Name: Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Erfahren Sie Live-Imaging von Arzneimittelantworten in der Tumor-Mikroumgebung bei Mausmodellen von Brustkrebs. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Tracking von Wirkstoffpenetration und therapeutischer Reaktion auf zellulärer Ebene.

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Wir danken J. Cappellani und J. Qiu für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem National Cancer Institute (U01 CA141451), der Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for the Cure, Long Island 2 Day Walk to Breast Cancer, Manhasset Damen Coalition Against Breast Cancer gegen mich zu kämpfen, und einem unterstützten Pre-Doc-Stipendium der vom Kongress Regie Breast Cancer Research Program, ist USA ESNESN auch der Empfänger der Leslie C. Schnelle und William Randolph Hearst Foundation Fellowships aus dem Watson School of Biological Sciences. HAA wurde durch Mittel aus dem Research Council of Norway (160698/V40 und 151.882) und Southeastern Regional Health Authorities (2.007.060) unterstützt.

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Die Autoren haben keine Konflikte von Interesse, um offen zu legen. Alle tierischen Experimente wurden in Übereinstimmung mit IACUC genehmigten Protokollen durchgeführt.

Die Antworten von Tumoren auf systemische Therapien in vivo kann drastisch unterscheiden, die von Krebszellen in vitro, wie der Mikroumgebung sowohl die akute Reaktion und Rückfall 5 beeinflusst. Eines der größten Hindernisse für die Explikation in vivo Chemoresistenz Wege ist die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung. Insbesondere weil festen Tumoren ein Gleichgewicht zwischen Krebs und Stromazellen, Störungen der einen Komponente, z. B. dem Zelltod, die während Antikrebsbehandlung auftritt entwickelt werden, können in der drastischen Auswirkungen auf Gewebeorganisation führen. Die intravitalen Bildgebungstechnik hier bereitgestellten ermöglicht die direkte Visualisierung Krebszelle-Stroma Wechselwirkungen innerhalb der Tumoren von lebenden, narkotisierten Mäusen während der Behandlung mit Anti-Krebs-Arzneimittel. Wir verwenden Schleuderscheibe konfokale Mikroskopie, die eine relative begrenzte Eindringtiefe hat (siehe 17 </sup&gt;), aber unsere chirurgischen und Markierungstechniken kann mit anderen Arten von Mikroskopie verwendet werden. Filme aus diesen Versuchen erfasst kann verwendet werden, um Prozesse, die Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (zB durch Infiltration eines markierten Population oder Induktion von Zelltod), Zellmotilität, Verteilung von injizierbaren (zB um Extravasation zu verfolgen), und Co-beinhalten verfolgen Lokalisierung von Fluoreszenzsignalen 5,12,17,20. Wir routinemäßig Bild Mäuse für über 6 Stunden und auch durchgeführt Bildgebung für über 18 Stunden. Dies erfordert die Aufrechterhaltung der Mäuse kontinuierlich unter Narkose für diese lange Zeiträume. Mit der richtigen Anästhesie, überleben mehr als 90% unserer Tiere 6 Stunden und etwa 80% mehr als 18 Stunden überleben. Einzelheiten zur langfristigen Betäubung wurden bisher 19 veröffentlicht. In unserer Erfahrung sind fünf Faktoren entscheidend: die Vermeidung Hypothermie vermeiden Dehydrierung, die Aufrechterhaltung physiologischer Sauerstoffsättigung des Blutes Ebenen, usingen befeuchtet Trägergas für Isofluran und Haltung der Tiere auf der untersten Ebene der Anästhesie, an dem sie nicht zeigen Anzeichen von Schmerzen. Auf Körpertemperatur zu halten, sollten wir Mäuse unter einer Heizdecke (bei 38 ° C). Um Austrocknung zu vermeiden, spritzen wir kleine Mengen von Kochsalzlösung ip während der gesamten bildgebenden Verfahren. Um physiologische Blutsauerstoffsättigung Niveau zu halten, beginnen wir mit 21% Sauerstoff im Trägergas (anstelle der üblichen 100%). Dies ermöglicht uns, eingeatmete Sauerstoff Ebenen, wenn eine Maus zu erhöhen - Stunden in einem Experiment - zeigt eine Abnahme in die Sauerstoffsättigung des Blutes. In unserer Erfahrung, die Erhöhung der eingeatmeten Sauerstoff zu diesem Zeitpunkt (z. B. 30-40%) fast immer stabilisieren wird das Tier unter Berücksichtigung Stunden zusätzliche Bildgebung. Die optimale Höhe der Anästhesie ist für die meisten Mäuse mit 1-1,5% Isofluran und Ergebnisse im Atem Raten 60-65/min und Impulsraten von 400-450/min erreicht. In unserer Imaging-Experimente, wir verwenden in erster Linie transgenen Mausmodells (MMTV-PYMT und C3 [1]-Tag), in der Tumore sind multifokalen, so dass zum Abbilden mehrerer Läsionen in verschiedenen Stadien der Tumorprogression, die parallel in mehreren x, y-Positionen während einer einzigen Bildgebungssitzung. Dies verringert Bedenken hinsichtlich Maus zu Maus Variation bezüglich Experimente bei Identifizieren Stufe-abhängige therapeutische Reaktionen abzielen, und reduziert die Anzahl von Tieren zum Abbilden erforderlich. Die MMTV-PYMT Modell (und andere spontane Krebsentstehung Modelle) gehen durch progressive histopathologischen Stadien, die während intravital Bildgebung erkannt werden kann, obwohl die pathologische Staging des Tumors Läsionen, die während intravital Bildgebung durchgeführt werden kann, ist anders und weniger detailliert, als die histologischen Schnitten 5,17. Im Gegensatz dazu tendieren Transplantationsmodellen bis späten Stadium Tumoren am besten widerspiegeln, wie die Krebszellen meist aus fortgeschrittenen Tumoren isoliert werden. Solche Modelle eignen sie sich zum Studium Tumor-StromaWechselwirkungen der späten Stadium Tumoren als Unterschiede in diesen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Stadien. Wir zeigen Beispiele, wie man Bild nuklearen strukturellen Veränderungen, die nach der Zelltod durch Therapie induziert auftreten. In Abwesenheit von Anti-Krebs-Behandlung, das Markierungsstrategie vielmehr zu einer Bild Zellteilung in situ verwendet werden, aufzuklären, zum Beispiel, wie Zellproliferation und Keimruhe durch die Mikroumgebung beeinflusst. In der Zukunft kann Fluoreszenzmarkierung mitochondrialen Komponenten ermöglichen, um Bild mitochondrialen Veränderungen, die während Apoptose auftreten. Bei diesem Protokoll, haben wir auch Beispiele zum Bild Krebszelle-Immunzelle Wechselwirkungen nach der Therapie, aber andere Mikroumgebungsbedingungen Komponenten können auch visualisiert und bebilderten gezeigt. Bestehende transgenen Reporter Linien für stromalen Komponenten umfassen solche für Fibroblasten (zB., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) oder Zellen des Gefäßsystems (zB Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravital Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Interaktionen und Prozesse, die in vivo nach Verabreichung der Chemotherapie auftreten. Mit der Technologie, die derzeit verfügbar sind, haben wir große Fortschritte im Verständnis, wie myeloischen Zellen beeinflussen therapeutische Reaktion gemacht, aber weil der Tumor-Mikroumgebung ist so komplex, große Fortschritte sind erforderlich, um beginnen zu mechanistisch tief in die zugrunde liegenden Prozesse umwelt-vermittelten Resistenz. Einer der wichtigsten Fortschritte noch erforderlich ist die Identifizierung besser Marker für spezifische Zellpopulationen. Die Bedeutung einer besseren Marker ist mit zwei der herausragenden Stromazellen Komponenten des Brusttumor Mikroumgebung, Fibroblasten und Immunzellen veranschaulicht. α-smooth muscle actin (αSMA) wird häufig verwendet, um zu identifizierenFibroblasten, aber das Protein auch von vaskulären glatten Muskelzellen und Myoepithelzellen 24 exprimiert. So, obwohl αSMA-GFP-Reporter Mäusen vorhanden sind, die Bestimmung der spezifischen Zelltyp ist folgende während einer intravital Imaging-Experiment ist eine Herausforderung. Ebenso wird ein einzelner fluoreszierender Marker, wie zB EGFP unter der c-fms-Promotors exprimiert kennzeichnen häufig mehrere Subpopulationen von Immunzellen 12,17. Obwohl also ein idealer möchten eine einzelne Markierung zu verwenden, um einen bestimmten Zelltyp zu identifizieren die Komplexität der zugrunde liegenden Biologie eine große Herausforderung bei der Verwendung dieses Ansatzes. Eine Teillösung für dieses Problem ist die injizierbare Etiketten verwenden, um weiter zu differenzieren Subpopulationen von Zellen, die den gleichen fluoreszierenden Reporter. Beispielsweise werden fluoreszierende Dextrane von Makrophagen aufgenommen und können die Makrophagen Subpopulationen, die durch die c-fms-EGFP und FSP1-EGFP transgenen Reportermäuse markiert sind zu markieren <sup&gt; 17. Antikörper, konjugiert an fluoreszierenden Sonden wurden ebenfalls verwendet, um spezifische Subpopulationen (zB die Gr1-positiven Population von myeloiden Zellen durch die c-fms-EGFP-Reporter 17 beschriftet) identifizieren. Anders als Tumor-Antwort-Kurven durch Dickenmessung, die wenig mechanistische Informationen oder warum Tumore reagieren auf das verabreichte therapeutische oder histologische Reihe von Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten, die große Kohorten Tiere benötigen geerntet wurden bereitzustellen erzeugt, stellt unsere Technik direkte, quantifizierbare Daten auf der Dynamik des Zelltods und auf die Wechselwirkungen von Stromazellen mit Krebszellen in kleinen Kohorten. Damit ist der Vorteil der Verwendung des Verfahrens hier berichtet, dass sie dynamische Informationen Medikament Reaktionen liefert im Kontext eines intakten Tumormikroumgebung in Echtzeit. Solche Informationen können wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Prozesse, die therapeutische Reaktionen fahren 5 führen &lt;/ Sup&gt;.

Krebszellen und den Stromazellen Bestandteile (beide zellulären und nicht-zellulären), die bei der Aufrechterhaltung eines geeigneten Umfelds für das Tumorwachstum 1 Assist: Solide Tumoren bestehen aus zwei großen Fächern zusammen. Diese Stromatumoren Bestandteile spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung, Progression und Metastasierung von vielen Arten von Krebs, einschließlich derjenigen der Brust 2-5. Die Stromazellen Milieu beeinflusst auch therapeutische Reaktionen 2,4,5. Somit bestimmen, wie Krebszellen zu konventionellen und neuartige Therapien ansprechen im Kontext des intakten Mikroumgebung ist, das Verständnis der Krebsbiologie und Verbesserung der derzeitigen therapeutischen Strategien wichtig. Darüber hinaus definiert, wie Krebszellen-Stroma-Interaktionen nach der Verabreichung der Therapie zu ändern, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Biologie des Tumors Rückfall. Organotypischen Kokultur Systeme wurden für die Untersuchung Tumor-Stroma-Interaktionen nützlich <sbis&gt; 6, aber es ist offensichtlich, dass die derzeit verfügbaren Methoden nicht erfolgreich rekapitulieren die intakte Tumormikroumgebung in vitro, insbesondere bezüglich Gefäßfunktion und Rekrutierung von Immunzellen. Tatsächlich sind Krebszelle Reaktionen auf Therapien, die in vitro beobachtet werden oft erheblich von denen in vivo, wo der Mikroumgebung intakt 5 beobachtet. So kann in vivo Modelle für das Studium Tumor-Stroma-Interaktionen und deren Auswirkungen auf therapeutische Reaktion besser widerspiegeln klinisch relevanten Mechanismen sieben. Die primäre Mittel des Studiums Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapie in vivo haben durch Messungen der Tumorgröße und histologische Untersuchung von Gewebe aus behandelten Tieren oder Patienten gewonnen wurden. Allerdings haben Fortschritte in der Mikroskopie und Fluoreszenz-Reporter in den vergangenen zwei Jahrzehnten die Visualisierung der inter-und intrazellulären Prozesse aktiviertmit hoher Auflösung in live, narkotisierten Tieren (intravital imaging) 8. Diese Intravitalmikroskopie Technologien haben sich als besonders wertvoll für räumlich und zeitlich sezieren die in vivo Dynamik der Tumor-Stroma-Interaktionen auf zellulärer und sub-zellulärer Auflösung 8,9. Prozesse, die von intravitalen Imaging wurden entwirrt umfassen Anti-Tumor-T-Zellen-Cytotoxizität 10,11, Interaktionen zwischen T-Zellen und myeloiden Zellen 12, die Dynamik der Veränderungen in Kollagenzusammensetzung und Organisation nach therapeutischer Behandlung 13, Makrophagen-abhängigen Krebszelle Intravasation und Metastasierung 14 und Gefäßpermeabilität 15. Es gibt drei wesentliche Voraussetzungen für intravital Bildgebung. Dazu gehören eine angemessene Vorbereitung und Belichtung von Geweben für die Bildgebung, Fluoreszenzmarkierung der Gewebe-Komponenten von Interesse, und eine gepaarte Mikroskopie-Kamera system Lage des Erwerbs Bilder 16. Die häufigsten verwendeten Strategien, um diese Anforderungen zu erfüllen sind: 1) heterotope Zubereitungen (zB Impfung am Ohr oder Auge orbital), permanent Bildgebung Fenster oder exteriorisierten Zubereitungen (zB dorsalen Hautlappen); 2) Transgene fluoreszierenden Reporter und.. fluoreszierenden Injektabilia zu etikettieren Gewebekomponenten und 3) Multiphotonen oder konfokalen Mikroskopie-Systeme mit Photovervielfacherröhren oder Charge-Coupled Device (CCD)-Kameras bzw. 9 gepaart. Wir verwenden eine chirurgisch präparierten Hautlappen Modell, um die Leistengegend Brustdrüse für die Bildgebung in narkotisierten Tieren, die Transgene kodieren fluoreszierenden Reporter auszudrücken aussetzen. Bilder werden über einen Zeitraum von 12 bis 40 Stunden unter Verwendung einer intensivierten CCD (ICCD)-Kamera mit einem Vier-Laser Schleuderscheibe konfokalen Mikroskopsystem 17 gepaarten erhalten. Imaging in dieser Weise hat uns erlaubt, solche Prozesse in vivo Verteilung von Medikamenten, Bühne-abhängige ch studierenemotherapeutic Reaktionen, der Art der Chemotherapie-induzierten Zelltod und myeloide Zellverhalten 5. Wir stellen ein Protokoll für die intravitalen Bildgebung Krebszelle Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapie und Tumor-Stroma-Interaktionen in Mausmodellen von Brustkrebs. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Einstellungen und den Tod beider Krebszellen und Stromazellen Komponenten mit einer Vielzahl von transgenen und injizierbare Fluoreszenzmarkierungen in beiden transgenen und Transplantationsmodellen für Zeiträume von bis zu 40 Stunden in einem einzigen Bildgebungssitzung verfolgen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> MMTV-PYMT Mäusen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag Mäusen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP Mäusen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP Mäusen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Made in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, Fluorescein-konjugierte </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Rekonstituieren in dH 2 O (4 mg / ml, Lagerung bei -20 ° C); verdünnten bis 1 mg / ml in 1 x PBS </td></tr><tr><td> 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-konjugierten </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Rekonstituieren in dH 2 O (4 mg / ml, Lagerung bei -20 ° C); verdünnten bis 1 mg / ml in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Doxorubicin-Hydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Rekonstituieren in dH 2 O und bei 4 ° C, in 1 x PBS verdünnen </td></tr><tr><td> Isothesia (Isofluran) </td><td> Butler Animal Health Versorgung </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; verdünnter 1:15 in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Stickstoff </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sauerstoff </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;regelmäßigen Kegel Nadel </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Open-Source-Software </td></tr><tr><td> Alkoholtupfer </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% igem Alkohol-Tupfer </td></tr><tr><td> Anästhesie-System </td><td> Molecular Imaging Products, Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> Nr. 1 ½, 24x50 mm; desinfizieren mit 70% Isopropanol Wischtücher </td></tr><tr><td> Curity Gaze Schwämme (steril) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Vorgereinigt, wenn nicht vorgereinigt, mit 70% Isopropanol Tücher desinfizieren </td></tr><tr><td> Gehärtete feinen Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14090-11 </td><td> 2 Paar, Edelstahl, scharf-spitz, gerade Spitze, 26 mm Schneide, 11 cm Länge </td></tr><tr><td> Heizdecke </td><td> Gaymar Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot bead Sterilisator </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18000-45 </td><td> Schalten etwa 30 min vor der Benutzung; sterilisieren Werkzeuge bei&gt; 200 ° C für 30 Sek. </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Elmer-Produkte </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Labor Band (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labor Band (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckela Styropor Versand kühler </td><td></td><td></td><td> Dies wird als das chirurgische Plattform verwendet werden </td></tr><tr><td> Micro Dissektionszange </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 Zähne, leichte Kurve, 0,8 mm Strichstärke, 4 &quot;Länge </td></tr><tr><td> Micro Dissektionszange </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Serrated, leichte Kurve, 0,8 mm Strichstärke; 4 &quot;Länge </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td></td><td></td><td> Spinning-Disk-konfokalen XYZ Piezo Bühne, epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> Mikroskoptisch Einsatz </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td></td><td> Benutzerdefinierte hergestellt, mit zwei runden Imaging-Ports </td></tr><tr><td> MouseOx Oximeter, Software und Sensoren </td><td> STARR Life Sciences </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Super-Versi-Dry Lab Soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Cut in Vierteln zum Auskleiden chirurgische Plattform </td></tr><tr><td> Nebulizer </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Verwendet werden, um Gase zu befeuchten; beugt Irritationen des Lungengewebes </td></tr><tr><td> Slip-Spitze Einweg Tuberkulinspritze (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo geflügelten Infusionsset </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra dünnen Nadel, 12&quot; Schlauch </td></tr><tr><td> Betadine Spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live-imaging of drug responses in der tumor-mikroumgebung in mausmodellen von brustkrebs

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Der Tumor Mikroumgebung spielt eine zentrale Rolle in Tumor Initiation, Progression, Metastase, und dem Ansprechen auf Anti-Krebs-Therapien. Dreidimensionale Co-Kultur-Systeme werden häufig verwendet, um Tumor-Stroma-Interaktionen, einschließlich ihrer Rolle in der Medikamentenentwicklung Reaktionen explizieren. Allerdings können viele der Wechselwirkungen, die in vivo im intakten Mikroumgebung auftreten, nicht vollständig in diesen werden in vitro-Einstellungen repliziert. So, hat direkte Visualisierung der dieser Prozesse in real-time geworden ein wichtiges Werkzeug in das Verständnis Tumor-Reaktionen zu Therapien und die Identifizierung der Interaktionen zwischen Krebs Zellen und dem Stroma, die diese Reaktionen beeinflussen können. Sie hier, stellen wir ein Verfahren für die Verwendung von Kreiselscheibenapplikators konfokale Mikroskopie von lebenden, anästhesiert Mäuse, um direkt beobachten der Verteilung des Arzneimittels, Krebs Zell-Reaktionen und Veränderungen in Tumors-Stroma-Interaktionen nach der Verabreichung von systemischen Therapie bei Brustkrebs Modelle. Wir beschreiben Verfahren für die labeling verschiedenen Tumor Komponenten, Behandlung von Tieren für die Beobachtung therapeutische Reaktionen, und die chirurgische Prozedur zum Belichten von Tumor-Geweben für die Bildgebung up bis 40 Stunden. Die Ergebnisse aus dieser-Protokoll erhalten werden, sind time-lapse-filme,, in denen solche Prozessen als Drug Infiltration, Krebszelle Tod und stromalen Zellmigration evaluiert sie mit Bild-Analyse-Software kann werden.

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung<em&gt; In vivo</em&gt; Und einzelne Zelle Auflösung.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkstoffpenetration und das therapeutische Ansprechen auf die Verabreichung eines therapeutischen Medikaments in Echtzeit zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem das Tier zuerst mit dem Medikament behandelt wird. Als nächstes wird die Leistendrüse, die den Tumor enthält, freigelegt, indem ein Hautlappen angelegt wird.Dann wird die Maus in den mikroskopischen Tisch überführt und die Sauerstoffsättigung und die Pulsfrequenz des Blutes gemessen und eine Verweilleitung für die Verabreichung von Flüssigkeit und Wirkstoff oder Farbstoff eingeführt. Schließlich werden Zeitrafferbilder für spätere Analysen aufgenommen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Veränderungen des Zelltods oder der Tumorstroma-Wechselwirkungen als Reaktion auf ein Medikament durch konfokale Live-Spinning-Disc-Mikroskopie von Maus-Mammatumoren zeigen.Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Tumormikroumgebung zu beantworten, z. B. wie verschiedene Stromakomponenten eines Tumors das Ansprechen auf die Therapie beeinflussen. Bevor Sie beginnen, lesen Sie das schriftliche Protokoll für typische Zeitpläne für die Verabreichung von Arzneimitteln und die Bildgebung. Schalten Sie einen Heißperlensterilisator ein und lassen Sie ihn mindestens 200 Grad Celsius erreichen.Nachdem Sie die chirurgischen Instrumente, einschließlich einer Pinzette mit Zähnen, einer gezackten Pinzette und zwei Scheren, in Wasser und Seife gewaschen haben, sterilisieren Sie sie mindestens 30 Sekunden lang mit dem Heißperlensterilisator. Dann lassen Sie sie. Kühl. Legen Sie ein Laborgetränk auf den Styropordeckel, der als chirurgische Plattform verwendet wird.Befestigen Sie mit Laborklebeband einen Nasenkonus mit einer Linie am Anästhesiesystem am Laborsauger und führen Sie eine bestimmte Nadel von 18 Gauge x eineinhalb Zoll durch das Klebeband in den Styropordeckel auf beiden Seiten des Nasenkonus, um den Nasenkonus an Ort und Stelle zu halten. Beadin sterile Gaze beiseite stellen. Zwei 70%ige Isopropanol-Wischtücher, ein Objektträger, Sekundenkleber und vier Stücke Laborklebeband mit einer Breite von einem halben Zoll.Nach der Betäubung des Tieres in einer Induktionskammer, wenn es tief atmet und die Maus langsam mit der Bauchseite nach oben auf die Operationsplattform bringt. Um hohen Druck zu vermeiden, öffnen Sie die Anästhesieleitung zur Operationsplattform und schließen Sie dann die Anästhesieleitung zur Induktionskammer. Reduzieren Sie die Konzentration von Isofluran von 4 % auf 2,5 %. Stellen Sie sicher, dass die Anästhesietiefe für die Operation ausreicht, indem Sie eine Kneifung des Fußpolsters durchführen.Wenn das Tier nicht reagiert, verwenden Sie vier Stücke Laborband, um seine Gliedmaßen an der Operationsplattform zu befestigen, und verwenden Sie einen Elektrorasierer, um die Haare von der Bauchoberfläche zu entfernen. Verwenden Sie 70%ige Isopropanol-Tücher, gefolgt von Betadin, das auf sterile Gaze aufgetragen wird, um die Bauchoberfläche des Tieres mit einer Schere und Pinzette mit Zähnen zu desinfizieren. Machen Sie einen subkutanen ventralen Mittellinienschnitt von etwa drei Millimetern über der Harnröhre bis zum Xiphoid-Prozess.Achten Sie darauf, dass Sie das Bauchfell nicht mit der Schere und der gezackten Pinzette durchstechen oder durchschneiden. Die Haut wurde vorsichtig von der Bauchhöhle gelöst, wobei die Leistendrüse, die den abzubildenden Tumor enthält, noch befestigt ist. Positionieren Sie einen Glasobjektträger gegen den Hautlappen, so dass der Großteil des Tumors flach sitzt, sobald die Maus auf den Tisch gestellt wird, und dass er nicht durch die Hintergliedmaßen behindert wird.Sobald der Objektträger richtig positioniert ist, verwenden Sie Sekundenkleber, um den Objektträger an der Außenfläche der Haut zu befestigen. Entfernen Sie das Laborband, mit dem die Gliedmaßen des Tieres gesichert sind. Öffnen Sie die Anästhesieleitung zum Mikroskoptisch und schließen Sie dann die Anästhesieleitung zur Operationsplattform.Bringen Sie das Tier schnell auf den Mikroskoptisch Sobald das Tier übertragen wurde, positionieren und sichern Sie den Anästhesieschlauch und den Nasenkonus, um sicherzustellen, dass die Maus betäubt bleibt und sich in einer bequemen Position befindet. Reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 1,5 %Legen Sie den Tumor so frei, dass er auf und in der Mitte eines der glasbedeckten Bildgebungsöffnungen auf dem Mikroskoptisch positioniert ist. Führen Sie den intraperitonealen Verweilzugang mit dem geflügelten Infusionsset ein, das an der Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, die sterile PBS-Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung mit Propidiumiodid enthält.Wenn der intraperitoneale Zugang eingeführt ist, injizieren Sie dem Tier 100 Mikroliter Kochsalzlösung mit Propidiumiodid und injizieren Sie weiterhin stündlich 50 Mikroliter Kochsalzlösung mit Propidiumiodid, bis die Bildgebung abgeschlossen ist. Überprüfen Sie mit den Okularen, ob der Tumor richtig positioniert und vorsichtig auf dem Objektträger und der intraperitonealen Linie abgeklebt ist. Der Objektträger sollte locker genug befestigt werden, damit der Blutfluss zum Gewebe nicht behindert wird.Das Abkleben des Objektträgers trägt dazu bei, Bildartefakte zu minimieren, die durch die Atmung des Tieres verursacht werden, um Zeitrafferbilder aufzunehmen. Verwenden Sie die Open-Source-Software micromanager, kompilieren und analysieren Sie die Rohdaten mit IRIS oder einer anderen Bildanalysesoftware. Fluoreszierend konjugierte DExT-Stränge können als Surrogatmarker für die Verabreichung von Medikamenten in Gewebe verwendet werden.Hier ist die Ankunft von fitzy-konjugierten zwei Megadalton-Dextran IV zu sehen, die in eine Maus injiziert wurden, die blau fluoreszierendes Protein in Brustkrebszellen exprimiert. Nach der Ankunft des Medikaments im Tumor können Extravasation und Diffusion abgebildet werden, um die intravaskuläre Halbwertszeit und die Wirkstoffverteilung zu bestimmen. Hier wird die Extravasation und Verteilung von LOR-konjugiertem 10-Kilodalton-Dextran IV, das in eine Maus injiziert wurde, die blaues fluoreszierendes Protein in Brustkrebszellen und grün fluoreszierendes Protein in myeloischen Zellen exprimierte, gezeigt.Die Bildgebung kann Aufschluss darüber geben, welche Art des Zelltods Krebszellen durchlaufen. Hier werden strukturelle Kernveränderungen, die auf Nekrose oder Apoptose hinweisen, bei einer Maus beobachtet, die grün fluoreszierendes Protein exprimiert, das an hisone two b konjugiert ist. Nach der Behandlung mit Doxorubicin führt der Chemotherapie-induzierte Zelltod bei Krebs häufig zu einer reaktiven Rekrutierung von Immunzellen in Tumoren.Hier ist ein Beispiel für diese stromale Reaktion auf eine akute Behandlung mit Doxorubicin bei einer Maus, die blau und grün fluoreszierende Proteine in Brustkrebs- bzw. myeloischen Zellen exprimiert. Neben der Visualisierung der gesamten stromalen Reaktion auf die Chemotherapie können hier auch spezialisierte Stromareaktionen visualisiert werden. Die Phagozytose von nekrotischem Zellmaterial durch eine Nachbarzelle ist dargestellt Einmal gemeistert.Diese Technik kann in 30 bis 60 Minuten durchgeführt werden, und Tiere können 12 bis 40 Stunden lang abgebildet werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Orthotopen Tiermodellen von Eierstockkrebs zu replizieren besser menschlicher Erkrankungen und damit zu unserem Verständnis der Tumorprogression und Ansprechen des Tumors auf die Therapie. Ein Maus-Modell erhält eine intrabursalen Injektion von Luciferase-exprimierenden Eierstock-Tumorzellen. Die Behandlung erfolgt über eine orale Sonde verabreicht. Das Tumorwachstum wird durch...

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Ein experimentelles Mausmodell von Knochenmetastasen wurde nach intrakardialen Lieferung von Luciferase exprimierenden Mammatumorzellen gegründet. Tumorentstehung und führte Osteolyse wurden in Längsrichtung mit Biolumineszenz-und Mikro-CT-Bildgebung überwacht.

Überwachung Tumormetastasen und Osteolysen mit Biolumineszenz und Micro-CT Imaging

Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

Wir haben 3D-Kokultur-Modelle für Live-Cell-Imaging entwickelt in Echtzeit von Interaktionen zwischen Brust-Tumor-Zellen und andere Zellen in ihrer Mikroumgebung, die Einfluss auf Progression zu einem invasiven Phänotyp. Diese Modelle können als Bildschirme für präklinische Arzneimittel auf parakrine-induzierte proteolytische, Chemokin / Zytokin-und Kinase-Signalwege in Invasivität-Ziels dienen.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

Quelle:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Institut für Biowissenschaften, Universität Brasília, 2Abteilung für grundlegende psychologische Prozesse, Institut für Psychologie, Universität BrasíliaDieses Video zeigt das Verfahren zur Verfolgung der Tumorprogression in vivo,...

Biolumineszierende Bildgebung der Progression von Brusttumoren in einem weiblichen Mausmodell

Eine orthotope Brustkrebs primären Tumormodell und die operative Entfernung des Primärtumors Maus Lebensdauer zu verlängern spontane Metastasierung zu erzeugen, werden beschrieben. Das Tumorwachstum und Progression werden überwacht und durch Luciferase Fluoreszenzbildgebung quantifiziert.

Ein orthotopen Mausmodell des Spontan Metastasierung von Brustkrebs

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

Hier beschreiben wir das Modell und den Ansatz zur Untersuchung der Funktionen von Lungenalveolarmakrophagen bei der Metastasierung von Krebs. Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu demonstrieren, wurde das syngene (4T1) Modell des Brustkrebses in Verbindung mit der Depletion von Alveolarmakrophagen mit Clodronat-Liposomen verwendet.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Hier beschreiben wir eine nichtinvasive Überwachungsmethode, die Luciferase und grün fluoreszierende Proteinexpression in verschiedenen Brustkrebszelllinien beinhaltet. Dieses Protokoll bietet eine Technik zur Überwachung der Tumorbildung und der metastasierenden Besiedlung in Echtzeit bei Mäusen.

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Hier beschreiben wir das Protokoll für die in vivo Verabreichung von magnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln, die RNA-Oligomere tragen, an metastasierenden Brustkrebs in Tiermodellen und bieten damit einen klinisch praktikablen Ansatz für das therapeutische Silencing von onkogenen Nukleinsäuren.

Überwachung der Akkumulation von Nanomedikamenten in Brustkrebsmetastasen bei Mäusen

Erfahren Sie Live-Imaging von Arzneimittelantworten in der Tumor-Mikroumgebung bei Mausmodellen von Brustkrebs. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Tracking von Wirkstoffpenetration und therapeutischer Reaktion auf zellulärer Ebene.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

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