Name: Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf Mais rayado fino-Virus Virus-ähnliche Partikel Produziert in Nicotiana benthamiana Pflanzen und Vernetzung der Peptide an VLPs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie die Analyse der Lösungsmittelzugänglichkeit von Cysteinresten auf Virus-ähnlichen Partikeln des Mais rayado fino-Virus in Nicotiana benthamiana. Diese Methode ermöglicht die gezielte Vernetzung von Peptiden für Nanotechnologie-Anwendungen.

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Ein. Virus Impfung und VLPs Reinigung aus Nicotiana benthamiana Pflanzen <ol><li> Produzieren verkappt T7-RNA-Transkripte von Kartoffelvirus X (PVX)-basierten Vektorplasmide tragenden MRFV Wildtyp (wt) und Cys-mutierte Hüllprotein (CP) Gene 12, unter Verwendung Ambions T7-mMessage mMachine Kit. </li><li> Für jeden T7-Transkript Reaktion inokulieren zwei voll ausgebaut Blätter von N. benthamiana mit 10 ul Reaktionen und bebrüten die Pflanzen für 10 Tage im Gewächshaus bei 60% Luftfeuchtigkeit für 16 Stunden mit Licht (25.000-30.000 lux) bei 25 ° C und 8 h Dunkelheit bei 20 ° C. </li><li> Harves t N. benthamiana virus-infizierten Blättern 10 Tage nach der Inokulation (dpi), wiegen das Pflanzengewebe (50 Gramm) und auf Eis stellen. </li><li> Homogenisieren das Pflanzenmaterial in einem Mixer in Gegenwart von 100 ml einer gekühlten Lösung von 0,5 M Na-Citrat-Puffer, pH 5,5 (Einsatz 2 ml Puffer pro Gramm Pflanzengewebe). </li><li> Filtern Homogenat bis 3 Schichten cheeseclOTH und Klärung durch Zentrifugieren bei 27.000 × g für 30 min. Den Überstand in ein gekühltes Messzylinder, messen die Lautstärke, und dann übertragen auf eine gekühlte sterile Becher. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Verfahren Überstände durch Zugabe von 10% Polyethylenglykol 8000 (PEG 8000), Rühren für 15 min bei 4 ° C und Inkubation für weitere 45 min bei 4 ° C zur Ausfällung der Virus-ähnliche Partikel (VLP)-PEG-Matrix. </li><li> Zentrifugieren der Probe bei 27.000 × g für 20 min bei 4 ° C und Entfernen des Überstandes. </li><li> Verarbeiten das Pellet durch Zugabe von 8 ml von 0,05 M Na-Citrat, pH 5,5 mit 2% Triton X-100. Schwenken Sie die Röhrchen auch zum Lösen der Pellets. Übertragen Sie die Pellet-und Puffer, um ein gekühltes sterile Becher. Spülen Sie die Röhrchen sofort mit 2 ml des gleichen Puffers und fügen Sie den Becher. Man rührt die Suspension bei 4 ° C, bis die Pellets gelöst werden (im allgemeinen 1 Std.). </li><li> Klärung durch Zentrifugation für 5 min bei 27.000 × g, verwerfen des Pellets und prozess der Überstand durch Zentrifugation bei 140.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 1 ml 0,05 M Na-Citrat-Puffer, pH 5,5 und platzieren der Suspension auf einem 10-40% Saccharosegradienten in 0,05 M Na-Citrat-Puffer, pH 5,5 hergestellt. </li><li> Zentrifuge die Steigung für 3 Stunden bei 140.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Ein Licht über die Oberseite des Zentrifugenrohres und sammelt das Licht streuenden obere Bande bei 4 cm von dem oberen Ende des Rohres, verdünnt mit 0,05 M Na-Citrat-Puffer, pH 5,5, und Zentrifugieren für 3 Stunden bei 140.000 × g bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet in 0,5 ml sterilem Wasser und bei 4 ° C für bis zu sechs Monate. </li><li> Quantifizierung der VLPs Konzentration durch Ausführen eines Bradford-Protein-Assay. Die Ausbeute an VLPs zwischen 1 und 3 g / g von Pflanzengewebe. </li></ol> 2. Fluorescein-5-Maleimid-Kennzeichnung Reaktionen von VLPs <ol><li> Eine 1 mM-Lösung von Fluorescein-5-maleimid (427,37 g / mol) in 50 mM Natrium-PhosphatE-Puffer, pH 7,0, 1 mM EDTA. Mix mit den Wirbel, und überprüfen Sie die vollständige Auflösung. Schützen Sie das Rohr aus Licht mit Aluminiumfolie. </li><li> Fügen Fluorescein-5-Maleimid zu VLPs in Schritt 1 und Mix produziert. Verwenden eines 25-fachen molaren Überschuss von Fluorescein-5-maleimid für Molmenge Sulfhydryle. Generell mit 30 ul VLPs in einer Konzentration von 1 ug / ul und 60 ul des Fluorescein-5-Maleimid Lösung erzeugt akzeptable Ergebnisse. </li><li> Inkubieren der Reaktion für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Abbruch der Reaktion durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT) in einer Endkonzentration von 50 mM. </li><li> Entfernen nicht umgesetzten Fluorescein unter Verwendung einer Entsalzung Spinsäule (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) und Zentrifugation für 2 min bei 1500 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Für SDS-PAGE-Analyse, mit 10 ul 2 x Laemmli SDS-PAGE-Probenpuffer auf 10 ul jeder Reaktion. Bewahren Sie das markierte Protein von Licht bei 4 ° C geschützt bis zu einem Monat oderin Einzel-Aliquots bei -20 ° C bis zu 3 Monaten. </li></ol> 3. Markierungsreaktion und Bestimmung von Biotin Incorporation <ol><li> Verwenden Entsalzen Spinsäulen (Thermo Scientific Inc., Rockford IL), einen Puffer Austausch von Wasser zu Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,0 der VLPs in Schritt 1 erzeugten durchzuführen. </li><li> Bereiten Sie eine 20 mM Stammlösung von Maleimid-PEG2-Biotin durch Zugabe von 190 ul PBS im No-Weigh Maleimid-PEG2-Biotin und mischen Sie durch Auf-und Abpipettieren. </li><li> Fügen Maleimid-PEG2-Biotin an die VLPs und mischen. Verwenden eines 10-fachen molaren Überschuss an Reagenz zur VLP-Lösungen ≤ 2 mg / ml. </li><li> Inkubieren der Reaktion bei Raumtemperatur für 4 Stunden. </li><li> Entfernen nicht umgesetzten Maleimidbasis PEG2-Biotin unter Verwendung eines Spin-Säule entsalzt (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) und Zentrifugation für 2 min bei 1500 xg bei Raumtemperatur. </li><li> Bestimmen Sie die Mol Biotin pro Mol VLPs mit dem Pierce Biotin Quantifizierung Kit (Thermo Scientific) und following Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 4. Vernetzen von Cys 2-VLPs und F Peptid <ol><li> VLPs, welche im verfügbaren Cysteinreste zum Vernetzen in Schritt 2 (Cys 2-VLPs) geführt sind in der folgenden Stufe eingesetzt. Bereiten Sie eine neue Vernetzung Stammlösung (28,63 mM) durch Auflösen von 10 mg NHS-PEG4-Maleimid Vernetzer in 680 ul Dimethylsulfoxid. </li><li> Man löst eine 17 (F)-Aminosäuren langes Peptid (LLPNMOKDKEACAKAPL) in 50 ul Konjugationspuffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) in einer Konzentration von 0,1 mM. </li><li> Add 4 ul Quervernetzer bis 50 ul des gelösten Peptid (Protein-NH2) bei 1 mM Endkonzentration (das ist ein 10-facher molarer Überschuß für 0,1 mM Peptidlösung). </li><li> Inkubieren der Reaktion für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Läutern vernetzten Peptid unter Verwendung einer Entsalzungssäule (Thermo Scientific Inc., Rockford IL), äquilibriert mit Konjugationspuffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) durch Zentrifugation bei 1.500 xg1 min bei Raumtemperatur. </li><li> Einrichten einer Reaktionsmischung kombiniert VLPs (Protein-SH) und vernetztes Peptid (Protein-NH2) in einem molaren Verhältnis der Anzahl von Thiolen und Aminen aktiviertes in der Reaktion und die Differenz im Molekulargewicht zwischen VLPs und Peptid beteiligt bestimmt. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 2 h bei 4 ° C. </li><li> Für die Western-Blot-Analyse, mischen Sie die resultierende konjugierte Produkt 1:1 mit Laemmli-Puffer, kochen für 10 min, und fahren Sie mit SDS-PAGE auf einem pre-cast 10-20% Tris-Glycin-Gel (Invitrogen), gefolgt von Elektroblotten auf eine Nitrocellulosemembran (Invitrogen). Blockieren der Membranen mit 1 x PBS, pH 7,2, enthaltend 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) und 5% Magermilchpulver und Sonde mit Peptid-spezifischen Antikörper, die in geeigneten Phosphatase-markierten sekundären Antikörper folgt. </li></ol>

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</ol>

Die Erwähnung von den Handelsnamen von kommerziellen Produkten in der Publikation ist ausschließlich für den Zweck der Bereitstellung von Informationen und impliziert nicht, Empfehlung oder Billigung durch das US Department of Agriculture.

Das hier vorgestellte Verfahren erlaubt eine sehr empfindliche und schnelle Analyse von reaktiven Cysteine ​​auf der Oberfläche der Pflanzen produzierte VLPs sowie auf anderen Proteinkomplexen. Maleimide sind Thiol-spezifische Reagenzien, die mit freien Sulfhydryl enthaltenden Molekülen reagieren, um eine stabile Thioether-Bindungen zu bilden. Diese Methode stützt sich auf die Spezifität der Maleimide mit Sulfhydrylgruppen nicht in Wechselwirkungen mit anderen Aminosäuren beteiligt reagieren. Die Erhaltung der nativen S...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Thinwall, Ultra-Clear Tubes </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMessage mMachine T7 Kit </td><td> Leben Tecnologies </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescein-5-maleimid </td><td> Thermo Scientific Life Technologies </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 ist nicht in Ordnung Ersatz für F150 </td></tr><tr><td> Pierce Biotin Quantifizierungskit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Link Maleinimid-PEG2-Biotin, No-Wiegen Format </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM (PEG) n Vernetzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% Tris-Glycin-Gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli Buffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glycine SDS Laufpuffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glycine Transfer-Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatase markiert Affinity Purified Antibody to Kaninchen IgG </td><td> Kirkegaard und Perry Laboratories </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP Phosphatasesubstrat </td><td> Kirkegaard und Perry Laboratories </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse der solvent zugänglichkeit des cystein rückstände auf<em&gt; mais rayado fino-virus</em&gt; virus-ähnliche partikel produziert in<em&gt; nicotiana benthamiana</em&gt; pflanzen und vernetzung der peptide an vlps

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Imitieren und Nutzung Virus Eigenschaften und physikalisch-chemischen und physikalischen Eigenschaften verspricht, um Lösungen für einige der weltweit dringlichsten Herausforderungen. Die schiere Reichweite und Arten von Viren mit ihren faszinierenden Eigenschaften gekoppelt potenziell geben unendlich viele Möglichkeiten für Anwendungen in der Virus-basierten Technologien. Viren haben die Fähigkeit, zu Teilchen mit diskreten Form und Größe, Spezifität Symmetriegründen polyvalence und stabile Eigenschaften in einem weiten Bereich von Temperatur und pH-Bedingungen selbst zusammen. Es überrascht nicht, mit einer solchen Reihe von bemerkenswerten Eigenschaften, werden Viren zur Verwendung in Biomaterialien 9, Impfstoffen 14, 15, elektronische Materialien, chemische Werkzeuge und molekularen elektronischen Behälter 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12 vorgeschlagen. Um Viren in der Nanotechnologie zu verwenden, müssen sie aus ihren natürlichen Formen modifiziert werden, um neue Funktionen zu verleihen. Diese anspruchsvolle prozess kann durch verschiedene Mechanismen, einschließlich genetischer Modifikation des viralen Genoms und chemisch Anbringen fremden oder gewünschten Moleküle an die Viruspartikel reaktiven Gruppen 8 durchgeführt werden. Die Fähigkeit, einen Virus zu modifizieren vorwiegend abhängig von den physikalisch-chemischen und physikalischen Eigenschaften des Virus. Darüber hinaus müssen die genetische oder physiochemischen Modifikationen ohne Beeinträchtigung der nativen Struktur Virus und Virus-Funktion ausgeführt werden. Maize rayado fino Virus (MRFV) Hüllproteinen in Escherichia coli Herstellung stabiler und leere VLPs, die durch Protein-Protein stabilisiert sind selbstorganisieren Interaktionen und die in Virus-basierten Technologien Anwendungen 8 verwendet werden. VLPs in Tabakpflanzen hergestellt wurden als ein Gerüst, auf dem eine Vielzahl von Peptiden kovalent angezeigt werden 13 untersucht. Hier beschreiben wir die Schritte 1) bestimmen, welche der Lösungsmittel-zugänglichen Cysteine ​​in einem Virus-Kapsid sind für ModifikationenKation, und 2) Bioconjugate Peptide an den modifizierten Kapside. Durch die Verwendung von nativem oder durch Mutation eingefügten Aminosäurereste und Standardkoppelstellen Technologien haben eine breite Vielfalt von Materialien auf der Oberfläche von Pflanzenviren wie Brome Mosaic Virus 3, Carnation-Mottle-Virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tabak Mosaik angezeigt worden Virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1 und MRFV 13.

Transiente Expression von mutierten MRFV Hüllproteins (CP) Gene in N. benthamiana Pflanzen in einem PVX-basierten Vektor Herstellung VLPs ist in Abbildung 1 beschrieben. Das modifizierte MRFV Hüllproteingen wird durch PCR amplifiziert und dann platziert unter der transkriptionellen Kontrolle des duplizierten subgenomische CP-Promotor in einem PVX-basierten Vektor, pP2C2S 2, (ein Geschenk von D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, England). Im vitro RNA-Transkription ...

Ein Verfahren, um das Lösungsmittel Zugänglichkeit der Thiolgruppe von Cystein-Resten der Analyse<em&gt; Mais rayado fino-Virus</em&gt; (MRFV)-Virus-ähnliche Partikel (VLP) durch ein Peptid Vernetzungsreaktion folgt beschrieben. Das Verfahren nutzt die Verfügbarkeit von mehreren chemischen Gruppen auf der Oberfläche der VLPs, die als Ziele für spezielle Reaktionen sein kann.

Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf<em&gt; Mais rayado fino-Virus</em&gt; Virus-ähnliche Partikel Produziert in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Pflanzen und Vernetzung der Peptide an VLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Analyse der Lösungsmittelzugänglichkeit von Cystein-Resten auf der Oberfläche von Virus-ähnlichen Partikeln oder VLPs durchzuführen, gefolgt von einer Vernetzung von Peptiden mit Cystein auf den virusähnlichen Partikeln. Dies wird erreicht, indem zunächst das Hüllprotein des Maisstreifenvirus (Maize rayado fino virus, MRFV) in einem auf dem Kartoffelvirus X basierenden Virusvektor kloniert wird. Anschließend werden N. benthamiana-Pflanzen mit dem modifizierten Virus infiziert, und die aus dem Hüllprotein gebildeten MRFV-VLPs werden gereinigt. Schließlich werden die VLPs und Peptide mittels Ammoniak-PEG4-Maleimid vernetzt und per Western Blot nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen die Herstellung von VLP-Peptid-Komplexen durch Western-Blot-Analyse. Die Methode erweitert das Wissen darüber, wie die Oberfläche von Viren und virusähnlichen Partikeln chemisch modifiziert werden kann, um neue Materialien für die Nanotechnologie herzustellen. Nach der Herstellung von kappten T7-RNA-Transkripten aus auf einem Kartoffelvirus-X-basierten Vektorplasmid, das die Wildtyp- und cys-mutierte H&uuml;llprotein-Genen von MRFV tr&auml;gt, jeweils

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Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Testen Protein-Protein-Interaktion ist für die Präparation von Protein-Funktionalität unverzichtbar. Hier stellen wir...

Proteinmembran Overlay Assay: Ein Protokoll, die Interaktion zwischen löslichen und unlöslichen Proteinen testen In-vitro-</em

Reaktive Sauerstoffspezies Niveau angehoben wird, wenn Zellen begegnen Stressbedingungen. Hier zeigen wir das Beispiel von 3'-3 'Diaminobenzidin-Färbung sowie cysTMT Kennzeichnung und Massenspektrometrie, um die Redox-Proteom im...

Profiling Thiolredox Proteome Mit Isotopen-Massenspektrometrie Tagging

Pflanzen virale Nanopartikel (VNPS) sind vielversprechende Plattformen für Anwendungen in der Biomedizin. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Anlage VNP Ausbreitung, Reinigung, Charakterisierung und Biokonjugation. Schließlich zeigen wir die Anwendung der VNPS für die Tumor-Homing und Bildgebung mit der Maus Xenograft-Modell und Fluoreszenz-Bildgebung.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Quelle: Natilla, A., und Hammond, R. W. Analyse der Lösungsmittelzugänglichkeit von Cysteinresten auf Virus-ähnlichen Partikeln des Maisstreifenvirus, hergestellt in Nicotiana benthamiana-Pflanzen, und Vernetzung von Peptiden an VLPs. J. Vis. Exp. (2013)Dieses Video zeigt die ortsspezifische fluoreszierende Markierung von in Nicotiana benthamiana hergestellten mutierten Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) mittels eines thiolreaktiven Farbstoffs, gefolgt von der Reinigung und Gelelektrophorese zur...

Markierung von oberflächenzugänglichen Cysteinresten in biotechnologisch hergestellten virusähnlichen Partikeln

Gezielte Proteinabbau stellt einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zellfunktion. Es tritt über eine konservierte Ubiquitin-Proteasom-Weg, der Polyubiquitinketten an das Zielprotein, die dienen dann als molekulare "Tags" für die 26S-Proteasom isst. Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige zellfreien Assays für den proteasomalen Abbau von Proteinen.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

Die Bestimmung der Lösungsstruktur eines Proteins durch Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS) erfordert monodisperse Proben. Hier stellen wir zwei Möglichkeiten minimalen Verzögerungen zwischen der Probenvorbereitung und Datenerfassung zu gewährleisten: Online-Größenausschluss-Chromatographie (SEC) und Online-Ionenaustauschchromatographie (IEC).

Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Biochemische und strukturelle Analysen des glykosylierten Proteinen erfordern relativ große Mengen an homogenen Proben. Hier präsentieren wir Ihnen eine effiziente chemische Methode für standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen durch gezielte reaktive Cys Thiole von Bakterien gereinigt.

Targeting Cystein Thiole für in-vitro- standortspezifische Glykosylierung von rekombinanten Proteinen

Hier präsentieren wir Ihnen eine Prozedur zum eindringmittel Funktionalisieren Disulfides auf Qβ VLP mit Dibromomaleimide. Wir beschreiben Qβ Ausdruck und Reinigung, die Synthese von Molekülen Dibromomaleimide funktionalisiert und die Konjugation-Reaktion zwischen Dibromomaleimide und Qβ. Das daraus resultierende gelbe fluoreszierende konjugierte Teilchen kann als Fluoreszenz Sonde innerhalb der Zellen verwendet werden.

Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen

Wir präsentieren ein allgemeines Protokoll zur Identifizierung kurzer Strecken homologe Wirt-Pathogen-Proteinsequenzen (SSHHPS), die in das virale Polyprotein eingebettet sind. SSHHPS werden durch virale Proteasen erkannt und leiten die gezielte Zerstörung bestimmter Wirtsproteine durch mehrere Viren der Gruppe IV.

Analyse von viralen SSHHPS der Gruppe IV mit In-vitro- und Silico-Methoden

Dieses Protokoll beschreibt die Auswahl optimaler plasmodesmaler Marker für konfokalmikroskopische Analysen von Proteinen, die während Virus-Plasmodesmata-Interaktionen oder des plasmosmodesmalen Transports auf Plasmodesmen abzielen.

Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

Erfahren Sie die Analyse der Lösungsmittelzugänglichkeit von Cysteinresten auf Virus-ähnlichen Partikeln des Mais rayado fino-Virus in Nicotiana benthamiana. Diese Methode ermöglicht die gezielte Vernetzung von Peptiden für Nanotechnologie-Anwendungen.

Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf Mais rayado fino-Virus Virus-ähnliche Partikel Produziert in Nicotiana benthamiana Pflanzen und Vernetzung der Peptide an VLPs (Video) | JoVE Journal

Analyse der Solvent Zugänglichkeit des Cystein Rückstände auf

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