Name: Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Lernen Sie die kombinierte Immunfluoreszenz- und DNA-FISH-Methode zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen und DNA-Sequenzen in 3D-erhaltenen Zellkernen. Dieses Protokoll ermöglicht Zellbiologen und Genetikern die Analyse chromatindynamischer Prozesse.

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Wir möchten die Mitglieder des Skok Labor, vor allem Susannah Hewitt, für Diskussionen und Kommentare. Diese Arbeit wird durch das National Institute of Health Zuschüsse R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) unterstützt. JAS ist ein Leukemia &amp; Lymphoma Society Gelehrter. JC ist ein Irvington Institute Fellow des Cancer Research Institute. MM wird von der National Science Foundation Grant Integrative Graduate Bildung und Forschung Traineeship (NSF IGERT 0.333.389) unterstützt.

Ein. DNA Probe Labeling mit Fluorophoren: Nick Translation (~ 6 h) <ol><li> Saubere BAC DNA (hergestellt von Maxi-Prep) oder Plasmiden oder PCR-Produkte, die alle in H 2 O resuspendiert, kann für die Etikettierung verwendet werden. Beachten Sie, dass für eine robuste FISH Signal, Sonden sollten mindestens 10 kb überspannen. </li><li> Inkubieren DNA in RNase A während 30 min bei 37 ° C (alle Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt). </li><li> Inkubieren Sie die Nick-Translation Reaktion für 2 h bei 16 ° C (siehe Tabellen 2 und 3). Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung verwendet werden (Beispiel: FISH Tag, Invitrogen) werden. </li><li> Inaktivieren die Reaktion für eine Stunde bei -80 ° C oder über Nacht bei -20 ° C. </li><li> Bestimmen Sondengröße auf einem 2% Agarosegel. Der Abstrich sollte zwischen 100 und 1.000 bp, wobei die Mehrheit bei ca. 300-500 bp (Beachten Sie, dass der Abstrich von Cy5-Sonden nicht sichtbar ist). Wenn die DNA nicht verdaut ist genug, mehr DNA Pol I undDNase I kann in die Reaktion hinzugefügt und inkubiert für zwei weitere Stunden bei 16 ° C. </li><li> Läutern Sonden auf 0,025 mm Filter in zwei Liter-Becher gefüllt mit H 2 0 für zwei Stunden im Dunkeln. </li><li> Fügen Sie blockierende Faktoren zu den Sonden wie folgt: 10 ug Cot-1 DNA, 10 ug Hybloc DNA und 100 ug Lachssperma für 10 pg DNA-Sonden. Shop DNA-Sonden bei -20 ° C. </li></ol> 2. Probe Niederschlag / Denaturierung / Pre-Annealing (3-4 Std.) <ol><li> Zwischen 0,3 ug und 1 pg DNA-Sonde wird pro Deckglas verwendet. Mischung Sonden mit 0,1 Vol. 3 M NaAc (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100% Ethanol für eine Stunde bei -80 ° C inkubieren oder über Nacht bei -20 ° C und Spin-down bei 13.000 rpm bei 4 ° C für 30 min. Man beachte, dass die Menge an DNA-Sonde eingestellt werden kann, je nach Qualität der DNA und der Kernbereich der Hybridisierung werden. Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung kann die Verwendung der reduzierten MengenSonde. Zur Detektion von mehreren DNA FISH-Signale auf einer Folie können die unterschiedlichen Sonden zusammen ausgefällt werden (außer Sonden, die nicht vorher geglüht, sollte ähnlichen Repeat-Sequenzen). Sonden für mehrere Experimente zur gleichen Zeit ausgeführt werden können auch zusammen ausgefällt werden. Pellets sollten leicht nach den Fluorophoren verwendet werden (wenn kleine Mengen von Sonden ausgefällt werden, das Pellet möglicherweise nicht sichtbar) eingefärbt werden. </li><li> Trockene Pellets und resuspendieren Sie in 15 ul Hybridisierungspuffer (siehe Tabelle 4) pro Deckglas unter Schütteln (mit einem Eppendorf Thermomixer) im Dunkeln bei 37-45 ° C (ca. 20 min). </li><li> Denaturieren Sonden für 5 min bei 75-95 ° C. </li><li> Pre-annealen Sonden bei 37 ° C für 30-60 min. Länge Vorglühen kann in Abhängigkeit von der Komplexität und Qualität der Sonden werden. </li><li> Bewerben Sonden an die Deckgläser über Nacht Hybridisierung (siehe Abschnitt 3). </li></ol> 3. 3-Dimensionalen DNA FISH - First Day (~ 3 Stunden) <ol><li> Nicht-adhärente Zellen werden in einem kleinen Volumen von 1x PBS (~ 2x10 5 Zellen in 5-10 ul PBS 1x pro Deckglas) eingeengt und ließ sich auf der Mitte eines Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen. Adhärenten Zellen auf Deckgläsern sollte mindestens 24 Stunden (~ 70% Konfluenz) (Deckgläser kann mit 0,1% Gelatine beschichtet sein) kultiviert werden. Quadratischen 18x18 um 24-24 mm-Deckgläschen werden in 6-well Platten gegeben und während des Protokolls, zwei ml jeder Lösung wird pro Vertiefung verwendet (alternativ runde Deckgläser 1,5 mm können in 12/24-well Platten platziert werden). </li><li> Fix Zellen in 2% Paraformaldehyd / 1x PBS, pH 7-7,4, 10 min bei RT (4% PFA Bestände aliquotiert, gelagert bei -20 ° C). Paraformaldehyd in Lösung erworben werden (16%) bzw. 4% Stammlösungen aus Pulver / Granulat zubereitet werden. Paraformaldehyd Pulver wird in 1x PBS bei&gt; 60 ° C (pH kann auf 8-9 erhöht werden, um die Auflösung zu erleichtern), abgekühlten auf Eis, passen gelösted zu pH 7-7,4, filtriert, in falcons aliquotiert und über Wochen bei -20 ° C. </li><li> Nach drei Spülungen in 1x PBS, permeabilisieren Zellen in vereisten kalte 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS für 5 min auf Eis. Länge der Permeabilisierung kann angepasst je nach Zelltyp werden. Hinweis: Wenn DNA FISH mit Immunfluoreszenz kombiniert wird, die Immunfärbung sollten in dieser Phase durchgeführt werden (siehe Abschnitt 4). </li><li> Nach drei Spülungen in 1x PBS, inkubieren Zellen mit 0,1 ug / ul RNase A in 1x PBS für eine Stunde bei 37 ° C. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 100 ul Lösung auf Parafilm oder einer Folie in einer feuchten Kammer. Deckgläser werden dann vorsichtig mit einer Pinzette entfernt. Wenn ein Widerstand auftritt, sollte Deckgläser mit 1x PBS geflutet werden, um eine Beschädigung der Zellen. </li><li> Nach drei Spülungen in 1x PBS, permeabilisieren Zellen in vereisten kalte 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl für 10 min auf Eis. </li><li> Nach drei Spülungen in 1x PBS, denaturieren Zellen in 1,9 M HCl für 30 min bei RT. Alternativ können Zellen, die in 50% Formamid / 2 × SSC bei 75-80 ° C für mindestens 30 min denaturiert. Beachte, dass Hybridisierung Länge (und Temperatur) können optimiert, je nach Zelltyp werden. </li><li> Nach drei Spülungen in eiskaltem 1x PBS, hybridisieren Zellen mit Sonden über Nacht bei 37 ° C in einem dunklen und feuchten Kammer. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf ein Minus von 15 ul der Sonde auf einem Schlitten, und versiegelt mit Gummi-Zement. </li></ol> 4. 3-dimensional Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 Std.) <ol><li> Für kombinierte Immunfluoreszenz / DNA FISH sollte Immunfärbung nach Permeabilisierung in 0,4% Triton-X-100 (Schritt 3.3) durchgeführt werden. </li><li> Inkubieren Zellen in Blocking-Lösung für 30 min bei RT (2,5% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normales Ziegenserum, 0,1% Tween-20). Die Blockierungslösung wird filtriert, in 1,5 ml aliquotiert Eppendorfs und gespeichert monate bei -20 ° C. </li><li> Inkubieren von Zellen mit dem primären Antikörper gegen das Protein oder das Histonmodifikation von Interesse in Blockierungslösung verdünnt angehoben, für eine Stunde bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Hier zeigen wir am Beispiel eines Antikörpers gegen phosphoryliertes Serin-139 der H2AX (γ-H2AX, Millipore; siehe Tabelle 5 für Details). Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 100 ul Lösung auf Parafilm oder einer Folie in einer feuchten Kammer. Deckgläser Dann gibt man vorsichtig mit einer Pinzette (geflutet mit 1x PBS falls erforderlich) entfernt. Hinweis, dass eine Verdünnung und Inkubation Länge eingestellt werden kann, je nach Qualität des Antikörpers und Zell-Typen verwendet werden. </li><li> Waschen der Zellen in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, dreimal 5 min bei RT mit Schütteln. </li><li> Inkubieren von Zellen mit dem entsprechenden Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in Blocking-Lösung für eine Stunde bei RT in einer dunklen und feuchten Kammer verdünnt. Hier zeigen wir ein Beispiel für einen Nachweis mitsekundären Ziege-Anti-Maus-Antikörper (Alexa Fluor 488 oder 555, Invitrogen; siehe Tabelle 5 für Details). Hapten-konjugierten Sekundärantikörper (Biotin, Digoxigenin, etc) könnten ebenfalls verwendet werden. In diesem Fall kann ein zusätzlicher Schritt für geeignete Nachweismethoden (Streptavidin, anti-dig, etc) entweder vor oder nach der Über-Nacht-DNA-FISH-Hybridisierung durchgeführt werden. </li><li> Spülen Zellen in 0,1% Tween-20 / 1x PBS, dreimal 5 min bei RT mit Schütteln im Dunkeln. </li><li> Post-Update-Zellen in 2% Paraformaldehyd / 1x PBS für 10 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Weiter DNA FISH wie oben beschrieben aus der Inkubation in RNase A (Schritt 3,4). </li></ol> 5. 3-dimensional DNA FISH / Immuno-FISH - Zweiter Tag (~ 2 h) <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig Gummilösung, Überschwemmung Deckgläser mit 2x SSC, vorsichtig mit einer Pinzette zu entfernen und sie in Vertiefungen mit Waschlösung. </li><li> Waschen der Zellen in 2 × SSC für 30 Minuten bei 37 ° C im Dunkeln unter Schütteln.</li><li> Waschen der Zellen in 2 × SSC für 30 Minuten bei RT im Dunkeln unter Schütteln. </li><li> Waschen der Zellen in 1x SSC 30 min lang bei RT im Dunkeln unter Schütteln beachte, dass im Falle der Denaturierung mit Formamid, Waschungen durch die folgende ersetzt werden:. 3 Waschschritten in 50% Formamid / 2 × SSC und 3 Waschungen in 2 × SSC, 5 min jeweils bei 37 ° C. </li><li> Montieren Zellen in ProLong Gold Montagetyp Medium mit 1,5 g / ml DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole) für Gegenfärbung der Gesamt-DNA. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 10-15 ul Eindeckmedium auf einer Folie und versiegelt mit Nagellack. Slides sind für Monate bei -20 ° C gehalten </li></ol> 6. 3D-Mikroskopie und Analyse <ol><li> 3D-Bilder können mit verschiedenen Mikroskop-Systeme erworben werden. In unseren Experimenten werden optische Schnitte von 0,3 um getrennt auf einem Leica SP5 AOBS konfokalen System (Akusto-Optical Beam Splitter) gesammelt. Beachten Sie, dass die Trennung zwischen optical Ebenen kann in Abhängigkeit von der Art der Analyse ist. </li><li> 3D-Bild Stapel analysiert mit unterschiedlichen Software und Tools werden. Wir verwenden das Image J Software Abstandsmessungen zwischen Loci von Interesse zu beurteilen und verschiedene Arten der Assoziation der Loci von Interesse mit sub-atomaren Fächer oder Proteine ​​zu analysieren. </li><li> Alle statistischen Analysen durchgeführt, um zwei Vergleichen (oder mehr) unterschiedlichen biologischen Bedingungen mit paarweise Beurteilung (en) von Bedeutung: Vergleich zwischen verschiedenen Zelltypen oder Stufen, Vergleich zwischen verschiedenen Loci von Interesse. In allen statistischen Tests, P-Werte ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) werden als signifikant (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * signifikant; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * sehr bedeutsam; P &lt;1,00 E-3 *** hoch signifikant). </li></ol> Die statistische Analyse der gesamten Verteilungen der Abstände zwischen zwei Allelen. Zunächst construct Verteilungsfunktion Frequenz-Kurven über den gesamten Bereich der gemessenen Abstände zwischen den beiden alleles.To Beurteilung der Signifikanz der Unterschiede in der Verteilung der empirischen inter-Allel Distanzen nutzen wir die nichtparametrische zwei Stichproben Kolmogorov-Smirnov (KS-Test) 13,14. Statistische Analyse der engen Verbindung (dh Paarung) zweier Allele mit einem optimalen Abstand abgeschnitten. Um den Bereich der robustesten Unterschieden in der Entfernung zwischen zwei Allele oder Loci zu identifizieren, verwenden wir eine Reihe von zweiseitigen Fisher Exact Test 15 s. Nämlich an jedem gemessenen Abstand testen wir, ob eine Bedingung signifikant ist bei kürzeren Entfernungen zwischen den zwei Proben überrepräsentiert. Die minimale in der Verteilung der P-Werte gibt den Bereich von Abständen, der als Grenzwert für enge Verbindung (dh Paarung) der beiden Allele berücksichtigt werden sollten. Anschließend wird die zweiseitigen Fisher Exact Test wird t verwendeto Beurteilung der Bedeutung der Paarung zweier Allele bei der identifizierten cut-off-Wert 15. Mehrere Tests Korrekturen zur Berücksichtigung der Gesamtzahl der Fisher-Tests angewendet durchgeführt 16. Statistische Analyse der Assoziation der Ort des Interesses mit sub-atomaren Fächer oder Proteine. Die zweiseitigen Fisher-Exact-Test wird verwendet, um die Bedeutung der Vereinigung der Locus von Interesse mit verschiedenen Fächern oder Proteine ​​15 zu analysieren.

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<li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMX%3A+a+new+platform+for+multimodal%2C+multichannel+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li>
<li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research+%3A+an+international+journal+on+the+molecular%2C+supramolecular+and+evolutionary+aspects+of+chromosome+biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Techniken detailliert wurden oben in unserem Labor verwendet werden, um die Regulation der V (D) J-Rekombination der Immunglobulin und TCRA / d loci in Entwicklungsländern Lymphozyten 30,31 analysieren. Wir sind sicher, dass diese Technik für die Detektion verschiedener Kernproteinen, nukleare Abteile und Loci, in verschiedenen Zelltypen angepasst werden kann. Modifikationen des Protokolls notwendig sein kann, und in diesem Fall die Hauptschritte zu konzentrieren sind die folgenden. Erst...

Epigenetische Mechanismen auslösen Aufbau und Vererbung von Entwicklungs-und Zelltyp-spezifische Transkriptions-Profilen. Auf einer Ebene Dies beinhaltet Modulation der Chromatinstruktur Verpackungen, die aktive oder stille genomischen Regionen definiert. In einem größeren Maßstab, globale 3D Organisation des Genoms und Zellkernarchitektur spielen ebenfalls eine Rolle bei der Kontrolle der Transkriptions-Mustern. So ist Dissektion dieser epigenomischen wesentliche Merkmale für ein volles Verständnis, wie Gene 6-11 geregelt. Kombiniert Immunfluoreszenz-und 3D-DNA FISH bieten eine einzigartige Möglichkeit, molekulare und biochemische Analysen Beurteilung spezifischer Interaktionen / Verbände von DNA-Sequenzen und / oder Proteinen im Zellkern zu ergänzen. Hinzu kommt, dass genomweite Hochdurchsatztechniken wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-seq) oder Chromosom capture Konformation mit deep sequencing gekoppelt (4C-seq, 5C, Hallo-C) liefern globale data auf Zellpopulationen 12 ermöglichen Immunfluoreszenz / DNA FISH-Techniken Analysen der einzelnen Zelle Ebene. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-FISH) gefolgt. Der Vorteil dieses Protokolls ist die kombinierte Visualisierung von DNA und Konservierung von Proteinstrukturen. Unsere Erfahrung in diesem Bereich hat es uns ermöglicht, zu verbessern und zu vereinfachen bestehende Protokolle. Obwohl wir dieses Protokoll verwendet wurden, um DNA-Doppelstrang-Pausen in Lymphozyten unterziehen Rekombination detektieren kann dieses Verfahren an andere Proteine ​​und andere Zelltypen verwendet werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> Fischer </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Sigma </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Sigma </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397-C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 oder Cy5 dUTP </td><td> Fischer </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Roche </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA Pol I </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0,025 um Filter </td><td> Millipore </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1-DNA 1 mg / ml </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 mg / ml </td><td> Angewandte Genetik </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> Lachssperma </td><td> Sigma </td><td> # D1626 </td><td> Pulver bei 10 mg / ml in H 2 O resuspendiert werden </td></tr><tr><td> NaAc (Natriumacetat, pH 5,2, Puffer-Lösung) </td><td> Sigma </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (Mol Biol grade) </td><td> Fischer </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidon (Mol Biol grade) </td><td> Fischer </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> Dextransulfat Pulver </td><td> Sigma </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x-Lösung </td&gt; <td> Fischer </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Fischer </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Fischer </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> Slides </td><td> Fischer </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> 6-Well-Platten </td><td> Fischer </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> Fischer </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-Lysin-Lösung </td><td> Sigma </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd, Prills, 95% </td><td> Sigma </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X-100, Mol Biol Grade </td><td> Sigma </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (Bovine Serum Albumin) Fraktion V </td><td> Fischer </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Vector Labs </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, Mol Biol Grade </td><td> Sigma </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (Saline Sodium Citrate) 20x-Lösung </td><td> Fischer </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> ProLong Gold-antifade Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-Phenylindol) </td><td> Sigma </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Bester Test eine Schicht Gummi-Zement </td><td> Kunst oder Büromärkten </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Spezifische Reagenzien und Kleingeräten. </td></tr></tbody></table>

kombiniert immunfluoreszenz und dna fish auf 3d erhaltene interphase nuclei, um Änderungen in 3d nuclear organization study

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung mit DNA-Sonden auf 3-dimensional erhalten Kerne durch 3D-konfokale Mikroskopie verfolgt (3D DNA FISH) stellt die direkteste Weg, um die Lage der Gen-Loci, chromosomalen Subregionen oder ganze Gebiete in einzelnen Zellen zu visualisieren. Diese Art der Analyse gibt einen Einblick in die globale Architektur des Zellkerns als auch das Verhalten der spezifischen genomischen Loci und Regionen innerhalb der nuklearen Raum. Immunfluoreszenz, auf der anderen Seite erlaubt die Detektion von nuklearen Proteinen (modifizierte Histone, Histon-Varianten und Modifikatoren, Transkription Maschinen und Faktoren, Atom-U-Fächer, etc). Die große Herausforderung in der Kombination Immunfluoreszenz und 3D DNA FISH ist, einerseits um das Epitop von dem Antikörper sowie die 3D-Architektur des Kerns detektiert erhalten und andererseits, damit das Eindringen der DNA-Sonde zu detektieren Genloci oder Chromosom Gebieten 1-5. Hier bieten wir ein Protokoll, das die Visualisierung von Chromatin Modifikationen mit genomischen Loci in 3D erhalten Kernen kombiniert.

DNA und Immuno-FISH sind im Laborbetrieb Skok um die Änderungen in Atom-Organisation mit dem Verfahren der V (D) J-Rekombination von Antigenrezeptors Loci während der B-und T-Lymphozyten-Entwicklung verbunden studieren. Die Techniken zuvor dargelegten uns ermöglichen, i) Messung Abstände zwischen den beiden Enden eines Locus (Kontraktion) ii) messen Abstände zwischen Allelen oder Loci (Paarung), iii) eine Analyse der DNA-Schädigung, die innerhalb Loci, iv) Bewertung der Standort der Allele und loci Bezug auf Atom-U-Fäch...

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-DNA FISH) gefolgt.

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Chromatinmodifikationen und DNA-Sequenzen gleichzeitig mit Hilfe der konfokalen 3D-Mikroskopie zu detektieren, wobei zunächst spezifische DNA-Sonden erzeugt werden. Währenddessen werden die experimentellen Zellen mit fester Dauerwelle und immungefärbt. Für die Histon-Marker von Interesse.Die Zellen werden dann denaturiert und über Nacht fluoresziert in Ihnen. Die Hybridisierung oder Fisch wird mit einer oder mehreren DNA-Sonden durchgeführt. Abschließend werden die Küvetten gewaschen und für die 3D-Fluoreszenz eingelagert.Die mikroskopische Analyse der resultierenden Bilder zeigt die nukleare Lokalisierung von interessierenden Loci und die Assoziation mit spezifischen Steinmodifikationen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung von Kernproteinen, einschließlich Steinen, mit genomischen Loci in 3D-Konservierungskernen kombiniert und zur Beantwortung wichtiger Fragen auf dem Gebiet der epigenetischen Organisation des Chromatins oder der Genregulation beitragen kann. Für dieses Verfahren können entweder Rückseitenplasmide oder PCR-Produkte zur Markierung verwendet werden.Diese sollten wie im Begleittex

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Dieser Artikel beschreibt die Auswahl von geeigneten Sonden für Single-Cell-FISH, Verbreitung Techniken für Blastomere Kerne und in-situ-Hybridisierung und Signal-Scoring, angewandt auf Präimplantations-Diagnostik (PGD) in einer klinischen Umgebung.

FISH für Präimplantations-Diagnostik

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

Immunfluoreszenz-basierte Visualisierung von DNA-Reparaturprotein-Interaktionen

Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Die in diesem Artikel beschriebene indirekte Immunofluoreszenz-Protokoll ermöglicht den Nachweis und die Lokalisierung von Proteinen in der Milchdrüse der Maus. Eine vollständige Verfahren wird gegeben, um Brustdrüsenproben herzustellen, um die Immunhistochemie die Gewebeschnitte durch Fluoreszenzmikroskopie durchführen, um Bild und um Bilder zu rekonstruieren.

Die indirekte Immunfluoreszenz auf Gefrierschnitte von Mäusemilchdrüse

Zilien Entwicklung ist wichtig, richtige Organogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zum Beschriften und ciliated Zellen der Zebrafisch zu visualisieren.

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll demonstriert sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an Kryosektionen von Zebrafischembryonen im Frühstadium, die präzise Kolokalisierungsanalysen in bestimmten Zellpopulationen ermöglichen.

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

3D-Mehrfarben-DNA-FISH stellt ein Werkzeug dar, um mehrere genomische Loci innerhalb von 3D-konservierten Kernen zu visualisieren und ihre wechselseitigen Wechselwirkungen und Lokalisierungen innerhalb des Kernraums auf einer einzigen Zellebene eindeutig zu definieren. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für ein breites Spektrum menschlicher Primärzellen beschrieben.

3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Lernen Sie die kombinierte Immunfluoreszenz- und DNA-FISH-Methode zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen und DNA-Sequenzen in 3D-erhaltenen Zellkernen. Dieses Protokoll ermöglicht Zellbiologen und Genetikern die Analyse chromatindynamischer Prozesse.

Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

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