Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Chromatinmodifikationen und DNA-Sequenzen gleichzeitig mit Hilfe der konfokalen 3D-Mikroskopie zu detektieren, wobei zunächst spezifische DNA-Sonden erzeugt werden. Währenddessen werden die experimentellen Zellen mit fester Dauerwelle und immungefärbt. Für die Histon-Marker von Interesse.

Die Zellen werden dann denaturiert und über Nacht fluoresziert in Ihnen. Die Hybridisierung oder Fisch wird mit einer oder mehreren DNA-Sonden durchgeführt. Abschließend werden die Küvetten gewaschen und für die 3D-Fluoreszenz eingelagert.

Die mikroskopische Analyse der resultierenden Bilder zeigt die nukleare Lokalisierung von interessierenden Loci und die Assoziation mit spezifischen Steinmodifikationen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Visualisierung von Kernproteinen, einschließlich Steinen, mit genomischen Loci in 3D-Konservierungskernen kombiniert und zur Beantwortung wichtiger Fragen auf dem Gebiet der epigenetischen Organisation des Chromatins oder der Genregulation beitragen kann. Für dieses Verfahren können entweder Rückseitenplasmide oder PCR-Produkte zur Markierung verwendet werden.

Diese sollten wie im Begleittext beschrieben vorbereitet werden. Beachten Sie, dass die Sonden für ein robustes Fischsignal mindestens 10 Kilobasenpaar benötigen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie ein Mikrogramm DNA und 0,17 Mikrogramm RNAs A in einem Mikrozentrifugenröhrchen kombinieren.

30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation die RNAs A auf Eis kurz inaktivieren und die entsprechende Menge Nick-Translation hinzufügen. Mischen, zwei Stunden bei 16 Grad Celsius in einem gekühlten Wasserbad oder einem kühlen Block inkubieren, um die Reaktion zu inaktivieren.

Stellen Sie die Röhrchen eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius oder über Nacht bei minus 20 Grad Celsius auf. Bestimmen Sie als Nächstes die Sondengröße auf einem 2%igen Agros-Gel. Der Abstrich sollte zwischen 101.000 Basenpaaren liegen, wobei die Mehrheit bei etwa 300 bis 500 Basenpaaren liegen sollte.

Beachten Sie, dass der Abstrich von Science-Fiction-Sonden nicht sichtbar ist. Sobald die Größe bestimmt wurde, reinigen Sie die Sonden durch Dialyse auf 0,02. Fünf-Millimeter-Filter in zwei Liter-Bechern, die mit Wasser gefüllt sind.

Pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikrogramm der Sonde in die Mitte jedes schwimmenden Filters und inkubieren Sie sie dann zwei Stunden lang im Dunkeln. Nach der Inkubation befördern Sie die Sonde mit einer Pipette vorsichtig von den Filtern in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie als Nächstes den Prüfpunkten wie folgt Blockierungsfaktoren hinzu.

Ein Mikrogramm CO 1D NA. Ein Mikrogramm High-Block-DNA und 10 Mikrogramm Lachssperma für ein Mikrogramm DNA-Sonde und Mix, lagern Sie die DNA-Sonden bei minus 20 Grad Celsius. Am Tag der Fischprozedur werden die Sonden ausgefällt und für den Einsatz vorbereitet. Beachten Sie, dass die in diesem Abschnitt des Videos beschriebenen Schritte parallel zu den Schritten im folgenden Abschnitt ausgeführt werden sollten.

Um die Sonden auszufällen, folgen Sie ihnen und kombinieren Sie sie mit 0,1 Volumen von drei molaren Natriumacetat bei pH 5,2 und 2,5 Volumen von 100% Ethanol inkubieren Sie eine Stunde lang bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Inkubation drehen Sie die Sonden 30 Minuten lang bei 16.000 G bei vier Grad Celsius herunter. Nach dem Schleudern den Überstand entsorgen und die Pellets im Dunkeln an der Luft trocknen.

Abhängig von der Menge und Farbe der Sonden kann das Pellet sichtbar sein oder auch nicht. Reanimation: Das Pellet in 15 Mikrolitern Hybridisierungspuffer pro Testbedingung suspendieren und mit einem einor-Thermomischer im Dunkeln bei 37 bis 45 Grad Celsius etwa 20 Minuten lang schütteln. Zur Denaturierung inkubieren die Sonden diese anschließend fünf Minuten lang bei 75 bis 95 Grad Celsius.

Um die Sonden vorzubereiten, inkubieren Sie sie dann bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten auf dem Thermomischer. Unmittelbar nach der Inkubation werden die Sonden auf Zellen auf Deckgläsern aufgebracht, wie im nächsten Abschnitt des Videos beschrieben. Beachten Sie, dass für die folgenden Schritte die Inkubationszeiten je nach Bedarf für die verwendeten Antikörper und Zellen geändert werden sollten.

Die in diesem Abschnitt des Videos beschriebenen Schritte sollten parallel zu den Schritten im vorherigen Abschnitt ausgeführt werden, wie im Begleittext beschrieben. Legen Sie nicht adhärente Zellen auf die mit Polylysin beschichteten Deckblätter in Vertiefungen mit sechs Vertiefungsplatten und lassen Sie sie fünf Minuten lang anhaften. Geben Sie dann vorsichtig zwei Milliliter 2%-Paraform-Aldehyd in PBS-Inkubation für 10 Minuten bei Raumtemperatur nach der Inkubation.

Spülen Sie jede Mulde einmal mit PB S3 aus, um die Zellen durchlässig zu machen, fügen Sie zwei Milliliter eiskaltes Triton hinzu, 0,4% Triton X 100 in PBS und inkubieren Sie fünf Minuten auf Eis. Nach dem Aspirieren der durchlässigen Lösung, wenn DNA-Fische mit Immunfluoreszenz kombiniert werden, gehen Sie wie folgt vor. Pipettieren Sie zunächst 100 Mikroliter der Blockierungslösung in einer befeuchteten Kammer auf den Parameter.

Legen Sie die Deckschicht mit der Schiebezelle nach unten auf die Blockierlösung und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie als nächstes. Die Abdeckung wird auf 100 Mikroliter des in Blockierungslösung verdünnten Primärantikörpers aufgeschoben.

Dabei erkennt der verwendete Antikörper phosphoryliertes syrisches 1 39 von H zwei A x oder gamma H zwei A x. Inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der Inkubation die Deckgläser vorsichtig mit einer Pinzette.

Wenn die Deckblätter schwer aufzuheben sind, überfluten Sie sie mit PBS und versuchen Sie es erneut. Übertragen Sie jeden Objektträger in eine Vertiefung mit einer Sechs. Well-Platte, die zwei Milliliter 0,2 % BSA 0,1 % Tween 20 in PBS enthält, waschen Sie die Deckgläser in dieser Lösung dreimal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur unter Schütteln, dann inkubieren Sie die Zellen mit dem entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper, verdünnt in Blockierungslösung für eine Stunde bei Raumtemperatur in einer dunklen und feuchten Kammer auf Param.

Wie vor der Inkubation spülen Sie die Zellen in 0,1 % zwischen 20 in PB S3 mal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, um die Zellen nach der Fixierung zu fixieren, und tauchen Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln in zwei Milliliter 2 %para Formaldehyd in PBS. Sobald die Zellen gefärbt wurden oder wenn sie nicht gefärbt sind, setzen Sie die DNA-Fische fort, indem Sie die Deckgläser dreimal in PBS spülen. Legen Sie dann die Deckfolien mit der Zellseite nach unten auf einen 100-Mikroliter-Tropfen von 0,1 Milligramm pro Milliliter.

RNAs auf dem Param in einer befeuchteten Kammer und inkubieren eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation spülen Sie die Deckgläser dreimal in PBS aus und permieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang im Dunkeln in eiskalter 0,7%Trix 100 in 0,1 molare Salzsäure auf Eis. Nach drei Spülgängen in PBS denaturieren Sie die Zellen in 1,9 molar Salzsäure für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln und waschen Sie sie drei weitere Male in eiskaltem PBS daneben, um die Zellen mit den Sonden zu hybridisieren.

Legen Sie die Abdeckungsfolien mit der Zellseite nach unten auf einen 15-Mikroliter-Tropfen Sonde, der im vorherigen Abschnitt dieses Videos vorbereitet wurde, auf einen Objektträger, versiegeln Sie den Objektträger mit Gummizement und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer dunklen, befeuchteten Kammer. Entfernen Sie am nächsten Tag mit einer Pinzette vorsichtig den Gummizement von den Objektträgern. Grippieren Sie dann die Deckgläser mit zwei Acts SSC und verwenden Sie eine Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig mit den Zellen zu entfernen.

Legen Sie sie dann in Vertiefungen mit Waschlösung. Führen Sie anschließend die folgenden Wäschen mit Schütteln im Dunkeln durch: zwei XSSC für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, zwei XSSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur und ein XSSC für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die Objektträger zu montieren, legen Sie die Deckgläser mit der Zellenseite nach unten auf einen 10 bis 15 Mikroliter großen Tropfen verlängertes Goldeindeckmedium mit 1,5 Milligramm pro Milliliter DPI-Versiegelung mit Nagellack. Die Dias können monatelang bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Sobald die Objektträger fertig sind, sammeln Sie 3D-Bilder mit optischen Schnitten, die 0,3 Mikrometer voneinander entfernt sind, und analysieren Sie, wie im Begleitdokument beschrieben, um zu bestimmen, ob Veränderungen in der Assoziation der beiden Allele der Antigenrezeptor-Loci mit der Regulation des Prozesses der VDJ-Rekombination während der Lymphozytenentwicklung verbunden sind, Wildtyp- und mutierte Zellen, die im Rekombinase-Protein fehlen. Fischsonde, die aus einem Rücken erzeugt wurde, der sich über ein etwa 200 Kilobasenpaar erstreckt, das die genomische Region umfasst. Die Abstände zwischen den Allelen wurden zwischen dem Schwerpunkt jedes Rücksignals in 3D-Bildstapeln, gestrichelten Kreisen und Umrissformen des Kerns gemessen. Die gezeigten Skalenbalken sind kumulative Häufigkeitsverteilungskurven von einem Mikrometer, um den gesamten Bereich der Abstände zwischen den beiden Allelen zu zeigen, die in den Wildtyp- und mutierten Zellen gemessen wurden.

Der nicht-parametrische KS-Test mit zwei Stichproben wurde dann verwendet, um die Signifikanz der Unterschiede zwischen den beiden Verteilungen zu bewerten. Der Bereich der robustesten Unterschiede in den interallelischen Abständen wurde mit einer Reihe von zwei exakten Schwanzfischertests bewertet, die durch die blauen Punkte gekennzeichnet sind. Die robustesten P-Werte, die durch die höheren Punkte angezeigt werden, wurden für die Entfernungen um ein Mikrometer gefunden.

Daher wurde der Cutoff für eine enge Assoziation oder Paarung der beiden Allele bei einem Mikrometer festgelegt. Die hier gezeigten kumulativen Häufigkeitskurven zeigen den Bereich der Entfernungen für eine enge Assoziation der beiden Allele von null bis 1,5 Mikrometer unter den beiden unterschiedlichen biologischen Bedingungen. Die Signifikanz der Paarung der beiden Allele wurde mit dem Two-Tail-Fisher-Exact-Test für einen Cutoff bei einem Mikrometer bewertet.

Diese Grafik zeigt, dass in der Mutantenbedingung die beiden Allele nicht mit einer hohen Häufigkeit wie beim Wildtyp assoziiert sind. Somit ist der fehlende Protein-Lappen eins an der Paarung beteiligt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Immunfluoreszenz und DNA-Fische kombiniert.

Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, indem sie Einblicke in die globalen Veränderungen der Kernarchitektur, das Verhalten spezifischer genomischer Loci und Regionen im Kernraum und die Assoziation spezifischer Kernproteine innerhalb dieser Regionen gab. Und es hilft, die Mechanismen zu verstehen, die den verschiedenen Krankheiten nach diesem Verfahren zugrunde liegen. Andere Methoden, wie z. B. genomweite Eisdurchsatztechniken wie Chromatin, Immunpräzipitationen oder Chip-Suche oder Bestätigung des Chromosomeneinfangs, gekoppelt mit tiefer Sequenzierung wie vor fünf C oder IC, können durchgeführt werden, um globale Daten über Zellpopulationen zu liefern.