Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkstoffpenetration und das therapeutische Ansprechen auf die Verabreichung eines therapeutischen Medikaments in Echtzeit zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem das Tier zuerst mit dem Medikament behandelt wird. Als nächstes wird die Leistendrüse, die den Tumor enthält, freigelegt, indem ein Hautlappen angelegt wird.

Dann wird die Maus in den mikroskopischen Tisch überführt und die Sauerstoffsättigung und die Pulsfrequenz des Blutes gemessen und eine Verweilleitung für die Verabreichung von Flüssigkeit und Wirkstoff oder Farbstoff eingeführt. Schließlich werden Zeitrafferbilder für spätere Analysen aufgenommen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen des Zelltods oder der Tumorstroma-Wechselwirkungen als Reaktion auf ein Medikament durch konfokale Live-Spinning-Disc-Mikroskopie von Maus-Mammatumoren zeigen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Tumormikroumgebung zu beantworten, z. B. wie verschiedene Stromakomponenten eines Tumors das Ansprechen auf die Therapie beeinflussen. Bevor Sie beginnen, lesen Sie das schriftliche Protokoll für typische Zeitpläne für die Verabreichung von Arzneimitteln und die Bildgebung. Schalten Sie einen Heißperlensterilisator ein und lassen Sie ihn mindestens 200 Grad Celsius erreichen.

Nachdem Sie die chirurgischen Instrumente, einschließlich einer Pinzette mit Zähnen, einer gezackten Pinzette und zwei Scheren, in Wasser und Seife gewaschen haben, sterilisieren Sie sie mindestens 30 Sekunden lang mit dem Heißperlensterilisator. Dann lassen Sie sie. Kühl. Legen Sie ein Laborgetränk auf den Styropordeckel, der als chirurgische Plattform verwendet wird.

Befestigen Sie mit Laborklebeband einen Nasenkonus mit einer Linie am Anästhesiesystem am Laborsauger und führen Sie eine bestimmte Nadel von 18 Gauge x eineinhalb Zoll durch das Klebeband in den Styropordeckel auf beiden Seiten des Nasenkonus, um den Nasenkonus an Ort und Stelle zu halten. Beadin sterile Gaze beiseite stellen. Zwei 70%ige Isopropanol-Wischtücher, ein Objektträger, Sekundenkleber und vier Stücke Laborklebeband mit einer Breite von einem halben Zoll.

Nach der Betäubung des Tieres in einer Induktionskammer, wenn es tief atmet und die Maus langsam mit der Bauchseite nach oben auf die Operationsplattform bringt. Um hohen Druck zu vermeiden, öffnen Sie die Anästhesieleitung zur Operationsplattform und schließen Sie dann die Anästhesieleitung zur Induktionskammer. Reduzieren Sie die Konzentration von Isofluran von 4 % auf 2,5 %. Stellen Sie sicher, dass die Anästhesietiefe für die Operation ausreicht, indem Sie eine Kneifung des Fußpolsters durchführen.

Wenn das Tier nicht reagiert, verwenden Sie vier Stücke Laborband, um seine Gliedmaßen an der Operationsplattform zu befestigen, und verwenden Sie einen Elektrorasierer, um die Haare von der Bauchoberfläche zu entfernen. Verwenden Sie 70%ige Isopropanol-Tücher, gefolgt von Betadin, das auf sterile Gaze aufgetragen wird, um die Bauchoberfläche des Tieres mit einer Schere und Pinzette mit Zähnen zu desinfizieren. Machen Sie einen subkutanen ventralen Mittellinienschnitt von etwa drei Millimetern über der Harnröhre bis zum Xiphoid-Prozess.

Achten Sie darauf, dass Sie das Bauchfell nicht mit der Schere und der gezackten Pinzette durchstechen oder durchschneiden. Die Haut wurde vorsichtig von der Bauchhöhle gelöst, wobei die Leistendrüse, die den abzubildenden Tumor enthält, noch befestigt ist. Positionieren Sie einen Glasobjektträger gegen den Hautlappen, so dass der Großteil des Tumors flach sitzt, sobald die Maus auf den Tisch gestellt wird, und dass er nicht durch die Hintergliedmaßen behindert wird.

Sobald der Objektträger richtig positioniert ist, verwenden Sie Sekundenkleber, um den Objektträger an der Außenfläche der Haut zu befestigen. Entfernen Sie das Laborband, mit dem die Gliedmaßen des Tieres gesichert sind. Öffnen Sie die Anästhesieleitung zum Mikroskoptisch und schließen Sie dann die Anästhesieleitung zur Operationsplattform.

Bringen Sie das Tier schnell auf den Mikroskoptisch Sobald das Tier übertragen wurde, positionieren und sichern Sie den Anästhesieschlauch und den Nasenkonus, um sicherzustellen, dass die Maus betäubt bleibt und sich in einer bequemen Position befindet. Reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 1,5 %Legen Sie den Tumor so frei, dass er auf und in der Mitte eines der glasbedeckten Bildgebungsöffnungen auf dem Mikroskoptisch positioniert ist. Führen Sie den intraperitonealen Verweilzugang mit dem geflügelten Infusionsset ein, das an der Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, die sterile PBS-Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung mit Propidiumiodid enthält.

Wenn der intraperitoneale Zugang eingeführt ist, injizieren Sie dem Tier 100 Mikroliter Kochsalzlösung mit Propidiumiodid und injizieren Sie weiterhin stündlich 50 Mikroliter Kochsalzlösung mit Propidiumiodid, bis die Bildgebung abgeschlossen ist. Überprüfen Sie mit den Okularen, ob der Tumor richtig positioniert und vorsichtig auf dem Objektträger und der intraperitonealen Linie abgeklebt ist. Der Objektträger sollte locker genug befestigt werden, damit der Blutfluss zum Gewebe nicht behindert wird.

Das Abkleben des Objektträgers trägt dazu bei, Bildartefakte zu minimieren, die durch die Atmung des Tieres verursacht werden, um Zeitrafferbilder aufzunehmen. Verwenden Sie die Open-Source-Software micromanager, kompilieren und analysieren Sie die Rohdaten mit IRIS oder einer anderen Bildanalysesoftware. Fluoreszierend konjugierte DExT-Stränge können als Surrogatmarker für die Verabreichung von Medikamenten in Gewebe verwendet werden.

Hier ist die Ankunft von fitzy-konjugierten zwei Megadalton-Dextran IV zu sehen, die in eine Maus injiziert wurden, die blau fluoreszierendes Protein in Brustkrebszellen exprimiert. Nach der Ankunft des Medikaments im Tumor können Extravasation und Diffusion abgebildet werden, um die intravaskuläre Halbwertszeit und die Wirkstoffverteilung zu bestimmen. Hier wird die Extravasation und Verteilung von LOR-konjugiertem 10-Kilodalton-Dextran IV, das in eine Maus injiziert wurde, die blaues fluoreszierendes Protein in Brustkrebszellen und grün fluoreszierendes Protein in myeloischen Zellen exprimierte, gezeigt.

Die Bildgebung kann Aufschluss darüber geben, welche Art des Zelltods Krebszellen durchlaufen. Hier werden strukturelle Kernveränderungen, die auf Nekrose oder Apoptose hinweisen, bei einer Maus beobachtet, die grün fluoreszierendes Protein exprimiert, das an hisone two b konjugiert ist. Nach der Behandlung mit Doxorubicin führt der Chemotherapie-induzierte Zelltod bei Krebs häufig zu einer reaktiven Rekrutierung von Immunzellen in Tumoren.

Hier ist ein Beispiel für diese stromale Reaktion auf eine akute Behandlung mit Doxorubicin bei einer Maus, die blau und grün fluoreszierende Proteine in Brustkrebs- bzw. myeloischen Zellen exprimiert. Neben der Visualisierung der gesamten stromalen Reaktion auf die Chemotherapie können hier auch spezialisierte Stromareaktionen visualisiert werden. Die Phagozytose von nekrotischem Zellmaterial durch eine Nachbarzelle ist dargestellt Einmal gemeistert.

Diese Technik kann in 30 bis 60 Minuten durchgeführt werden, und Tiere können 12 bis 40 Stunden lang abgebildet werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.