Name: Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Lernen Sie die kombinierte Immunfluoreszenz- und DNA-FISH-Methode zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen und DNA-Sequenzen in 3D-erhaltenen Zellkernen. Dieses Protokoll ermöglicht Zellbiologen und Genetikern die Analyse chromatindynamischer Prozesse.

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Wir möchten die Mitglieder des Skok Labor, vor allem Susannah Hewitt, für Diskussionen und Kommentare. Diese Arbeit wird durch das National Institute of Health Zuschüsse R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) unterstützt. JAS ist ein Leukemia &amp; Lymphoma Society Gelehrter. JC ist ein Irvington Institute Fellow des Cancer Research Institute. MM wird von der National Science Foundation Grant Integrative Graduate Bildung und Forschung Traineeship (NSF IGERT 0.333.389) unterstützt.

Ein. DNA Probe Labeling mit Fluorophoren: Nick Translation (~ 6 h) <ol><li> Saubere BAC DNA (hergestellt von Maxi-Prep) oder Plasmiden oder PCR-Produkte, die alle in H 2 O resuspendiert, kann für die Etikettierung verwendet werden. Beachten Sie, dass für eine robuste FISH Signal, Sonden sollten mindestens 10 kb überspannen. </li><li> Inkubieren DNA in RNase A während 30 min bei 37 ° C (alle Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt). </li><li> Inkubieren Sie die Nick-Translation Reaktion für 2 h bei 16 ° C (siehe Tabellen 2 und 3). Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung verwendet werden (Beispiel: FISH Tag, Invitrogen) werden. </li><li> Inaktivieren die Reaktion für eine Stunde bei -80 ° C oder über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Bestimmen Sondengröße auf einem 2% Agarosegel. Der Abstrich sollte zwischen 100 und 1.000 bp, wobei die Mehrheit bei ca. 300-500 bp (Beachten Sie, dass der Abstrich von Cy5-Sonden nicht sichtbar ist). Wenn die DNA nicht verdaut ist genug, mehr DNA Pol I undDNase I kann in die Reaktion hinzugefügt und inkubiert für zwei weitere Stunden bei 16 ° C. </li><li> Läutern Sonden auf 0,025 mm Filter in zwei Liter-Becher gefüllt mit H 2 0 für zwei Stunden im Dunkeln. </li><li> Fügen Sie blockierende Faktoren zu den Sonden wie folgt: 10 ug Cot-1 DNA, 10 ug Hybloc DNA und 100 ug Lachssperma für 10 pg DNA-Sonden. Shop DNA-Sonden bei -20 ° C. </li></ol> 2. Probe Niederschlag / Denaturierung / Pre-Annealing (3-4 Std.) <ol><li> Zwischen 0,3 ug und 1 pg DNA-Sonde wird pro Deckglas verwendet. Mischung Sonden mit 0,1 Vol. 3 M NaAc (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100% Ethanol für eine Stunde bei -80 ° C inkubieren oder über Nacht bei -20 ° C und Spin-down bei 13.000 rpm bei 4 ° C für 30 min. Man beachte, dass die Menge an DNA-Sonde eingestellt werden kann, je nach Qualität der DNA und der Kernbereich der Hybridisierung werden. Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung kann die Verwendung der reduzierten MengenSonde. Zur Detektion von mehreren DNA FISH-Signale auf einer Folie können die unterschiedlichen Sonden zusammen ausgefällt werden (außer Sonden, die nicht vorher geglüht, sollte ähnlichen Repeat-Sequenzen). Sonden für mehrere Experimente zur gleichen Zeit ausgeführt werden können auch zusammen ausgefällt werden. Pellets sollten leicht nach den Fluorophoren verwendet werden (wenn kleine Mengen von Sonden ausgefällt werden, das Pellet möglicherweise nicht sichtbar) eingefärbt werden. </li><li> Trockene Pellets und resuspendieren Sie in 15 ul Hybridisierungspuffer (siehe Tabelle 4) pro Deckglas unter Schütteln (mit einem Eppendorf Thermomixer) im Dunkeln bei 37-45 ° C (ca. 20 min). </li><li> Denaturieren Sonden für 5 min bei 75-95 ° C. </li><li> Pre-annealen Sonden bei 37 ° C für 30-60 min. Länge Vorglühen kann in Abhängigkeit von der Komplexität und Qualität der Sonden werden. </li><li> Bewerben Sonden an die Deckgläser über Nacht Hybridisierung (siehe Abschnitt 3). </li></ol> 3. 3-Dimensionalen DNA FISH - First Day (~ 3 Stunden) <ol><li> Nicht-adhärente Zellen werden in einem kleinen Volumen von 1x PBS (~ 2x10 5 Zellen in 5-10 ul PBS 1x pro Deckglas) eingeengt und ließ sich auf der Mitte eines Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen. Adhärenten Zellen auf Deckgläsern sollte mindestens 24 Stunden (~ 70% Konfluenz) (Deckgläser kann mit 0,1% Gelatine beschichtet sein) kultiviert werden. Quadratischen 18x18 um 24-24 mm-Deckgläschen werden in 6-well Platten gegeben und während des Protokolls, zwei ml jeder Lösung wird pro Vertiefung verwendet (alternativ runde Deckgläser 1,5 mm können in 12/24-well Platten platziert werden). </li><li> Fix Zellen in 2% Paraformaldehyd / 1x PBS, pH 7-7,4, 10 min bei RT (4% PFA Bestände aliquotiert, gelagert bei -20 ° C). Paraformaldehyd in Lösung erworben werden (16%) bzw. 4% Stammlösungen aus Pulver / Granulat zubereitet werden. Paraformaldehyd Pulver wird in 1x PBS bei&gt; 60 ° C (pH kann auf 8-9 erhöht werden, um die Auflösung zu erleichtern), abgekühlten auf Eis, passen gelösted zu pH 7-7,4, filtriert, in falcons aliquotiert und über Wochen bei -20 ° C. </li><li> Nach drei Spülungen in 1x PBS, permeabilisieren Zellen in vereisten kalte 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS für 5 min auf Eis. Länge der Permeabilisierung kann angepasst je nach Zelltyp werden. Hinweis: Wenn DNA FISH mit Immunfluoreszenz kombiniert wird, die Immunfärbung sollten in dieser Phase durchgeführt werden (siehe Abschnitt 4). </li><li> Nach drei Spülungen in 1x PBS, inkubieren Zellen mit 0,1 ug / ul RNase A in 1x PBS für eine Stunde bei 37 ° C. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 100 ul Lösung auf Parafilm oder einer Folie in einer feuchten Kammer. Deckgläser werden dann vorsichtig mit einer Pinzette entfernt. Wenn ein Widerstand auftritt, sollte Deckgläser mit 1x PBS geflutet werden, um eine Beschädigung der Zellen. </li><li> Nach drei Spülungen in 1x PBS, permeabilisieren Zellen in vereisten kalte 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl für 10 min auf Eis. </li><li> Nach drei Spülungen in 1x PBS, denaturieren Zellen in 1,9 M HCl für 30 min bei RT. Alternativ können Zellen, die in 50% Formamid / 2 × SSC bei 75-80 ° C für mindestens 30 min denaturiert. Beachte, dass Hybridisierung Länge (und Temperatur) können optimiert, je nach Zelltyp werden. </li><li> Nach drei Spülungen in eiskaltem 1x PBS, hybridisieren Zellen mit Sonden über Nacht bei 37 ° C in einem dunklen und feuchten Kammer. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf ein Minus von 15 ul der Sonde auf einem Schlitten, und versiegelt mit Gummi-Zement. </li></ol> 4. 3-dimensional Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 Std.) <ol><li> Für kombinierte Immunfluoreszenz / DNA FISH sollte Immunfärbung nach Permeabilisierung in 0,4% Triton-X-100 (Schritt 3.3) durchgeführt werden. </li><li> Inkubieren Zellen in Blocking-Lösung für 30 min bei RT (2,5% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normales Ziegenserum, 0,1% Tween-20). Die Blockierungslösung wird filtriert, in 1,5 ml aliquotiert Eppendorfs und gespeichert monate bei -20 ° C. </li><li> Inkubieren von Zellen mit dem primären Antikörper gegen das Protein oder das Histonmodifikation von Interesse in Blockierungslösung verdünnt angehoben, für eine Stunde bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Hier zeigen wir am Beispiel eines Antikörpers gegen phosphoryliertes Serin-139 der H2AX (γ-H2AX, Millipore; siehe Tabelle 5 für Details). Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 100 ul Lösung auf Parafilm oder einer Folie in einer feuchten Kammer. Deckgläser Dann gibt man vorsichtig mit einer Pinzette (geflutet mit 1x PBS falls erforderlich) entfernt. Hinweis, dass eine Verdünnung und Inkubation Länge eingestellt werden kann, je nach Qualität des Antikörpers und Zell-Typen verwendet werden. </li><li> Waschen der Zellen in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, dreimal 5 min bei RT mit Schütteln. </li><li> Inkubieren von Zellen mit dem entsprechenden Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in Blocking-Lösung für eine Stunde bei RT in einer dunklen und feuchten Kammer verdünnt. Hier zeigen wir ein Beispiel für einen Nachweis mitsekundären Ziege-Anti-Maus-Antikörper (Alexa Fluor 488 oder 555, Invitrogen; siehe Tabelle 5 für Details). Hapten-konjugierten Sekundärantikörper (Biotin, Digoxigenin, etc) könnten ebenfalls verwendet werden. In diesem Fall kann ein zusätzlicher Schritt für geeignete Nachweismethoden (Streptavidin, anti-dig, etc) entweder vor oder nach der Über-Nacht-DNA-FISH-Hybridisierung durchgeführt werden. </li><li> Spülen Zellen in 0,1% Tween-20 / 1x PBS, dreimal 5 min bei RT mit Schütteln im Dunkeln. </li><li> Post-Update-Zellen in 2% Paraformaldehyd / 1x PBS für 10 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Weiter DNA FISH wie oben beschrieben aus der Inkubation in RNase A (Schritt 3,4). </li></ol> 5. 3-dimensional DNA FISH / Immuno-FISH - Zweiter Tag (~ 2 h) <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig Gummilösung, Überschwemmung Deckgläser mit 2x SSC, vorsichtig mit einer Pinzette zu entfernen und sie in Vertiefungen mit Waschlösung. </li><li> Waschen der Zellen in 2 × SSC für 30 Minuten bei 37 ° C im Dunkeln unter Schütteln.</li><li> Waschen der Zellen in 2 × SSC für 30 Minuten bei RT im Dunkeln unter Schütteln. </li><li> Waschen der Zellen in 1x SSC 30 min lang bei RT im Dunkeln unter Schütteln beachte, dass im Falle der Denaturierung mit Formamid, Waschungen durch die folgende ersetzt werden:. 3 Waschschritten in 50% Formamid / 2 × SSC und 3 Waschungen in 2 × SSC, 5 min jeweils bei 37 ° C. </li><li> Montieren Zellen in ProLong Gold Montagetyp Medium mit 1,5 g / ml DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole) für Gegenfärbung der Gesamt-DNA. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 10-15 ul Eindeckmedium auf einer Folie und versiegelt mit Nagellack. Slides sind für Monate bei -20 ° C gehalten </li></ol> 6. 3D-Mikroskopie und Analyse <ol><li> 3D-Bilder können mit verschiedenen Mikroskop-Systeme erworben werden. In unseren Experimenten werden optische Schnitte von 0,3 um getrennt auf einem Leica SP5 AOBS konfokalen System (Akusto-Optical Beam Splitter) gesammelt. Beachten Sie, dass die Trennung zwischen optical Ebenen kann in Abhängigkeit von der Art der Analyse ist. </li><li> 3D-Bild Stapel analysiert mit unterschiedlichen Software und Tools werden. Wir verwenden das Image J Software Abstandsmessungen zwischen Loci von Interesse zu beurteilen und verschiedene Arten der Assoziation der Loci von Interesse mit sub-atomaren Fächer oder Proteine ​​zu analysieren. </li><li> Alle statistischen Analysen durchgeführt, um zwei Vergleichen (oder mehr) unterschiedlichen biologischen Bedingungen mit paarweise Beurteilung (en) von Bedeutung: Vergleich zwischen verschiedenen Zelltypen oder Stufen, Vergleich zwischen verschiedenen Loci von Interesse. In allen statistischen Tests, P-Werte ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) werden als signifikant (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * signifikant; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * sehr bedeutsam; P &lt;1,00 E-3 *** hoch signifikant). </li></ol> Die statistische Analyse der gesamten Verteilungen der Abstände zwischen zwei Allelen. Zunächst construct Verteilungsfunktion Frequenz-Kurven über den gesamten Bereich der gemessenen Abstände zwischen den beiden alleles.To Beurteilung der Signifikanz der Unterschiede in der Verteilung der empirischen inter-Allel Distanzen nutzen wir die nichtparametrische zwei Stichproben Kolmogorov-Smirnov (KS-Test) 13,14. Statistische Analyse der engen Verbindung (dh Paarung) zweier Allele mit einem optimalen Abstand abgeschnitten. Um den Bereich der robustesten Unterschieden in der Entfernung zwischen zwei Allele oder Loci zu identifizieren, verwenden wir eine Reihe von zweiseitigen Fisher Exact Test 15 s. Nämlich an jedem gemessenen Abstand testen wir, ob eine Bedingung signifikant ist bei kürzeren Entfernungen zwischen den zwei Proben überrepräsentiert. Die minimale in der Verteilung der P-Werte gibt den Bereich von Abständen, der als Grenzwert für enge Verbindung (dh Paarung) der beiden Allele berücksichtigt werden sollten. Anschließend wird die zweiseitigen Fisher Exact Test wird t verwendeto Beurteilung der Bedeutung der Paarung zweier Allele bei der identifizierten cut-off-Wert 15. Mehrere Tests Korrekturen zur Berücksichtigung der Gesamtzahl der Fisher-Tests angewendet durchgeführt 16. Statistische Analyse der Assoziation der Ort des Interesses mit sub-atomaren Fächer oder Proteine. Die zweiseitigen Fisher-Exact-Test wird verwendet, um die Bedeutung der Vereinigung der Locus von Interesse mit verschiedenen Fächern oder Proteine ​​15 zu analysieren.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Techniken detailliert wurden oben in unserem Labor verwendet werden, um die Regulation der V (D) J-Rekombination der Immunglobulin und TCRA / d loci in Entwicklungsländern Lymphozyten 30,31 analysieren. Wir sind sicher, dass diese Technik für die Detektion verschiedener Kernproteinen, nukleare Abteile und Loci, in verschiedenen Zelltypen angepasst werden kann. Modifikationen des Protokolls notwendig sein kann, und in diesem Fall die Hauptschritte zu konzentrieren sind die folgenden. Erst...

Epigenetische Mechanismen auslösen Aufbau und Vererbung von Entwicklungs-und Zelltyp-spezifische Transkriptions-Profilen. Auf einer Ebene Dies beinhaltet Modulation der Chromatinstruktur Verpackungen, die aktive oder stille genomischen Regionen definiert. In einem größeren Maßstab, globale 3D Organisation des Genoms und Zellkernarchitektur spielen ebenfalls eine Rolle bei der Kontrolle der Transkriptions-Mustern. So ist Dissektion dieser epigenomischen wesentliche Merkmale für ein volles Verständnis, wie Gene 6-11 geregelt. Kombiniert Immunfluoreszenz-und 3D-DNA FISH bieten eine einzigartige Möglichkeit, molekulare und biochemische Analysen Beurteilung spezifischer Interaktionen / Verbände von DNA-Sequenzen und / oder Proteinen im Zellkern zu ergänzen. Hinzu kommt, dass genomweite Hochdurchsatztechniken wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-seq) oder Chromosom capture Konformation mit deep sequencing gekoppelt (4C-seq, 5C, Hallo-C) liefern globale data auf Zellpopulationen 12 ermöglichen Immunfluoreszenz / DNA FISH-Techniken Analysen der einzelnen Zelle Ebene. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-FISH) gefolgt. Der Vorteil dieses Protokolls ist die kombinierte Visualisierung von DNA und Konservierung von Proteinstrukturen. Unsere Erfahrung in diesem Bereich hat es uns ermöglicht, zu verbessern und zu vereinfachen bestehende Protokolle. Obwohl wir dieses Protokoll verwendet wurden, um DNA-Doppelstrang-Pausen in Lymphozyten unterziehen Rekombination detektieren kann dieses Verfahren an andere Proteine ​​und andere Zelltypen verwendet werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Fischer </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397-C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 oder Cy5 dUTP </td><td> Fischer </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0,025 um Filter </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1-DNA 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 mg / ml </td><td> Angewandte Genetik </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> Lachssperma </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> Pulver bei 10 mg / ml in H 2 O resuspendiert werden </td></tr><tr><td> NaAc (Natriumacetat, pH 5,2, Puffer-Lösung) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol Biol grade) </td><td> Fischer </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidon (Mol Biol grade) </td><td> Fischer </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Dextransulfat Pulver </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x-Lösung </td&gt; <td> Fischer </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Fischer </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Fischer </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td> Fischer </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platten </td><td> Fischer </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Fischer </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin-Lösung </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd, Prills, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol Grade </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) Fraktion V </td><td> Fischer </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol Grade </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (Saline Sodium Citrate) 20x-Lösung </td><td> Fischer </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold-antifade Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-Phenylindol) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Bester Test eine Schicht Gummi-Zement </td><td> Kunst oder Büromärkten </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Spezifische Reagenzien und Kleingeräten. </td></tr></tbody></table>

kombiniert immunfluoreszenz und dna fish auf 3d erhaltene interphase nuclei, um Änderungen in 3d nuclear organization study

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung mit DNA-Sonden auf 3-dimensional erhalten Kerne durch 3D-konfokale Mikroskopie verfolgt (3D DNA FISH) stellt die direkteste Weg, um die Lage der Gen-Loci, chromosomalen Subregionen oder ganze Gebiete in einzelnen Zellen zu visualisieren. Diese Art der Analyse gibt einen Einblick in die globale Architektur des Zellkerns als auch das Verhalten der spezifischen genomischen Loci und Regionen innerhalb der nuklearen Raum. Immunfluoreszenz, auf der anderen Seite erlaubt die Detektion von nuklearen Proteinen (modifizierte Histone, Histon-Varianten und Modifikatoren, Transkription Maschinen und Faktoren, Atom-U-Fächer, etc). Die große Herausforderung in der Kombination Immunfluoreszenz und 3D DNA FISH ist, einerseits um das Epitop von dem Antikörper sowie die 3D-Architektur des Kerns detektiert erhalten und andererseits, damit das Eindringen der DNA-Sonde zu detektieren Genloci oder Chromosom Gebieten 1-5. Hier bieten wir ein Protokoll, das die Visualisierung von Chromatin Modifikationen mit genomischen Loci in 3D erhalten Kernen kombiniert.

DNA und Immuno-FISH sind im Laborbetrieb Skok um die Änderungen in Atom-Organisation mit dem Verfahren der V (D) J-Rekombination von Antigenrezeptors Loci während der B-und T-Lymphozyten-Entwicklung verbunden studieren. Die Techniken zuvor dargelegten uns ermöglichen, i) Messung Abstände zwischen den beiden Enden eines Locus (Kontraktion) ii) messen Abstände zwischen Allelen oder Loci (Paarung), iii) eine Analyse der DNA-Schädigung, die innerhalb Loci, iv) Bewertung der Standort der Allele und loci Bezug auf Atom-U-Fäch...

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-DNA FISH) gefolgt.

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Chromatinmodifikationen und DNA-Sequenzen gleichzeitig mit Hilfe der konfokalen 3D-Mikroskopie zu detektieren, wobei zunächst spezifische DNA-Sonden erzeugt werden. Währenddessen werden die experimentellen Zellen mit fester Dauerwelle und immungefärbt. Für die Histon-Marker von Interesse.Die Zellen werden dann denaturiert und über Nacht fluoresziert in Ihnen. Die Hybridisierung oder Fisch wird mit einer oder mehreren DNA-Sonden durchgeführt. Abschließend werden die Küvetten gewaschen und für die 3D-Fluoreszenz eingelagert.Die mikroskopische Analyse der resultierenden Bilder zeigt die nukleare Lokalisierung von interessierenden Loci und die Assoziation mit spezifischen Steinmodifikationen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung von Kernproteinen, einschließlich Steinen, mit genomischen Loci in 3D-Konservierungskernen kombiniert und zur Beantwortung wichtiger Fragen auf dem Gebiet der epigenetischen Organisation des Chromatins oder der Genregulation beitragen kann. Für dieses Verfahren können entweder Rückseitenplasmide oder PCR-Produkte zur Markierung verwendet werden.Diese sollten wie im Begleittext beschrieben vorbereitet werden. Beachten Sie, dass die Sonden für ein robustes Fischsignal mindestens 10 Kilobasenpaar benötigen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ein Mikrogramm DNA und 0,17 Mikrogramm RNAs A in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren.30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die RNAs A auf Eis kurz inaktivieren und die entsprechende Menge Nick-Translation hinzufügen. Mischen, zwei Stunden bei 16 Grad Celsius in einem gekühlten Wasserbad oder einem kühlen Block inkubieren, um die Reaktion zu inaktivieren.Stellen Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius oder über Nacht bei minus 20 Grad Celsius auf. Bestimmen Sie als Nächstes die Sondengröße auf einem 2%igen Agros-Gel. Der Abstrich sollte zwischen 101.000 Basenpaaren liegen, wobei die Mehrheit bei etwa 300 bis 500 Basenpaaren liegen sollte.Beachten Sie, dass der Abstrich von Science-Fiction-Sonden nicht sichtbar ist. Sobald die Größe bestimmt wurde, reinigen Sie die Sonden durch Dialyse auf 0,02. Fünf-Millimeter-Filter in zwei Liter-Bechern, die mit Wasser gefüllt sind.Pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikrogramm der Sonde in die Mitte jedes schwimmenden Filters und inkubieren Sie sie dann zwei Stunden lang im Dunkeln. Nach der Inkubation befördern Sie die Sonde mit einer Pipette vorsichtig von den Filtern in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie als Nächstes den Prüfpunkten wie folgt Blockierungsfaktoren hinzu.Ein Mikrogramm CO 1D NA. Ein Mikrogramm High-Block-DNA und 10 Mikrogramm Lachssperma für ein Mikrogramm DNA-Sonde und Mix, lagern Sie die DNA-Sonden bei minus 20 Grad Celsius. Am Tag der Fischprozedur werden die Sonden ausgefällt und für den Einsatz vorbereitet. Beachten Sie, dass die in diesem Abschnitt des Videos beschriebenen Schritte parallel zu den Schritten im folgenden Abschnitt ausgeführt werden sollten.Um die Sonden auszufällen, folgen Sie ihnen und kombinieren Sie sie mit 0,1 Volumen von drei molaren Natriumacetat bei pH 5,2 und 2,5 Volumen von 100% Ethanol inkubieren Sie eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Inkubation drehen Sie die Sonden 30 Minuten lang bei 16.000 G bei vier Grad Celsius herunter. Nach dem Schleudern den Überstand entsorgen und die Pellets im Dunkeln an der Luft trocknen.Abhängig von der Menge und Farbe der Sonden kann das Pellet sichtbar sein oder auch nicht. Reanimation: Das Pellet in 15 Mikrolitern Hybridisierungspuffer pro Testbedingung suspendieren und mit einem einor-Thermomischer im Dunkeln bei 37 bis 45 Grad Celsius etwa 20 Minuten lang schütteln. Zur Denaturierung inkubieren die Sonden diese anschließend fünf Minuten lang bei 75 bis 95 Grad Celsius.Um die Sonden vorzubereiten, inkubieren Sie sie dann bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten auf dem Thermomischer. Unmittelbar nach der Inkubation werden die Sonden auf Zellen auf Deckgläsern aufgebracht, wie im nächsten Abschnitt des Videos beschrieben. Beachten Sie, dass für die folgenden Schritte die Inkubationszeiten je nach Bedarf für die verwendeten Antikörper und Zellen geändert werden sollten.Die in diesem Abschnitt des Videos beschriebenen Schritte sollten parallel zu den Schritten im vorherigen Abschnitt ausgeführt werden, wie im Begleittext beschrieben. Legen Sie nicht adhärente Zellen auf die mit Polylysin beschichteten Deckblätter in Vertiefungen mit sechs Vertiefungsplatten und lassen Sie sie fünf Minuten lang anhaften. Geben Sie dann vorsichtig zwei Milliliter 2%-Paraform-Aldehyd in PBS-Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur nach der Inkubation.Spülen Sie jede Mulde einmal mit PB S3 aus, um die Zellen durchlässig zu machen, fügen Sie zwei Milliliter eiskaltes Triton hinzu, 0,4% Triton X 100 in PBS und inkubieren Sie fünf Minuten auf Eis. Nach dem Aspirieren der durchlässigen Lösung, wenn DNA-Fische mit Immunfluoreszenz kombiniert werden, gehen Sie wie folgt vor. Pipettieren Sie zunächst 100 Mikroliter der Blockierungslösung in einer befeuchteten Kammer auf den Parameter.Legen Sie die Deckschicht mit der Schiebezelle nach unten auf die Blockierlösung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie als nächstes. Die Abdeckung wird auf 100 Mikroliter des in Blockierungslösung verdünnten Primärantikörpers aufgeschoben.Dabei erkennt der verwendete Antikörper phosphoryliertes syrisches 1 39 von H zwei A x oder gamma H zwei A x. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Inkubation die Deckgläser vorsichtig mit einer Pinzette.Wenn die Deckblätter schwer aufzuheben sind, überfluten Sie sie mit PBS und versuchen Sie es erneut. Übertragen Sie jeden Objektträger in eine Vertiefung mit einer Sechs. Well-Platte, die zwei Milliliter 0,2 % BSA 0,1 % Tween 20 in PBS enthält, waschen Sie die Deckgläser in dieser Lösung dreimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln, dann inkubieren Sie die Zellen mit dem entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer dunklen und feuchten Kammer auf Param.Wie vor der Inkubation spülen Sie die Zellen in 0,1 % zwischen 20 in PB S3 mal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, um die Zellen nach der Fixierung zu fixieren, und tauchen Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln in zwei Milliliter 2 %para Formaldehyd in PBS. Sobald die Zellen gefärbt wurden oder wenn sie nicht gefärbt sind, setzen Sie die DNA-Fische fort, indem Sie die Deckgläser dreimal in PBS spülen. Legen Sie dann die Deckfolien mit der Zellseite nach unten auf einen 100-Mikroliter-Tropfen von 0,1 Milligramm pro Milliliter.RNAs auf dem Param in einer befeuchteten Kammer und inkubieren eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation spülen Sie die Deckgläser dreimal in PBS aus und permieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang im Dunkeln in eiskalter 0,7%Trix 100 in 0,1 molare Salzsäure auf Eis. Nach drei Spülgängen in PBS denaturieren Sie die Zellen in 1,9 molar Salzsäure für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln und waschen Sie sie drei weitere Male in eiskaltem PBS daneben, um die Zellen mit den Sonden zu hybridisieren.Legen Sie die Abdeckungsfolien mit der Zellseite nach unten auf einen 15-Mikroliter-Tropfen Sonde, der im vorherigen Abschnitt dieses Videos vorbereitet wurde, auf einen Objektträger, versiegeln Sie den Objektträger mit Gummizement und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer dunklen, befeuchteten Kammer. Entfernen Sie am nächsten Tag mit einer Pinzette vorsichtig den Gummizement von den Objektträgern. Grippieren Sie dann die Deckgläser mit zwei Acts SSC und verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig mit den Zellen zu entfernen.Legen Sie sie dann in Vertiefungen mit Waschlösung. Führen Sie anschließend die folgenden Wäschen mit Schütteln im Dunkeln durch: zwei XSSC für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, zwei XSSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur und ein XSSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die Objektträger zu montieren, legen Sie die Deckgläser mit der Zellenseite nach unten auf einen 10 bis 15 Mikroliter großen Tropfen verlängertes Goldeindeckmedium mit 1,5 Milligramm pro Milliliter DPI-Versiegelung mit Nagellack. Die Dias können monatelang bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.Sobald die Objektträger fertig sind, sammeln Sie 3D-Bilder mit optischen Schnitten, die 0,3 Mikrometer voneinander entfernt sind, und analysieren Sie, wie im Begleitdokument beschrieben, um zu bestimmen, ob Veränderungen in der Assoziation der beiden Allele der Antigenrezeptor-Loci mit der Regulation des Prozesses der VDJ-Rekombination während der Lymphozytenentwicklung verbunden sind, Wildtyp- und mutierte Zellen, die im Rekombinase-Protein fehlen. Fischsonde, die aus einem Rücken erzeugt wurde, der sich über ein etwa 200 Kilobasenpaar erstreckt, das die genomische Region umfasst. Die Abstände zwischen den Allelen wurden zwischen dem Schwerpunkt jedes Rücksignals in 3D-Bildstapeln, gestrichelten Kreisen und Umrissformen des Kerns gemessen. Die gezeigten Skalenbalken sind kumulative Häufigkeitsverteilungskurven von einem Mikrometer, um den gesamten Bereich der Abstände zwischen den beiden Allelen zu zeigen, die in den Wildtyp- und mutierten Zellen gemessen wurden.Der nicht-parametrische KS-Test mit zwei Stichproben wurde dann verwendet, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den beiden Verteilungen zu bewerten. Der Bereich der robustesten Unterschiede in den interallelischen Abständen wurde mit einer Reihe von zwei exakten Schwanzfischertests bewertet, die durch die blauen Punkte gekennzeichnet sind. Die robustesten P-Werte, die durch die höheren Punkte angezeigt werden, wurden für die Entfernungen um ein Mikrometer gefunden.Daher wurde der Cutoff für eine enge Assoziation oder Paarung der beiden Allele bei einem Mikrometer festgelegt. Die hier gezeigten kumulativen Häufigkeitskurven zeigen den Bereich der Entfernungen für eine enge Assoziation der beiden Allele von null bis 1,5 Mikrometer unter den beiden unterschiedlichen biologischen Bedingungen. Die Signifikanz der Paarung der beiden Allele wurde mit dem Two-Tail-Fisher-Exact-Test für einen Cutoff bei einem Mikrometer bewertet.Diese Grafik zeigt, dass in der Mutantenbedingung die beiden Allele nicht mit einer hohen Häufigkeit wie beim Wildtyp assoziiert sind. Somit ist der fehlende Protein-Lappen eins an der Paarung beteiligt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunfluoreszenz und DNA-Fische kombiniert.Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, indem sie Einblicke in die globalen Veränderungen der Kernarchitektur, das Verhalten spezifischer genomischer Loci und Regionen im Kernraum und die Assoziation spezifischer Kernproteine innerhalb dieser Regionen gab. Und es hilft, die Mechanismen zu verstehen, die den verschiedenen Krankheiten nach diesem Verfahren zugrunde liegen. Andere Methoden, wie z. B. genomweite Eisdurchsatztechniken wie Chromatin, Immunpräzipitationen oder Chip-Suche oder Bestätigung des Chromosomeneinfangs, gekoppelt mit tiefer Sequenzierung wie vor fünf C oder IC, können durchgeführt werden, um globale Daten über Zellpopulationen zu liefern.

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Dieser Artikel beschreibt die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf Präimplantations-Diagnostik (PGD) in einer klinischen Umgebung.

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In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

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Das Material beschreibt hier ein Verfahren, das entwickelt wurde, um die dreidimensionale Chromatinstruktur von Hodenkeimzellen zu erhalten. Dies wurde als dreidimensionale (3D) Folienmethode bezeichnet. Diese Methode verbessert die Empfindlichkeit für den Nachweis subnuklearer Strukturen und ist für die  Immunfluoreszenz, DNA und RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (FISH) anwendbar.

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Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

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Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein Werkzeug dar, um mehrere genomische Loci innerhalb von 3D-konservierten Kernen zu visualisieren und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen und Lokalisierungen innerhalb des Kernraums auf einer einzigen Zellebene eindeutig zu definieren. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein breites Spektrum menschlicher Primärzellen beschrieben.

3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Lernen Sie die kombinierte Immunfluoreszenz- und DNA-FISH-Methode zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen und DNA-Sequenzen in 3D-erhaltenen Zellkernen. Dieses Protokoll ermöglicht Zellbiologen und Genetikern die Analyse chromatindynamischer Prozesse.

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

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