Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Techniken zur Verkapselung von Zellen in dünnen photopolymerisierten Hydrogelen zu demonstrieren, sowie die anschließende Rückgewinnung des pH-Werts von natürlich gebildeten Betazellen aus den enzymsensitiven Hydrogelen aus der biologischen Charakterisierung. Dies wird erreicht, indem zunächst die sechs Betazellen mit einem Unterarm-Peg, Norbertin-Macer und einem enzymsensitiven Peptidvernetzer gemischt werden. Die Zellen werden dann mit Hilfe von freien Radikalen und Photopolymerisationen verkapselt, um ein Hydrogel zu bilden.

Der zweite Schritt besteht darin, verkapselte Zellen in ihren Hydrogelen in einem Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius zu kultivieren. Nachdem sich die Zellen zu Aggregaten vermehrt haben, werden die mit Zellen beladenen Hydrogele mit Pufferlösung gespült und dann in Chia-Trypsin-Lösung inkubiert. Unter sanftem Schütteln zur Gelerosion werden die zurückgewonnenen Aggregate dann sorgfältig gewaschen, um die Enzymlösung und das erodierte Polymer zu entfernen.

Letztlich können diese Zellaggregate für die Struktur- und Funktionsanalyse verwendet werden. Der Hauptvorteil des Stufenwachstums gegenüber der Photochemie besteht also darin, dass seine Reaktionsbedingungen milder sind als die des traditionellen Kettenwachstums PEG dde. Daher bieten die thinen Hydrogele eine hervorragende Mikroumgebung für viele Zelltypen, einschließlich Betazellen der Bauchspeicheldrüse.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf verschiedene zellbasierte Therapien, da dieses DIN-System eine hervorragende Mikroumgebung für In-vitro-Experimente und eine großartige Plattform für die Zellabgabe bietet. Während wir die Peptide, die in diesen Experimenten verwendet werden, in unserem Labor synthetisieren, gibt es viele Unternehmen, von denen die von uns beschriebenen Peptidvernetzer bezogen werden können. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine 20%ige PEG-Vier-NB-Lösung in PBS-Wirbeln Sie die Mischung vor, bis sich der Reifkörper vollständig aufgelöst hat.

Geben Sie dann die Kermer-Lösung durch einen Spritzenfilter, um sie zu sterilisieren, und lagern Sie Eloqua bei minus 20 Grad Celsius, bis sie benötigt wird. Bereiten Sie als nächstes eine 2%ige Lösung des Photoinitiators Lithium-Arolphosphonat in PBS vor. Die Photoinitiatorlösung wird durch einen Spritzenvorsatzfilter geleitet und die sterilisierte Lösung bei Raumtemperatur lichtgeschützt gelagert.

Ein weiterer vorbereitender Schritt besteht darin, den Chrysin-sensitiven Peptidvernetzer in PBS aufzulösen und die Lösung für die Sterilisation mit einem Spritzenfilter zu filtrieren. Zusätzliche Aliquots werden bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Bestimmen Sie die Konzentration der Sulf-Hydrogruppe in der vorbereiteten Peptidlösung unter Verwendung des Elman-Reagenzes gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Bereiten Sie anschließend die Ationsformen vor, indem Sie den oberen einen Zentimeter großen Teil von sterilen Ein-Milliliter-Einwegspritzen abschneiden. Mit einer Rasierklinge wurden die Spritzenformen erneut sterilisiert. Bereiten Sie mit einem Autoklaven eine Tabelle vor, die Berechnungen der gewünschten Gelformulierung enthält, einschließlich des Volumens und der Konzentration der Stammmaterialien, einschließlich Polymerpeptid, Vernetzer, Photoinitiator und Pufferlösungen.

Zuerst wird die Zellkultur vorgewärmt, die ausgewogene Salzlösung des mittleren Strangs und zwei x Trips in EDTA auf 37 Grad Celsius durchgeführt. Nehmen Sie anschließend Kolben mit mindestens sechs Betazellen aus dem Inkubator und legen Sie sie in die Laminar-Flow-Haube. Nach dem Ansaugen des Zellkulturmediums aus den Kolben werden die Zellen mit vorgewärmten Tanks gespült und die Salzlösung ausgeglichen.

Versuchen Sie dann, die Zellen mit drei Millilitern Vorwärmen und zwei x Trips in EDTA zu eisten und inkubieren Sie die Kolben vier Minuten lang. Klopfen Sie nach der Inkubation vorsichtig mit den Kolben auf die Oberfläche der Haube, um die Zellen vollständig zu lösen. Bestätigen Sie die Ablösung und Dissoziation der Zellen unter einem Mikroskop.

Fügen Sie als Nächstes ein gleiches Volumen Zellkulturmedium hinzu. Um das Trypsin zu neutralisieren, mischen Sie die Lösung gut, indem Sie sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Dann wird die Mischung in ein steriles konisches Röhrchen überführt, die Zellsuspension nach der Zentrifugation fünf Minuten lang bei 200 RCF zentrifugiert, der Überstand aspiriert und die Zellen in vier bis fünf Millilitern Vorwarmkultur vorsichtig resuspendiert. Medien.

Bestimmen Sie schließlich die Zelldichte, indem Sie einen Teil der Zellsuspension mit 50 % Trianblau mischen und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen. Sobald die Zellen fertig sind, mischen Sie die erforderlichen Volumina von PEG vier und B-Peptidvernetzer-Photoinitiator in einer Endkonzentration von einem Millimolar und HBSS in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf der Grundlage eines Eins-zu-Eins-Verhältnisses von TH zu EEN und mischen Sie es vorsichtig durch Pipettieren. In dieser Demonstration wird A 4%PEG vier und B verwendet.

Pipettieren Sie anschließend 25 Mikroliter der resultierenden Lösung in jede Spritzenform. Setzen Sie die Spritzenformen zwei Minuten lang 365 Nanometer UV-Licht mit einer Leistung von fünf Milliwatt pro Quadratzentimeter aus. Um das Gel nach der Photopolymerisation zu polymerisieren, tauchen Sie die Gele in eine sterile 24-Well-Platte mit einem Milliliter Zellkulturmedium und inkubieren Sie die Hydrogele 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um lose anhaftende Zellen oder unvernetzte Makros zu entfernen.

Nehmen Sie nach 30 Minuten die Platte aus dem Inkubator und geben Sie die Gele in einen Milliliter frisches Medium. Aktualisieren Sie die Medien alle zwei bis drei Tage. Bereiten Sie eine Milligramm pro Milliliter Enzymlösung vor, indem Sie Hanks ausgewogene Salzlösung zu trypsinfreiem Alpha-Chimi-Trypsin hinzufügen.

Anschließend die Mischung mit einem Spritzenfilter sterilisieren. Nehmen Sie anschließend die Kulturplatte aus dem Inkubator und spülen Sie die Gele mit Hank's Balance Salt Solution aus. Geben Sie dann 500 Mikroliter Glockenspiel-Trypsin-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie anschließend bei Raumtemperatur durch leichtes Schütteln auf einem Schüttler für etwa fünf bis 10 Minuten, damit eine vollständige Gelerosion erreicht wird.

Sobald das Gel vollständig dissoziiert ist, legen Sie die Platte für einige Minuten auf Eis, um die Aktivität des CH-Trypsins zu reduzieren. Der nächste Schritt besteht darin, die Zellsuspension in ein Ein-Milliliter-Röhrchen zu überführen und zwei Minuten lang langsam bei 45 RCF und vier Grad Celsius zu zentrifugieren. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand mit einer PEI-Pipette und suspendieren Sie das Steroid vorsichtig in Hanks Saldo-Salzlösung.

Übertragen Sie dann die zurückgewonnene Steroidlösung auf eine neue 24-Well-Platte und legen Sie die Platte fünf bis 10 Minuten lang auf Eis, damit sich das Steroid absetzen und zur Größenanalyse an der Oberfläche anhaften kann. Erfassen Sie Phasenkontrastbilder der abgesetzten Sphäroide mit einem Lichtmikroskop Messen Sie die Durchmesser der wiederhergestellten Sphäroide mit Software wie Nikon Element Software oder Image J. Diese Verkapselungsmethode gewährleistet eine hohe anfängliche Zellviabilität, die durch Lebendtofärbung quantifiziert wird. Mit der Zeit in der Zellkultur stieg der Zellstoffwechsel, gemessen mit alamar, blauen Reagenzien über einen Zeitraum von 10 Tagen in allen untersuchten Konzentrationen an.

Nach 10 Tagen in Zellkultur nahmen die Steroide an Größe zu und behielten immer noch eine hohe Zellviabilität bei. In den Hydrogelen unterstützte das PEG-Peptid-Hydrogel das Überleben und die Proliferation von verkapselten Betazellen, hier nach 10 Tagen in Kultur, bei der somatischen Wiederherstellung mit Alpha-Chim-Trypsin befreit es die Steroide aus der Hydrogelmatrix, wodurch eine enge Verteilung der Steroidgrößen erzeugt wird, die unabhängig von der Matrixkonzentration sind. Diese Steroide können dann für zusätzliche Charakterisierungen und Anwendungen verwendet werden, während dieses Verfahren versucht wird.

Es ist wichtig, die Homogenität der Präpolymerlösung während der Verkapselung aufrechtzuerhalten, um sicherzustellen, dass die Zellen gut verteilt sind. Nach diesem Verfahren können die gewonnenen Zellen mit anderen Techniken wie der Ganz-Mount-Immunfärbung und dem Western Blot charakterisiert werden, um die Wirkung des Zustands der Hydrogel-Matrix auf die Proteinexpression und den Phänotyp der Zellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen in Hydrogele einkapselt und wie man die Zellen aus den Gelen für zusätzliche biologische Charakterisierungen gewinnt.