülen die Probe zweimal mit PBS. </li><li> Zeigen Probe auf einem Deckglas oder Objektträger aus Glas. Beobachten und Bildzellen mit einem konfokalen Mikroskop. </li></ol> E.2. AlamarBlue Assay <ol><li> Planen 10 v / v% AlamarBlue Lösung in Zellkulturmedium. </li><li> Entfernen Hydrogele aus Inkubator und saugen die Medien aus jeder Vertiefung, ohne jeden Kontakt mit dem Hydrogel. </li><li> Inkubieren Zell-beladenen Hydrogele und einen leeren Brunnen (negative Kontrolle) in 500 ul 10% AlamarBlue Lösung für 16 Stunden. </li><li> Nach der Inkubation, Pipette 200 ulder AlamarBlue Lösung in einer 96-Well-Platte und messen Fluoreszenz unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader (Anregung: 560 nm, Emission: 590 nm). <ul><li> Höhere zelluläre Stoffwechselaktivität reduziert den Farbstoff höhere Fluoreszenz-Anzeige zu erhalten. </li><li> Achten Sie darauf, mindestens zwei Vertiefungen von 10% AlamarBlue Lösung als Rohlinge enthalten. Bei der Analyse der Daten, subtrahieren Sie den gemittelten leere Fluoreszenz-Wert aus dem Fluoreszenz-Lesung der Proben. </li></ul></li></ol> F. Chymotrypsin vermittelten Gel Erosion und Spheroid Wiederherstellung <ol><li> Bereiten Sie 1 mg / ml Trypsin-freien α-Chymotrypsin-Lösung in HBBS und Sterilfilter der Lösung. </li><li> Inkubieren Hydrogele in Chymotrypsin-Lösung (500 ul für jedes Gel) bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln bis zur vollständigen Erosion Gel erreicht wird. <ul><li> Für einen 25 ul Gel, ist die Zeit bis zur vollständigen Erosion etwa 5 min. </li></ul></li><li> Legen Sie die Platte auf Eis für ein paar Minuten, um die Aktivität zu reduzierenChymotrypsin. </li><li> Übertragen der Zelle Lösung in 1 ml-Tube und Zentrifuge bei 300 rpm, 4 ° C für 2 min. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette Weide und sanft resuspendieren Sphäroide in HBSS. </li><li> Übertragen der wiederhergestellten Sphäroid-Lösung zu einem 24-Well-Platte und legen Sie die Platte auf Eis, damit die Kügelchen zu beruhigen. </li><li> Für Partikelgrößenanalyse erwerben Phase kontrastreiche Bilder der abgesetzten Sphäroide mit einem Lichtmikroskop. Measure erholt Sphäroid Durchmessern Verwendung von Software wie Nikon Element Software oder ImageJ. </li></ol> G. Functional Test der Geheilte Spheroids G.1. Glucose stimulierte Insulinsekretion aus den gewonnenen Zellen Sphäroide <ol><li> In einer 24-Well-Platte, Inkubation der Gele in 500 ul 2 mM niedrige Glukose Kerbs-Ringer-Puffer (KRB) für 1 Stunde. </li><li> Erode das Gel und erholen Zelle Sphäroide mit Schritte F.1 bis F.6. </li><li> Überstand vorsichtig, ohne irgendwelcheKontakt mit der Zelle Sphäroiden und resuspendieren Sphäroide in 500 ul 2 mM niedrige Glukose KRB. </li><li> Übertragen Sie 100 ul der Zelle Sphäroide Lösung für ein 0,6-ml-Tube und legen Sie sie auf Eis für die intrazelluläre ATP Quantifizierung. </li><li> Teilen Sie die verbleibenden Zell-Sphäroid-Lösung in der Mitte (in zwei Mikrozentrifugenröhrchen) und zentrifugiert 2 min bei 300 rpm und 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen (fast bis zum Boden) und resuspendieren in der ersten Hälfte der Zelle Sphäroide in 1 ml 25 mM hohe Glukose KRB und die zweite Hälfte in 1 ml 2 mM niedrige Glukose KRB. </li><li> Gently pipettieren und die Lösung enthält erholt Zelle Sphäroide zu einem 24-Well-Platte. Inkubieren der Platte für 1 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nach der Inkubation wird die Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge für 2 min bei 1000 rpm und 4 ° C. </li><li> Übertragen 500 ul des Überstandes aus dem zentrifugierten Röhrchen zu einem anderen Mikrozentrifugenröhrchen und bei 4 ° C für InsulinELISA. </li><li> Führen Insulin ELISA folgende Protokoll des Herstellers. </li></ol> G.2. CellTiter Glo Assay <ol><li> ATP-Standards: Bereiten Sie eine 10 uM ATP-Lösung und führen serielle Verdünnungen auf eine Reihe von 8 Standard-Lösungen zu erhalten. </li><li> Um einem weißen 96-Well-Platte, fügen Sie 50 ul Zell-Sphäroid-Lösung (aus Schritt G.1.6) und Standards. </li><li> In jede Vertiefung enthaltende Proben und Standards, fügen Sie 50 ul CellTiter Glo Reagenz und Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min. </li><li> Nach der Inkubation Maßnahme Lumineszenz Anzahl der Proben und Standards unter Verwendung eines Mikroplatten-Reader und kalibrieren Probe ATP-Konzentrationen unter Verwendung einer linearen Regressionskurve durch die ATP-Standards erzeugt. </li><li> Bestimmen Sie den gesamten ATP-Konzentration in der Probe und vermehren sich durch die Probe Verdünnungsfaktor, um die intrazelluläre ATP-Konzentration in einer Zelle beladenen Hydrogel erhalten. </li></ol> G.3. Bestimmen Insulinsekretion <ol><li> Berechnen Sie die amount von Insulin aus den wiedergewonnenen Sphäroide, indem das Verhältnis der Menge an Insulin in hoher Glucosemedium zur Menge an Insulin in niedrigen Glucose sezerniert sekretiert. </li><li> Normalisieren der quantifizierten Insulin-Gehalt der Zelle Sphäroide mit entsprechenden Menge an intrazellulärem ATP der gewonnenen Zellen Sphäroide. </li></ol>

<ol><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+for+the+controlled+release+of+biomolecules+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine.</a> Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Metters, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+controlled+release+formulations%3A+network+design+and+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling.</a> Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7, 830-838 (2011).</li>
<li>Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neutrophil+elastase+responsive+delivery+from+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).</li>
<li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+beta-cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments.</a> Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).</li>
<li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+functionalized+PEG+hydrogels+promote+survival+and+function+of+encapsulated+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells.</a> Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+mimicry+with+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+for+enhancing+beta-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).</li>
<li>Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon-like+peptide-1+inhibits+apoptosis+of+insulin-secreting+cells+via+a+cyclic+5%27-adenosine+monophosphate-dependent+protein+kinase+A-+and+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).</li>
<li>Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cell-matrix+interactions+on+encapsulated+beta-cell+function+within+hydrogels+functionalized+with+matrix-derived+adhesive+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides.</a> Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).</li>
<li>Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+K-sensitive+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+for+degradation+in+response+to+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption.</a> Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).</li>
<li>Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently-immobilized+vascular+endothelial+growth+factor+promotes+endothelial+cell+tubulogenesis+in+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomaterials+science.+Polymer%22%5BJournal%5D)">Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels.</a> Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).</li>
<li>Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels+with+biomolecules+to+regulate+and+guide+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).</li>
<li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).</li>
<li>Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-click+chemistry%3A+a+multifaceted+toolbox+for+small+molecule+and+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+reviews%22%5BJournal%5D)">Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis.</a> Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Synthetic+Extracellular+Matrix+Mimic+via+Thiol-Norbornene+Photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization.</a> Adv. Mater. 21, 5005(2009).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+protein+release+from+hydrolytically+degradable+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das beschriebene Protokoll enthält Angaben auf einfache Verkapselung von Zellen in Thiol-En-Hydrogele durch Schritt-Wachstum Photopolymerisation gebildet. Während ein stöchiometrisches Verhältnis von 1:1 Norbornen zu Thiolfunktionen in diesem Protokoll verwendet wurde, kann das Verhältnis eingestellt in Abhängigkeit von den Experimenten werden. Neben einer korrekten Formulierung, ist es wichtig, um die Homogenität in der Prepolymerlösung aufrechtzuerhalten. Insbesondere verwenden vorsichtiges Pipettieren zu gewährleiste...

Hydrogele sind hydrophile vernetzte Polymere mit außergewöhnlichem Potenzial als Gerüstmaterial für die Reparatur und Regeneration von Geweben. 1-3 Der hohe Wassergehalt der Hydrogele ermöglicht eine einfache Diffusion von Sauerstoff und Austausch von Nährstoffen und zellulären Stoffwechsel-Produkte, die alle entscheidend für die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen sind. Zusätzlich Hydrogele ausgezeichnete Träger für die kontrollierte Freisetzung und Zellabgabesystem aufgrund ihrer hohen Abstimmbarkeit sind. 2 Synthetisches Hydrogele, wie sie aus Poly (Ethylenglykol) (PEG) hergestellt werden zunehmend in Tissue Engineering-Anwendungen verwendet, hauptsächlich wegen ihrer cytocompatibility, gewebespezifische Elastizität und hohe Abstimmbarkeit Material-physikalischen und mechanischen Eigenschaften. 4-6 Obwohl eine häufig verwendete Hydrogel Plattform haben Studien gezeigt, dass PEG-diacrylat (PEGDA) Hydrogele durch Ketten-Wachstum gebildet Photopolymerisationen eine Tendenz zu beschädigen eingekapselt Zellen haben During Netzwerk Vernetzung und in situ Zelleinkapselungsvorrichtung. 7 Die Zellschädigung wurde weitgehend Radikalspezies von den Photoinitiator-Moleküle, die durch die Vinylgruppen an PEGDA zu vernetzen Polymerketten in Hydrogele Propagation generiert wird. Leider sind diese Radikalspezies auch verursachen Spannungen und Zellschäden während Zelleinkapselungsvorrichtung, insbesondere für Rest-empfindlichen Zellen wie Pankreas-β-Zellen. 8-10 Um eine höhere Maschengröße für eine bessere Diffusion und Zellüberleben höheren Molekulargewichten erhalten PEGDA werden häufig für Zellverkapselung verwendet. Dies ist jedoch beeinträchtigt Polymerisationskinetik und bewirkt suboptimalen Gel biophysikalischen Eigenschaften. 7,11,12 Zusätzlich zu den oben genannten Nachteilen, ist es sehr schwierig ist, Zellstrukturen von PEGDA Hydrogele erholen aufgrund der Heterogenität und nicht abbaubaren Natur die vernetzten Netzwerken. Während Protease-sensitiven Peptide eingebaut werden könnenin PEG Makromergerüst die ansonsten inert PEGDA Hydrogele empfindlich gegenüber enzymatischer Spaltung zu rendern, die Konjugation verwendet häufig teure Reagenzien und die erhaltenen Netze enthalten noch hohe Heterogenität aufgrund der Art von Kette-Wachstum Polymerisation. 13-15 Kürzlich wurden PEG-Peptid-Hydrogele über Schritt-Wachstum Thiol-En-Photopolymerisation gebildet wurde gezeigt, dass bevorzugte Eigenschaften für Zell-Kapselung über Hydrogele durch Ketten-Wachstum Photopolymerisation gebildet aufweisen. 7 Die Superior Gelierung Kinetik der Thiol-En-Hydrogele zur Klick zurückzuführen &quot;Natur der Reaktion zwischen Thiol-und En-Funktionalitäten. Im Vergleich zu Ketten-Wachstum Polymerisation von PEGDA ist Thiol-En-Reaktion weniger Sauerstoff inhibiert, was zu einer schnelleren Gelierung bewerten. 16,17 Thiol-En-Hydrogele haben auch höhere Polymerisation Effizienz und bessere Gel biophysikalischen Eigenschaften im Vergleich zu Ketten-Wachstum PEGDA Hydrogele, 7 , 18 &lt;/ Sup&gt; was ergibt begrenzten Zellschäden durch Radikale während der Photopolymerisation verursacht. Zuvor Thiol-En-Hydrogele durch 4-Arm-PEG-norbornen (PEG4NB) Makromer und Bis-Cystein enthaltende Peptid Vernetzern wie gebildeten Protease-sensitive Peptide wurden für Zelleinkapselungsvorrichtung verwendet worden. 7,18 Breitband Abstimmbarkeit PEG Hydrogel Netzwerke bietet eine flexible und steuerbare 3D-Mikroumgebung für die Untersuchung Zellüberleben und Aktivität, während die Verwendung von Protease-sensitive Peptidsequenz eine milde Weise zur Rückgewinnung des Zellkonstrukte natürlich innerhalb Hydrogele gebildet. In diesem Protokoll verwenden wir Stufenwachstum photopolymerisierten Thiol-En-Hydrogelen hergestellt unter Verwendung von 4-Arm-PEG-norbornen (PEG4NB) und eine Chymotrypsin-sensitive Peptid Vernetzer (CGGY ↓ C) für die Einkapselung von MIN6 β-Zellen. Dieses Protokoll systematisch erarbeitet Techniken zur Untersuchung das Überleben, die Proliferation und Sphäroidbildung der MIN6β-Zellen in Thiol-En-Hydrogele. Wir bieten weitere Methode zur β-Zell-Sphäroid Erholung und biologische Charakterisierung der gewonnenen Sphäroide.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 4-Arm PEG (20kDa) </td><td> Jenkem Technology USA </td><td> 4ARM 20K-PEG- </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-Aminosäuren </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Live / Dead Zellviabilität Kit </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Inklusive Calcein AM und Ethidium Homodimer-1 </td></tr><tr><td> AlamarBlue Reagenz </td><td> AbD Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter Glo Reagenz </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td> Ohne Ca +2 und Mg +2 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> OhneCa +2 und Mg +2 </td></tr><tr><td> Hohe Glucose DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotikum-Antimykotikum </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-freien α-Chymotrypsin </td><td> Worthington Biochemical Corp </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> Maus Inusin ELISA Kit </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Einwegspritze </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung und verwertung von β-zellen spheroids von step-wachstum peg-peptid-hydrogele

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogele sind hydrophile, vernetzte Polymere, die eine dreidimensionale Mikroumgebung mit Gewebe-ähnliche Elastizität und hohe Durchlässigkeit für Kultivieren therapeutisch relevante Zellen oder Gewebe bereitzustellen. Hydrogele aus Poly (Ethylenglykol) (PEG)-Derivate hergestellt werden zunehmend für eine Vielzahl von Gewebe-Engineering-Anwendungen verwendet, zum Teil aufgrund ihrer abstimmbaren und cytocompatible Eigenschaften. Bei diesem Protokoll, verwendeten wir Thiol-En-Schritt-Wachstum Photopolymerisationen bis PEG-Peptid Hydrogele zur Verkapselung pankreatischen MIN6 b-Zellen herzustellen. Die Gele wurden durch 4-Arm PEG-Norbornen (PEG4NB) Makromer und Chymotrypsin-sensitive Peptid Vernetzer (CGGYC) gebildet. Die hydrophilen und nicht-Fouling Art PEG bietet eine cytocompatible Mikroumgebung für das Überleben der Zelle und die Proliferation in 3D, während die Verwendung von Chymotrypsin-sensitive Peptidsequenz (C GGY ↓ C, gibt der Pfeil Enzymspaltstelle, während Endgerät ZysteEine Rückstände wurden Thiol-En-Vernetzung hinzugefügt) ermöglicht die schnelle Wiederherstellung von Zellkonstrukte bilden innerhalb des Hydrogels. Das folgende Protokoll ausarbeitet Techniken für: (1) Verkapselung von MIN6 β-Zellen in Thiol-En-Hydrogele, (2) Qualitative und quantitative Zelllebensfähigkeit Assays zum Zellüberleben und Proliferation zu bestimmen, (3) Wiedergewinnung von Zellen Sphäroide mit Chymotrypsin-vermittelte Gel Erosion; und (4) Strukturelle und funktionelle Analyse der gewonnenen Sphäroide.

<html> Die Abbildungen 1-4 zeigen repräsentative Ergebnisse für die Verkapselung, Überleben, Proliferation, Sphäroidbildung und Sphäroid Erholung in Thiol-En-Hydrogele. Abbildung 1 zeigt die Reaktion Schema (1) Schritt-Wachstum Thiol-En-Photopolymerisation mit PEG4NB und CGGYC, und ( 2) Chymotrypsin vermittelten Gel Erosion, die eine Oberflächenerosion Mechanismus folgt. Abbildungen 2 und 3 zeigen die Lebensfähigkeit erzielten Ergebnisse mit Live / Dead-...

Das folgende Protokoll stellt Techniken zur Verkapselung Pankreas β-Zellen in Schritt-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele durch Thiol-En-Foto-Klick-Reaktionen gebildet. Dieses Material-Plattform bietet nicht nur eine cytocompatible Mikroumgebung für Zellverkapselung, sondern erlaubt auch benutzergesteuerten rasche Erholung von Zellstrukturen innerhalb der Hydrogele gebildet.

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Techniken zur Verkapselung von Zellen in dünnen photopolymerisierten Hydrogelen zu demonstrieren, sowie die anschließende Rückgewinnung des pH-Werts von natürlich gebildeten Betazellen aus den enzymsensitiven Hydrogelen aus der biologischen Charakterisierung. Dies wird erreicht, indem zunächst die sechs Betazellen mit einem Unterarm-Peg, Norbertin-Macer und einem enzymsensitiven Peptidvernetzer gemischt werden. Die Zellen werden dann mit Hilfe von freien Radikalen und Photopolymerisationen verkapselt, um ein Hydrogel zu bilden.Der zweite Schritt besteht darin, verkapselte Zellen in ihren Hydrogelen in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius zu kultivieren. Nachdem sich die Zellen zu Aggregaten vermehrt haben, werden die mit Zellen beladenen Hydrogele mit Pufferlösung gespült und dann in Chia-Trypsin-Lösung inkubiert. Unter sanftem Schütteln zur Gelerosion werden die zurückgewonnenen Aggregate dann sorgfältig gewaschen, um die Enzymlösung und das erodierte Polymer zu entfernen.Letztlich können diese Zellaggregate für die Struktur- und Funktionsanalyse verwendet werden. Der Hauptvorteil des Stufenwachstums gegenüber der Photoc

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.

Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

Hier stellen wir eine Methodik zur Erzeugung und Verabreichung von Verbindungen aus zinsgeladenen Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA)-Mikrosphären an intakte Mausinseln in Kultur mit anschließender Immunfluoreszenzanalyse der β-Zellproliferation vor. Diese Methode eignet sich zur Bestimmung der Wirksamkeit von Kandidaten-β-Zell-Mitogenen.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur kostengünstigen Herstellung von Gewebesphäroiden in großem Maßstab unter Verwendung eines 3D-gedruckten stempelähnlichen Geräts.

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsphäroiden mit anschließender Hydrogelverkapselung ermöglicht. Es ist weit verbreitet, da es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Es wäre besonders nützlich für die Erforschung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen und die Erstellung von In-vitro-Gewebephysiologie - oder Pathologiemodellen.

Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist nach wie vor eine der am schwierigsten zu behandelnden Krebsarten. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass präklinische Modelle zur Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung reproduzierbar und klinisch relevant sind. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Co-Kulturverfahren zur Erzeugung reproduzierbarer, klinisch relevanter desmoplastischer Sphäroide.

Züchtung von desmoplastischen dreidimensionalen Pankreaskrebs-Sphäroiden aus Co-Kultur

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Erfahren Sie die Zellkapselung in PEG-Peptid-Hydrogelen für die Biomaterialforschung mit pankreatischen β-Zellen. Diese Methode ermöglicht die kontrollierte Rückgewinnung von Zellaggregaten für biologische Charakterisierungen.

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

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