Name: 4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie 4D-Mikroskopie die Dynamik von Proteinfehlfaltung und Proteostase in lebenden Zellen visualisiert. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung von Aggregaten und Qualitätskontrollmechanismen in Echtzeit.

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Ein. Hefe Vorbereitungen <ol><li> Transformieren Hefestämme mit einem Plasmid, welches ein GAL1-GFP-Y68L (Ubc9 ts) Kassette. </li><li> Wachsen Hefe in synthetischen Medien mit 2% Raffinose für 24 Stunden und zurück zu 2% Galactose enthaltenden Medien verdünnt für 16 h oder O / N. Inkubieren Zellen bei 30 ° C unter Schütteln bei 200 UpM. </li><li> Am folgenden Morgen, verdünnen die Abfrage Stamm OD 600 = 0,2. Schütteln für 4-6 Stunden bei 30 ° C (200 rpm), bis die Kultur erreicht OD 600 = 0,8-1,0. </li><li> Ausdruck (so daß nur die bereits übersetzten und gefaltet Pool von GFP-Ubc9 ts zu überwachen), Veränderung Medien synthetischen Medien mit 2% Glucose (SD) 30 min vor der Bebilderung ergänzt unterdrücken. </li><li> Treatment - Hitzeschock die Zellen für 20 min bei 37 ° C bis Fehlfaltung zu induzieren, oder kontinuierlich im Mikroskop Inkubator Proteinaggregation bei Hitze-Schock-Bedingungen folgen. Hinweis - Wenn Sie mit dem Mikroskop bei einer Temperatur oberhalb RT, Vorheizen for etwa 2 Stunden, um die Temperatur entlang dem Körper des Mikroskops und den Zielen (siehe unten) äquilibrieren. </li></ol> 2. Platte \ Slide Vorbereitungen <ol><li> Wählen Sie das entsprechende Platte. Das wichtigste Kriterium ist die Fähigkeit, während der Bildgebung Fokus Akquisition aufrechtzuerhalten. Die folgenden Punkte sind entscheidend für die 4D-Bildgebung und nicht für 2D-Zeitraffer-oder 3D-Bildgebung. <ol><li> Mehreren Mulden-Platte der Boden der verschiedenen Vertiefungen eventuell nicht homogen (dh die Bohrungen werden in unterschiedlichen Höhen relativ zu dem Ziel sein). Dadurch wird es schwierig, den Fokus quer xy Punkten und Zeitpunkten zu erhalten, unabhängig von der Autofokus-Technik verwendet wird. </li><li> Slide Material: Glas vs Kunststoff. Glasboden Dias sind z-homogene zwischen Brunnen, sind aber teurer. </li><li> Dicke der Platte ist unten: Wir verwenden normalerweise Deckglas-Bodenplatten-Index 1,5, aber Index 1 ist auch akzeptabel je nach Zielsetzung. </li></ol></li><li> Cover Unterseite der Platte \ Schieber mit ConA (0,25 mg / ml) für 10 min. ConA wird verwendet, um Zellen zu der Folie, die nach einer einzelnen Zelle über die Zeit ermöglicht haften. </li><li> Entfernen ConA und inkubieren Sie die Folie in einer chemischen Haube, so dass überschüssiges ConA verdampft. </li><li> Platte 200 ul Hefeprobe (OD 600 = 0,5) in die ConAed gut. </li><li> Inkubation: 15 min, zu ermöglichen Zellen an der Oberfläche der Platte haften. </li><li> Entpacken Sie das Medium, und dreimal mit neuem Medium, um eine Schicht von Zellen zu erhalten. Hinweis: wenn eine lange Zeitspanne ist geplant, Saatgut die Zellen dünn, so dass neue Knospen nicht zu füllen und unterbrechen die Region von Interesse. </li></ol> 3. Microscope Vorbereitungen <ol><li> Wir verwenden eine Nikon A1Rsi konfokalen Mikroskop mit ein paar Nicht-Standard-Modifikationen. Für Hefe Bildgebung verwenden wir bis zu 4-Laser (405 nm, 50 mW CUBE Laser; 457-514 nm, 65 mW Argonionenlaser; 561 nm, 50 mW Saphir-Laser, und 640 nm, 40 mW CUBE Laser), und bis zu 4 PMTs ausgestattet mitFilter. Meiste Bildgebung ist mit einem grünen Filtersatz für EGFP und einem roten Filtersatz für mCherry und tdTomato getan. Mit GFP und mCherry gibt es fast keine Übersprechen, daher verwenden wir oft simultane Abtastung. Allerdings kann Zeilenkamera auch zur Übersprechen zu verhindern, wenn es auftritt. Unsere konfokalen ist auch mit einem PInano Piezotisch (MCL), die 3 msec Schritten in z machen kann, wodurch 2-3 Z-Stapel (30-50 Teilen) pro Sekunde ausgestattet. Die Systeme auch eine Spektrometervorrichtung, Perfect Focus (Laser-Verschiebung) und zwei Scanner - ein Galvano-Scanner und eine Resonanzabtaster. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Ziel. Wichtigsten Überlegungen: <ol><li> Wasser / Öl / Luft-Ziel: die wichtigste Überlegung ist der Brechungsindex des Bilderzeugungsmediums vs Medium der Probe. <ol><li> Oil objektiven Vorteile: <ol><li> Oil Ziele können eine höhere numerische Apertur (Öl bricht Licht mehr als Wasser, und somit mehr Photonen gehen Sie zurück zum Ziel). Oil Ziele können bisNA 1,49, bis 1,27 für Wasser verglichen. (Dies ist jedoch nicht wirklich ein großer Unterschied in der Auflösung). </li><li> Der Brechungsindex des Öls dem Brechungsindex von Glas, also keine Photonen sind verloren gehen aus der Probe, durch das Glas, auf das Ziel. (Anmerkung - wählte ein Immersionsöl, die einen Brechungsindex, die für Ihr Ziel und Ihre Deckglas ist, hat). </li><li> Oil ermöglicht problemlose lange Zeit hinfällig, da sie nicht verdampfen. </li></ol> Oil Ziel Nachteile: <ol><li> Die höhere Auflösung durch die höhere NA von Öl Ziele aktiviert schnell abgebaut, wenn das Licht hat, um durch einem wässrigen Medium (zB eine Zelle) reisen. </li><li> Bilder haben in der Regel mehr sphärische Aberrationen und eine Wirkung in 3D &quot;ausgestreckt&quot;. </li><li> Öl ist klebrig, chaotisch, und eine Gefahr für die Ziele. </li></ol></li><li> Wasser objektiven Vorteile <ol><li> Die Zelle selbst ist wässrig, daher gibt es weniger Verzerrungen in Z, And die Auflösung hoch bleibt tief in einer wässrigen Probe. </li><li> Reinigen und benutzerfreundlich. Wasser objektive Nachteile: verdunstet schnell, daher nicht geeignet für lange Filme ohne besondere Vorkehrungen getroffen, um Wasser kontinuierlich zu pumpen, um das Ziel. </li></ol></li><li> Air objektiven Vorteile: 1. Es wird kein Material / verdampft während Mehrpunkt Erwerb oder einer langen Film verloren. 2. Reinigen und benutzerfreundlich. Nachteil: geringer Auflösung und Signal-Empfindlichkeit. </li></ol></li><li> Zimmer-und Inkubatortemperatur: ändernden Temperatur beeinflusst Materie Eigenschaften und in zarten Systemen ändert den Fokus. Die Temperatur sollte vor der Wahl Punkten für den Erwerb eingestellt werden. Änderung der Temperatur während der Akquisition unterbricht Bildgebung und führt zum Verlust des Fokus führen. Wir lassen unsere Mikroskopsystem für 2 Stunden äquilibrieren bei der gewünschten Temperatur vor der Bildgebung. </li><li> Korrektur Kragen: Viele Ziele sind mit einer Korrektur-Ring ermöglichtdas Ziel, für eine gegebene Deckglas Dicke eingestellt werden. Wir empfehlen Einstellung der Korrektur Kragen, während unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen, die Point-Spread-Funktion zu visualisieren. Dadurch wird sichergestellt, richtigen Einstellungen für jede Probe. </li><li> Stabile Probenhalter: Wir finden, dass die meisten im Handel erhältlichen Probenhalter der schwächste Teil des Mikroskops sind. Sie sind oft wackelig und nicht gerade. Das ist eine Katastrophe für hochauflösende, multi-point 4D-Bildgebung. Wir entwerfen unsere eigenen Probenhalter, die gerade sind und fest sitzen auf der Bühne. Sie können auch nach unten geschraubt werden, wenn nötig. </li><li> Multi-Punkt-Akquisition: unsere Imaging-System ist mit dem Nikon &quot;Perfect Fokus&quot;-System, das ist im Grunde ein Laser-basierte Auto-Fokus-Mechanismus ausgestattet. Allerdings ist Autofokus nicht unbedingt nötig mit 4D-Bildgebung, insbesondere, wenn das System nicht driften nicht viel. </li></ol></li></ol> 4. Imaging <ol><li> Schalten Sie das System: Laser, Bühne, Steuerung, Kamera und Computerter Software. </li><li> Legen Sie die Platte auf der Bühne Halter ordnungsgemäß gesichert und stabilisiert. </li><li> Verwenden Auge Port an Ort und die Orientierung der Hefe zu bestimmen. </li><li> Mit Hellfeld, beurteilen Zelle Gesundheit und Lebensfähigkeit nach Form und Textur. </li><li> Schalten Sie epifluoreszenten Licht nach dem jeweiligen Fluorophor (z. B. FITC Filter für GFP), und konzentrieren sich auf Zellen, die den Phänotyp, die Gegenstand Ihrer Forschung. Zellen, die stark fluoreszierende sind in mehr als einer Wellenlänge kann tot sein, und daher autofluoreszierenden. Wir visualisieren den Kern mit einem tdTomato Fluorophor fusioniert mit einem SV40 NLS (NLS-TFP). TFP ist doppelt so groß wie GFP, und ist daher oberhalb der Diffusion Grenze des Kerns, also es funktioniert sehr gut als nukleares Marker. Wir können auch anregen TFP mit einem grünen (488 nm) Laser gleichzeitig als GFP, sondern sammeln die grünen und roten Emissionen in zwei separate PMTs zur spektralen Auflösung. </li><li> Passen Sie die folgenden Einstellungen, um das Rauschen zu minimierenund Übersättigung: <ol><li> Laserleistung - Bleichen und Phototoxizität vs Helligkeit des Bildes in Betracht gezogen werden. </li><li> Gain: beeinflusst die Empfindlichkeit der Kamera, damit Rauschabstand Signal. </li><li> Lochblendendurchmesser - sollte entsprechend der Laser mit der kürzeren Wellenlänge eingestellt werden. Der Durchmesser der Blende bestimmt die Dicke (Höhe) des optischen Abschnitts abgebildet. So wird das Öffnen der Lochkamera zu sammeln mehr Licht (wir mehr Photonen in), aber Auflösung in z (weniger Konfokalität) zu verringern. </li></ol></li><li> Nützliche Tipps: <ol><li> Wenn verschiedene Fluorophore kongruenten Wellenlänge emittieren, verwenden Sie die Spectral Detector-Funktion, die die Wahl des virtuellen Filter ermöglicht. Beachten Sie, dass spektrale Detektoren weniger empfindlich als normale PMTs sind. </li><li> Wenn verschiedene Fluorophore durch den gleichen Laser angeregt werden, verwenden Sie die Zeile Scan-Funktion. </li><li> A Galvano-Scanner ermöglicht mehr Sensibilität, hat aber ein höheres Risiko für Ausbleichen. A Resonant Scanner ermöglicht schneller eincquisition und senkt damit das Risiko für Ausbleichen, ist aber weniger empfindlich. </li><li> Durchschnittlich zwischen 2 und 16 Bildern, erhöht sie Signal-Rausch-Verhältnis, sondern macht Akquisition langsamer und natürlich ist mehr Belichtung der Probe zu dem Laser ist. </li><li> Dauer des Erwerbs-abhängig von der biologischen Fragestellung (zB JUNQ und IPOD-Bildung erfolgt ~ 2 h). Wir haben Hefe mit dem Resonanzabtaster für bis zu 30 h in 3D Zeitraffer abgebildet. </li><li> Zeitraffer Intervallen Kleinere Abstände wird ein kohärenter Film, aber vielleicht Photobleichung und damit Verlust des Signals führen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Unsere Intuitionen über biochemische Prozesse stammen aus Tischgerät Experimente, in denen ein gut gemischte Lösung der Reaktanten und Produkte dürfen Gleichgewicht in einem Becherglas zu erreichen ist. In einem solchen Szenario kann die Konzentration einer bestimmten chemischen Spezies als eine einzelne Zahl, die das Verhältnis einer molaren Menge von Molekülen mit einem makroskopischen Volumen ausgedrückt. Vieles, was wir über Proteinstruktur und-funktion stammt von Methoden, die das klassische, bulk Reaktion Bild widerspiegeln: Western Blots, Zentrifugationen und spektrophotometrischen Messungen an Extrakten aus Homogenaten von ganzen Populationen von Zellen durchgeführt. Da die Technologie, die wir verwenden, um an Zellen unter Vergrößerung betrachten verbessert sprunghaft, wird es immer deutlicher, dass die Bedingungen, unter denen die meisten biochemischen Reaktionen in vivo nur die geringste Ähnlichkeit mit denen des klassischen Tischgerät Szenario tragen. Nicht nur ist der Innenraum des Cella dicht Umfeld verpackt, in dem Gedränge Effekte wesentlich verändern die Aktivitäten der verschiedenen Reaktanten, es ist auch genau das Gegenteil von gut gemischt. Dies erklärt die häufige Disparität zwischen in vitro und in vivo Wirkungsgrade einer Vielzahl von komplexen makromolekularen Reaktionen. Nirgendwo sind Intuitionen, die aus klassischen in vitro biochemischen Experimenten anfälliger zu täuschen wie in Fragen rund um die in vivo Faltung, Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen. Nach den Untersuchungen der Proteinchemie in loser Schüttung Reaktionen das Problem der Falten für ein bestimmtes Protein als ein einfaches Ja oder Nein Frage behandeln kann, muss jeder Versuch, die Dynamik der gesamten Bevölkerung von Makromolekülen in einer lebenden Zelle zu verfolgen sensibel sein für die gesamte Verteilung der möglichen konformativen Ergebnisse verfügbar zu einer Polypeptidkette, insbesondere dem Risiko von Fehlfaltung und Aggregation. Zum Beispiel könnte untersuchen wir eine Bulk-Zelle lyübersättigen eines aggregierende Protein durch Western-Blotting, und bestimmen, dass das Protein überwiegend unlöslich und nicht ubiquitiniert ist. Jedoch in der lebenden Zelle eine diskrete Subpopulation des Proteins, schwer zu detektieren, wenn eine Mittelung über viele Zellen, kann löslich und ubiquitiniert in einem bestimmten Kompartiment wo die lokale Konzentration der Spezies ist extrem hoch. Das letztere Szenario kann mehr wichtige Konsequenzen für die Lebensfähigkeit der Zelle als der größere bulk Sub-Population. Weiterhin, während eine Vielzahl von Chaperone pleiotrope Verhaltensweisen und Funktionen in vitro zeigen, wird es immer deutlicher, dass in der Zelle ihre diskrete Funktionen räumlich und zeitlich begrenzt sind. In der neu entstehenden Paradigma für das Verständnis der Biochemie, wird ein variabler Konzentration Eigenschaft jedes spezifische Nano-Umgebung, in der Zelle, und die molekularen Ereignisse, die biologische Prozesse zugrundeliegen muss nicht nur in Zeit getestet werden, sondern auch in spacE. Die 4D-Bildgebung hier vorgestellte Ansatz ermöglicht sensitive Modellierung Proteinfehlfaltungen in lebenden Zellen, aber es kann verwendet werden, um eine beliebige Anzahl von anderen biologischen Prozessen zu untersuchen und wie sie im Raum reguliert, Zeit und nach Änderungen der Umgebungsbedingungen. In diesem Papier verwenden wir den Ubc9 ts Falt-Sensor, der auf wirksame Weise zeigt die Phasen und Optionen für den Umgang mit dem Beginn der Proteinaggregation im Cytosol. Zusätzlich zu Veranschaulichung der Zellbiologie der Aggregation Qualitätskontrolle kann dieser Ansatz als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entschlüsselung die Wirkung von bestimmten Störungen oder genetische Mutationen auf proteostasis (beispielsweise Ubc9 ts kann zur Proteinfaltung Spannung in Reaktion auf Oxidation messen dienen, die Expression eines toxischen Zuschlagstoff oder Mutationen in der Qualitätskontrolle Weg). 4D-Bildgebung ist auch für die genaue Bestimmung von Protein Lokalisation oder Kolokalisation zwischen zwei verschiedenen Protein essentiells, und zum Erkennen Phänomene, die vielleicht nur vorübergehend, aber wichtig. Zum Beispiel, insbesondere bei einem kleinen kugelförmigen Organismus, wie Hefe, kann es den Anschein hat, dass eine Struktur oder aggregierter juxtanuclear Körperregion hat, während 4D-Bildgebung kann sich herausstellen, dass dies lediglich ein Artefakt des Winkels der Inspektion. Im Beispiel experimentieren wir hier präsentieren, zeigen wir die Verwendung eines Modells fehlgefaltete Protein, Ubc9 ts, um die Aggregation Qualitätskontrolle über Zeit und Raum im Zytosol folgen. Bei der permissiven Temperatur wird Ubc9 ts gefaltet und diffundiert im Zellkern und Zytosol. Nach wärmeinduzierten Fehlfaltung, es bildet zunächst schnell diffundierenden kleinen Aggregat Stress-Foci, die für den proteasomalen Abbau verarbeitet werden. Wenn das Proteasom partiell gehemmt wird, werden diese Spannung Foci in JUNQ und IPOD Einschlüsse im Verlauf von etwa 2 Stunden umgesetzt. Wenn Ubiquitin-vermittelten Abbau ist nicht als eine Qualitätskontrolle Option Ubc9 ts wird sofort an den IPOD Einbeziehung schützende Aggregation umgeleitet. Diese Tools bieten unglaubliche Möglichkeiten, um neue genetische Faktoren in der Aggregation der Qualitätskontrolle beteiligt zu entdecken und ihre räumliche und zeitliche Regulation in der Zelle zu erforschen.

<table><tbody><tr><td>MG132</td><td>Mercury</td><td>mbs474790</td><td></td></tr><tr><td>con A</td><td>Sigma</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenplatten</td><td>ibidi</td><td>ibd81158<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Konfokale 3D-Filme wurden mit einem Nikon A1R-si Mikroskop aufgenommen, das mit einem PInano Piezo Tisch (MCL) ausgestattet war, unter Verwendung eines 60x Wasserobjektivs NA 1,27, 0,3 Mikron Scheiben, 0,5 % Laserleistung (von 65 mW 488 Laser und 50 mW 561 Laser). z-Stacks wurden alle 5 min für 90 min erworben. Jede z-Serie wurde mit einer Schrittweite von 0,5 Mikrometern und insgesamt 30 Schritten erfasst. Die Bildverarbeitung erfolgte mit der Software NIS-Elements.</td></tr></tbody></table>

4d-bildgebung von protein aggregation in lebenden zellen

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Eine der wichtigsten Aufgaben jeder lebenden Zelle ist die Aufrechterhaltung der korrekten Faltung von neu synthetisierten Proteinen im Angesicht des sich ständig verändernden Umweltbedingungen und einer intrazellulären Umgebung, ist dicht gepackt, klebrig und gefährlich Proteinstabilität 1. Die Fähigkeit, dynamisch auszugleichen Protein-Produktion, Falt-und Abbau verlangt hoch spezialisierten Qualitätskontrolle Maschinen, deren absolute Notwendigkeit ist am besten, wenn es Störungen beobachtet. Krankheiten wie ALS, Alzheimer, Parkinson und bestimmte Formen der Mukoviszidose haben einen direkten Link zu Proteinfaltung Qualitätskontrolle Komponenten 2, und somit zukünftige therapeutische Entwicklung erfordert ein grundlegendes Verständnis der zugrunde liegenden Prozesse. Unsere experimentelle Herausforderung ist, zu verstehen, wie Zellen Schäden Signale integrieren und montieren Antworten, die auf verschiedene Umstände zugeschnitten sind. Der Hauptgrund, warum Proteinfehlfaltungen stellt eine existentielle threan der Zelle ist die Neigung von falsch gefalteten Proteinen zur Aggregation, wodurch eine globale Störung der überfüllten und zart intrazellulären Faltung Umgebung 1. Die Faltung der Gesundheit oder &quot;proteostasis,&quot; der zellulären Proteoms wird beibehalten, auch unter dem Zwang der Alterung, Stress und oxidativen Schäden durch das koordinierte Handeln der verschiedenen mechanistischen Einheiten in einer aufwendigen Qualitätskontrolle 3,4. Eine spezielle Maschinen molekularer Chaperone können nicht-native Polypeptide binden und fördern deren Faltung in den nativen Zustand 1, zielen sie für den Abbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System 5 oder leiten sie an schützenden Aggregation Einschlüsse 6-9. Die juxtanuclear Qualitätskontrolle Fach (JUNQ) und das unlösliche Protein Anzahlung (IPOD) (- Modell Abbildung 1): In Eukaryoten wird die cytosolische Aggregation Qualitätskontrolle Last zwischen zwei Fächern 8-10 unterteilt.Proteine, die durch das Protein Falzqualität Kontrollapparat ubiquitiniert werden an das JUNQ, wo sie für den Abbau durch das Proteasom verarbeitet geliefert. Falsch gefaltete Proteine, die nicht ubiquitiniert sind, werden auf dem IPOD, wo sie aktiv in einem schützenden Raum zusammengefasst werden umgeleitet. Bis zu diesem Punkt hat die methodischen Paradigma der live-cell Fluoreszenzmikroskopie weitgehend Markierung von Proteinen gewesen und verfolgen ihre Orten in der Zelle an bestimmten Zeitpunkten und in der Regel in zwei Dimensionen. Wie neue Technologien begonnen haben zu gewähren Experimentatoren beispiellosen Zugang zu den Submikrometerbereich in lebenden Zellen, wurde die dynamische Architektur des Cytosol in Sicht als herausfordernde neue Grenze für experimentelle Charakterisierung kommen. Wir stellen eine Methode zum schnellen Überwachen der 3D räumlichen Verteilungen von mehrfachen fluoreszenzmarkierten Proteinen in der Hefe Cytosol über die Zeit. 3D timelapse (4D-Bildgebung) ist nicht nur eine technische Herausforderung, Rattesie, es erleichtert auch eine dramatische Verschiebung in den konzeptionellen Rahmen zur zellulären Struktur zu analysieren. Wir verwenden eine cytosolische Falt-Sensor-Protein in lebende Hefe zu deutlichen Schicksale falsch gefalteten Proteinen in zellulären Aggregation Qualitätskontrolle zu visualisieren, mit schnellen 4D Fluoreszenz-Bildgebung. Die temperaturempfindliche Mutante des Proteins Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) ist extrem wirksam sowohl als Sensor der zellulären proteostasis und einem physiologischen Modell zum Verfolgen Aggregation Qualitätskontrolle. Wie bei den meisten ts Proteinen ist Ubc9 ts vollständig gefalteten und funktional permissiven Temperaturen durch aktive zelluläre Chaperone. Über 30 ° C, oder wenn die Zelle Fehlfaltung Stress, Ubc9 ts misfolds zugewandt und folgt dem Schicksal eines nativen globulären Protein, das fehlgefaltete hat aufgrund von Mutation, Hitzedenaturierung, oder oxidative Schädigung. Durch Fusion mit GFP oder andere Fluorophore, kann es in 3D verfolgt werden, wie es Stress-Foci bildet, oder ist dikorrigiert um JUNQ oder iPod.

<html><img alt="Abbildung 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" /> Abbildung 1. Modell:. Subzellulären Kompartimentierung von fehlgefalteten Proteinen Qualitätskontrolle Maschinen lenkt fehlgefaltete Proteine ​​in getrennte Kompartimente mit verschiedenen Funktionen: Lösliche Proteine, gezielt zum Abbau durchlaufen Poly-Ubiquitinierung und sind dem Ju xta-N uclear Q ualitätskontrolle Abteil (JUNQ geschickt ). Unlöslichen Proteinen, die nicht zu ubiquitiniert sind auf protektive Sequestrierung an die I nsoluble Pr otein D eposit (IPOD), angrenzend an die Vakuole, gesendet, wo sie aktiv Aggregation unterzogen werden. es.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Modeling Proteinfehlfaltungen mit GFP-Ubc9 ts. Unter normalen Bedingungen wird GFP-Ubc9 ts (grün) nativ gefaltet und diffus im Zellkern und Zytosol lokalisiert. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. Die Expression von Ubc9 ts wurde durch Zugabe von 2% Glucose, bevor Bildgebung in allen Experimenten geschlossen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um größere Zahl anzuzeigen</a> . <ol><li> Bei Temperatur-Shift bis 37 ° C, GFP-Ubc9 ts (grün) fehlgefaltete und bildet cytosolischen Stress-Foci. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. </li><li> Bei Erholung von Hitzeschock bei 23 ° C, die thermisch denaturiert GFP-Ubc9 ts abgebaut wird, als durch eine verminderte Fluoreszenz Pegel angedeutet. </li><li> Nach Temperaturverschiebung bis 37 ° C mit Proteasom-Inhibierung mit 80 mm MG132, GFP-U<html> BC9 ts fehlgefaltete und in JUNQ und IPOD Einschlüsse verarbeitet. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. </li><li> Bei Temperatur-Shift bis 37 ° C und Ubiquitinierung Hemmung, GFP-Ubc9 ts fehlgefaltete und in den IPOD Einbeziehung verarbeitet. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. Das Ubiquitin Protease 4 (Ubp4) überexprimiert wird, um Ubc9 ts Ubiquitinierung blockieren. </li></ol><img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" /> Abbildung 3. Zeitrafferaufnahme JUNQ und IPOD Bildung. Bei Temperatur-Shift bis 37 ° C und Proteasom-Hemmung mit 80 mm MG132, GFP-Ubc9 ts Stress-Foci in JUNQ und IPOD Einschlüsse verarbeitet. Der Kern wird durch NLS-TFP (rot) markiert. 3D-Bilder wurden bei 4 min Intervallen erfasst. (Siehe auch Movie 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.

Zelluläre Lebensfähigkeit hängt rechtzeitige und effiziente Verwaltung der Fehlfaltung von Proteinen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung der unterschiedlichen potentiellen Schicksal eines fehlgefalteten Proteinen: Rückfaltung, Abbau oder Sequestrierung in Einschlüssen. Wir zeigen die Verwendung eines Falt-Sensor, Ubc9<sup&gt; Ts</sup&gt; Zur Überwachung proteostasis und Aggregation Qualitätskontrolle in lebenden Zellen mit Hilfe der 4D-Mikroskopie.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Dieses experimentelle System erfasst hochauflösende 3D-Fluoreszenzbilder in lebenden Zellen, um die raumzeitliche Dynamik der Qualitätskontrolle der Proteinfaltung zu überwachen und zu testen. Bereiten Sie zunächst die Zellen darauf vor, die sich schnell bewegenden Proteinkomplexe zu untersuchen. Erfassen Sie einen Z-Stapel von Bildern mit hoher Z-Auflösung.Erfassen Sie dann als nächstes eine Zeitreihe, die aus Zacks besteht, rendern Sie die resultierenden Bilder in einem 3D-Film und analysieren Sie die resultierenden Bilder. Letztendlich ermöglicht die Vier-D-Bildgebung die Verfolgung der dynamischen und transienten Phänomene in Zellen unter verschiedenen Bedingungen. Der Hauptvorteil der Vier-D-Bildgebung gegenüber bestehenden Methoden wie Weitfeldmikroskopie und Zeitraffer besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, gleichzeitig die Dynamik und räumliche zeitliche Verteilung der gesamten Proteinpopulation in der Zelle mit hoher Auflösung zu visualisieren.Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie der Proteinaggregation, Qualitätskontrolle und Proteinfaltung zu beantworten. Dabei handelt es sich um hochdynamische und transiente Prozesse. Ohne eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung wären viele von ihnen daher nicht zu beobachten.Diese Methode kann Einblicke in die Qualitätskontrolle der Aggregation geben. Es kann auch die Erforschung der Interaktion und Dynamik von Proteinen revolutionieren. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Aufnahme von 3D-Filmen von endogen markierten oder niedrig exprimierenden Proteinen die Stabilität des Systems erfordert.Hohe Sensitivität und geringes Photobleaching Transformieren Sie die Hefestämme mit einem Expressionsplasmid für ein Fusionsprotein aus Fluor, das an ein zytosolisches Faltungssensorprotein gebunden ist, wie die temperaturempfindliche Mutante der UBC nine. Züchten Sie die Hefe 24 Stunden lang in synthetischen Medien mit 2 %Raffinose, verdünnen Sie sie dann über Nacht auf 2 %Galaktose-haltige Medien, verdünnen Sie den Abfragestamm auf einen OD 600 von etwa 0,2 und kultivieren Sie ihn vier bis sechs Stunden lang, bis die Kultur 30 Minuten vor der Bildgebung zwischen 0,8 und 1,0 einen OD 600 erreicht. Unterdrücken Sie die Expression mit synthetischen Medien, die mit 2% Glukose versetzt sind.Dieser Schritt ermöglicht die Überwachung nur des bereits translatierten und gefalteten Pools des Express-Proteins. Nun die Zellen 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius hitzeschocken. Um eine Fehlfaltung zu induzieren, wählen Sie eine geeignete Platte, um den Fokus während der Vier-D.Imaging-Aufnahme beizubehalten.Decken Sie den Boden der Platte 10 Minuten lang mit 0,25 Milligramm pro Milliliter con A ab. Con A wird verwendet, um Zellen an den Objektträger zu kleben, was es ermöglicht, einer einzelnen Zelle über einen längeren Zeitraum zu folgen. Aspirieren Sie den Kegel A und Pfeil, trocknen Sie die Platte in einer chemischen Haube.Fügen Sie dann 200 Mikroliter Hefeprobe hinzu. 15 Minuten inkubieren, damit die Zellen an der Platte haften können. Führen Sie drei Waschgänge mit dem Medium durch, um eine einzelne Zellschicht für die Hefebildgebung zu erhalten.Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einigen nicht standardmäßigen Modifikationen, wie im Begleittext beschrieben. Dieses Hefe-Imaging-System verwendet bis zu vier Laser und bis zu vier Photomultiplier-Röhren, die mit Filtern ausgestattet sind. Der größte Teil unserer Bildgebung erfolgt mit dem grünen Filterset für EGFP und einem roten Filterset für m Kirsche und TD-Tomate.Statten Sie das Konfokalsystem außerdem mit einem Pi Nano Pizo Stage Perfect Focus System aus, und sowohl der Galvan O- als auch der Resonanzscanner äquilibrieren das Mikroskopsystem, bis die gewünschte Temperatur erreicht ist. Wählen Sie vor der Bildgebung auf der Grundlage des Brechungsindex des Bildgebungsmediums im Vergleich zum Medium der Probe das geeignete Objektiv Wasser, Öl oder Luft aus. Stellen Sie den Korrekturring entsprechend der Dicke der Platte ein.Reinigen Sie das Objektiv mit Linsentüchern und Ethanol. Reinigen Sie auch den Objektträger mit der Probe. Platzieren Sie die Platte sicher auf dem Tischhalter und überprüfen Sie die Stabilität des Probenhalters, um die korrekten Einstellungen für jede Probe zu gewährleisten.Passen Sie den Korrekturkragen an, während Sie fluoreszierende Perlen verwenden, um die Punktspreizungsfunktion mit der Augenöffnung zu visualisieren. Bestimmen Sie den Standort und die Ausrichtung der Hefe. Schalten Sie dann das erforderliche Epi-Fluoreszenzlicht ein und fokussieren Sie sich auf Zellen, die den relevanten Phänotyp aufweisen.Beurteilen Sie dann mit Hilfe des Hellfelds die Zellgesundheit und -viabilität anhand von Form und Textur für die Bewertung der Zellviabilität. Visualisieren Sie den Zellkern mit einem TD-Tomatenflora-Fluor, das mit einem SV 40- und LS-Signal fusioniert ist. TFP ist doppelt so groß wie GFP.Da es über der Diffusionsgrenze des Kerns liegt, eignet es sich sehr gut als Kernmarker. Stimulieren Sie das TFP mit einem grünen 4 88 Nanometer Laser gleichzeitig als GFP, aber sammeln Sie die grünen und roten Emissionen in zwei separate PMTs für die spektrale Auflösung. Um Rauschen und Sättigung zu minimieren, passen Sie die Laserleistung und den Lochblendendurchmesser an, wie im beigefügten Manuskript beschrieben.Wenn unterschiedliche Flora-Kräfte kongruente Wellenlängen emittieren, verwenden Sie die spektrale Detektorfunktion, die die Auswahl virtueller Filter ermöglicht, um Zeitrafferbilder gemäß dem experimentellen Design zu erfassen, das Misfolded Protein U BBC nine Ts bietet ein Modellsystem zur Verfolgung der Aggregationsqualitätskontrolle über Zeit und Raum. Im Zytosol bei der permissiven Temperatur ist UBC neun Ts gefaltet und diffundiert im Zellkern und im Zytosol bei hitzeinduzierter Fehlfaltung. Es bildet zunächst schnell diffundierende kleine zytosolische Aggregat-Puncta aus, die für den proteasomalen Abbau aufbereitet werden.Wenn das Proteasom teilweise gehemmt wird, werden diese Puncta im Laufe von etwa zwei Stunden in Junk und iPod-Einschlüsse umgewandelt. Unter normalen Bedingungen ist GFP UBC nine Ts nativ gefaltet und diffus im Zellkernzytosol lokalisiert, wie hier in grün zu sehen. Bei einem Temperaturanstieg auf 37 Grad Celsius ist das Fusionsprotein fehlgefaltet und bildet zytosolische Puncta-Aggregate, wenn es sich von einem Hitzeschock bei 23 Grad Celsius erholt.Die thermisch denaturierten G-F-P-U-B-C neun Ts werden abgebaut, was durch einen verminderten Fluoreszenzpegel angezeigt wird. Der Zellkern ist mit N-L-S-T-F-P rot markiert. Wenn die Temperaturverschiebung auf 37 Grad Celsius mit der Proteasom-Hemmung gekoppelt ist, werden die G-F-P-U-B-C neun Ts falsch gefaltet und zu Müll und iPod-Einschlüssen verarbeitet.Hier wird die Ubiquitin-Protease vier überexprimiert, um die Ubiquitinierungshemmung der Ubiquitinierung zusammen mit der Temperaturverschiebung zu blockieren, was zu einer Verarbeitung von G-F-P-U-B-C neun Ts in der iPod-Inklusion führt. Diese Zeitrafferbilder, die im Abstand von vier Minuten aufgenommen wurden, zeigen deutlich die Dynamik von Schrott und iPod-Bildung. Diese Technik kann verwendet werden, um die zelluläre Proteostase im Laufe der Zeit zu überwachen, indem UBC nine Ts als Faltungssensor verwendet wird.Die Vier-D-Bildgebung kann auch in anderen Modellsystemen wie Säugetierzellen und C elegance durchgeführt werden. Die Vier-D-Bildgebung ermöglicht auch Einblicke in andere feinstoffliche Ereignisse in der Aggregationsqualitätskontrolle, wie z. B. die Bildung und Dynamik löslicher Aggregatspannungsherde und die Abgabe von Aggregaten an die Junk- und iPod-Kompartimente.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video demonstrieren wir einen zellbasierten Proteinaggregationsassay mit Proteasom-Inhibitoren, die die Proteasomaktivität blockieren und verhindern, dass fehlgefaltete, mutierte Proteine, die mit einer fluoreszierenden Markierung fusioniert sind, einen Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau durchlaufen, was zu ihrer Akkumulation im Zellzytoplasma führt. Anschließend werden die Proteinaggregate mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und quantifiziert.

Protein Aggregate Formation Assay: Eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Proteinaggregation in kultivierten Zellen nach Induktion durch Proteasom-Inhibitoren

Dieses Video zeigt die Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in genetisch veränderten Drosophila-Gehirnen. Das Gehirn wird fixiert, gewaschen und mit einem Antifading-Mittel behandelt, bevor es montiert wird. Die Bilder werden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und quantifiziert, um die Übertragung mutierter Proteinaggregate zu beobachten.

Bildgebung und Quantifizierung von Proteinaggregaten in gentechnisch veränderten Drosophila-Gehirnen

Raumzeitliche Informationen über dynamische Proteine in lebenden Zellen sind entscheidend für das Verständnis der Biologie. Eine Art von hochauflösender Mikroskopie, die als schnelle 3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (f3D-SIM) bezeichnet wird, enthüllt einzigartige Informationen über den zytokinetischen Z-Ring in Bakterien: sowohl sein kügelchenartiges Aussehen als auch die schnelle Dynamik von FtsZ innerhalb des Rings.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Beweise sammeln, unterstützt die Idee, dass Pathogene Protein-Aggregate im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen verteilt zwischen den Zellen mit Prion-ähnliche Eigenschaften. Hier beschreiben wir eine Methode, die ermöglicht die Visualisierung von Zelle zu Zelle ausbreiten von Prion-ähnlichen Aggregaten im Modellorganismus Drosophila Melanogaster.

Überwachung von Zelle zu Zelle Übertragung von Prion-wie Protein-Aggregate in Drosophila Melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von fluoreszierend markierten intrazellulären Kompartimenten in angehender Hefe mittels mehrfarbiger 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D). Die bildgebenden Parameter werden ausgewählt, um geeignete Signale zu erfassen und gleichzeitig Photoschäden zu begrenzen. Benutzerdefinierte ImageJ-Plugins ermöglichen es, beschriftete Strukturen nachzuverfolgen und quantitativ zu analysieren.

4D-Mikroskopie der Hefe

In diesem Protokoll wird erläutert, wie bakterielle Proben für die dreidimensionale Bildgebung vorbereitet und montiert werden und wie die dreidimensionale Form von E. coli aus diesen Bildern rekonstruiert wird.

Dreidimensionale Bildgebung von Bakterienzellen für genaue zelluläre Darstellungen und präzise Proteinlokalisierung

Wir führen hier ein Verfahren zur Messung von Proteinoligomeren und Aggregation in Zelllysat und lebenden Zellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ein.

Nachweis der Proteinaggregation mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie

Hier wird eine Methode zur Analyse der Proteinaggregationskinetik im Fadenwurm Caenorhabditis elegans vorgestellt. Tiere aus einer alterssynchronisierten Population werden zu verschiedenen Zeitpunkten abgebildet, gefolgt von einer halbautomatischen Inklusionszählung in CellProfiler und Anpassung an ein mathematisches Modell in AmyloFit.

Überwachung der Proteinaggregationskinetik in vivo mittels automatisierter Einschlusszählung bei Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.

Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Erfahren Sie, wie 4D-Mikroskopie die Dynamik von Proteinfehlfaltung und Proteostase in lebenden Zellen visualisiert. Diese Methode ermöglicht die Verfolgung von Aggregaten und Qualitätskontrollmechanismen in Echtzeit.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

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