Name: Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Lernen Sie Kryoschnitte von Hefegemeinschaften zur Untersuchung räumlicher Verteilung fluoreszierender Zellpopulationen. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in mikrobielle Interaktionen.

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Wir möchten Jonathan Cooper Lab am Fred Hutchinson Cancer Research Center für die Erlaubnis, ihre Kryostat verwenden danken. Diese Arbeit wurde vom NIH und der WM Keck Foundation unterstützt. BM ist ein Gordon und Betty Moore Fellow Life Science Research Foundation. Wir sind dankbar, dass Daniel Gottschling für die gemeinsame Nutzung seiner Befestigung Protokoll mit uns.

Ein. Befestigung Hefe Gemeinschaften <ol><li> Wachsen Hefe Gemeinden auf einem Membranfilter (zB Millipore MF Membranfilter; 2A). Dieses Protokoll entspricht einer typischen Gemeinschaft von weniger als 2x10 8 Zellen auf einer 6 mm-Durchmesser-Membranfilter. </li><li> Mit einem Stück Whatman 541 Filterpapier, um den Boden eines 1 cm Durchmesser und (2B) abzudecken. Diese Whatman Papier als Träger, um die Gemeinschaft in späteren Stadien übertragen werden. 1 ml 100% Methanol zum Brunnen, und lassen Sie das auch in -20 ° C für die Temperatur ins Gleichgewicht. </li><li> Legen flüssigem N 2 in einem Dewar. Frieren Gemeinde in flüssigem Stickstoff durch Eintauchen der Gemeinde für mindestens 15 sec in flüssigem N 2 mit einer Pinzette (Abbildung 2C). </li><li> Übertragen gefrorenen Gemeinschaft zum Wohl von -20 ° C Methanol (2D). Stellen Sie sicher, dass die Gemeinde gehalten wird horizontal, wenn Eintauchen in Methanol.Warten Sie 20 min. Der MF Membranfilter beginnt in Methanol zerfallen. </li><li> Transfergemeinschaft Verwendung des Trägers Whatman 541 Filterpapier aus dem Methanol auch zu einer kalten Petrischale bei -20 ° C für Methanol Verdampfung (2E) gehalten. Bei der Übertragung, halten die Gemeinschaft auf der Oberseite des Trägers Whatman-Filter und wegziehen zusätzliche Tropfen Methanol mit einem anderen Stück dickes Whatman-Papier, bevor sie in der kalten Petrischale. Dadurch wird sichergestellt, dass die Verdampfung Zeitablauf konsistent von Probe zu Probe. </li><li> Warten 4-6 Stunden für die Verdampfung, bis der Träger Whatman-Filter sieht trocken. Unzureichende Verdunstung hinterlässt restliches Methanol, das mit Schneiden stört. Over-Trocknung Ursachen Risse und Verformungen in den Gemeinden. </li><li> Nehmen Sie die Probe aus -20 ° C Gefrierschrank. Schneiden Sie Whatman 541 Filterpapier nicht unter das Gemeinschaftsrecht fallen. </li><li> Einen rechteckigen kubisches Aluminiumfolie Behälter, der groß genug ist, so dass die Probe wenigstens 2 mm ~ Marge von hat, istjede Seite (2F). Legen Sie die Gemeinde an der unteren Oberfläche der Aluminium-Folie Container; sofort decken die Probe mit Oktober um 3 bis 4 mm oberhalb Community Höhe. Wenn wichtige, kann die Ausrichtung der Probe in diesem Schritt in Bezug auf die Seiten des Behälters einstellbar ist. Warten Sie 10 min. </li><li> Legen Sie die Oktober-embedded Probe auf einer metallischen Platte auf Trockeneis zu frieren. Bewahren Sie die gefrorenen Gemeinden bei -20 ° C oder -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol> 2. Schnitte Gefrorene Gemeinschaften für Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Stellen Sie die Temperatur der Kammer Kryoschnitt bis -25 ° C und lassen die Proben in die Kammer, bis ihre Temperatur erreicht die Temperatur der Kammer. </li><li> Montieren Sie die Probe auf einer Kryo-mount nach dem Auftragen einen Rückgang von Oktober auf dem Berg. Oktober gleichmäßig ausgebreitet auf der Seite der Probe mit freiliegenden Whatman Filterpapier (Boden des Behälters) derart, dass die OCT Dicke 2-3 mm. Lassen Oktober freeze im Kryostatkammer bevor sectioning. Sicherstellung eines OCT-Marge von 2-3 mm an allen Seiten der Probe hilft, die Unversehrtheit der Abschnitte zu bewahren. </li><li> Die Seiten des Oktober Probenblock kann verwendet werden, um die Probe auszurichten. Wenn die Probe nicht mit Bezug auf die Klinge ausgerichtet ist, wird Schneidens von einer Ecke oder Seite der Probe beginnen. Anpassen der Halterung zu gewährleisten, dass die Klinge eine perfekt vertikal (oder horizontalen) Fläche des Probenblocks schneidet. </li><li> Typische Bereiche für Hefe-Gemeinden sind ~ 14 Mikrometer dicke. Nach Schneiden eines Abschnitts, mit einem Mikroskop-Objektträger bei Raumtemperatur gehalten, um den Abschnitt zu sammeln, durch langsames Anfahren der Folie in die Schnittfläche. Der Abschnitt wird schmelzen und Transfer zum Objektträger. Bis zu 18 Teile können auf einen Objektträger übertragen werden. </li><li> Bewahren Sie die Folien bei kalten Temperaturen, vorzugsweise -20 ° C, bevor Bildgebung. Signalverlust ist minimal, wenn für eine Woche bei 4 ° C gehalten wird Für maximale Fluoreszenzsignal wird Bildgebung bevorzugt unmittelbar nach Schneiden getan. </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das hier vorgestellte Verfahren bietet eine Möglichkeit, die innere Struktur des Hefe-Communities zu inspizieren. Das Methanol Fixierschritt macht die Hefekolonie starren 8 und bewahrt die Integrität der Kolonie, aber es verursacht auch Schrumpfung 8, sollte bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Wir in der Regel sehen rund 30% Schrumpfung in Höhe von Hefe-Kolonien im Vergleich zu Kolonien direkt in OCT ohne Befestigungsmaterial 9 eingebettet. <p class="jove_con...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> 100% Methanol </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek OCT Compound </td><td> Andwin Scientific </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grade Nr. 541 Quantitative Filter Paper </td><td> Whatman </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF Membrane Filter </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

kryoschneiden hefe gemeinschaften für die prüfung fluoreszenzmuster

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Mikroben leben typischerweise in den Gemeinden. Die räumliche Organisation von Zellen innerhalb einer Gemeinschaft wird angenommen, dass das Überleben und die Funktion der Reisenden 1 auswirken. Optische Schnitte Techniken, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, haben sich bewährt zur Beobachtung räumlichen Organisation von Bakterien und Archaeen Gemeinden 2,3. Eine Kombination von konfokale Bildgebung und physikalische Schnitte von Hefe-Kolonien hat interne Organisation von Zellen 4 enthüllt. Allerdings hat direkte optische Schnitte mittels konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie war nur in der Lage, ein paar Zellschichten tief in Hefe-Kolonien zu erreichen. Diese Einschränkung ist aufgrund der starken Streuung des Lichts aus Hefezellen 4 wahrscheinlich. Hier präsentieren wir eine Methode zur Festsetzung und Kryoschneiden die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen in Saccharomyces cerevisiae Gemeinden zu basieren. Wir verwenden Methanol als Fixiermittelum die räumliche Verteilung der Zellen zu erhalten. Feste Gemeinden sind mit OCT-Verbindung, gefroren und kryogeschnitten in einem Kryostaten infiltriert. Fluoreszenz-Bildgebung der Abschnitte zeigt die interne Organisation der fluoreszierenden Zellen innerhalb der Gemeinschaft. Beispiele von Hefe Communities bestehend aus Stämmen exprimierenden rot und grün fluoreszierende Proteine ​​zeigen die Potentiale des Kryoschneiden Methode, um die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen sowie die der Genexpression innerhalb Hefekolonien 2,3 offenbaren. Obwohl unsere Fokussierung auf Saccharomyces cerevisiae Gemeinden gewesen ist, kann das gleiche Verfahren angewandt potentiell zu anderen mikrobiellen untersuchen.

Fluoreszenzbilder von vertikalen Querschnitten von Hefe Communities enthaltenden roten und grün-tagged wettbewerbsfähigen Populationen 6 sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Gemeinschaften bestehen aus zwei prototrophen Hefestämme und deren Wettbewerb für gemeinsam genutzte Ressourcen, einschließlich Raum, führt zu säulenartigen Strukturen 7, wie in ihrer vertikalen Querschnitten dargestellt. Auflösungen bis hinunter zu einer einzigen Zelle kann in Querschnitten gelöst werden. <s...

Wir präsentieren ein Protokoll zum Einfrieren und Kryoschneiden Hefe Gemeinden internen Muster der fluoreszierenden Zellen zu beobachten. Die Methode beruht auf Methanol-Fixierung und OCT-Einbettung, um die räumliche Verteilung der Zellen ohne Inaktivierung fluoreszierende Proteine ​​innerhalb einer Gemeinschaft bewahren.

Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Querschnitte von Hefegemeinschaften zu erstellen, um die räumliche Verteilung verschiedener fluoreszierender Zellpopulationen innerhalb einer Gemeinschaft zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Gemeinschaft zuerst eingefroren und dann mit Methanol fixiert wird, um die räumliche Verteilung der Zellen in der Gemeinschaft zu erhalten. Im zweiten Schritt wird das Methanol verdampft, um die Penetration der einbettenden OCT-Verbindung zu ermöglichen.Die Embedded-Community wird dann eingefroren, um sich auf die Kryosektion vorzubereiten. Als nächstes wird ein Kryo-Ome geschnitten. Die Gemeinschaft und die Querschnitte können unter einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden. Es werden Ergebnisse erhalten, die die räumliche Verteilung von fluoreszierenden Zellpopulationen innerhalb einer Gemeinschaft zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der optischen Schnittbestimmung besteht darin, dass sie die räumliche Verteilung der Populationen tief im Inneren dieser Gemeinschaften aufzeigt. Um dieses Verfahren zu starten, züchten Sie Hefegemeinschaften auf einem Membranfilter. Dieses Protokoll entspr

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren für die Durchführung...

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Diese Handschrift beschreibt eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zum Kryofixation Suspensionszellen durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen.

Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Hier präsentieren wir Live-Zell-Bildgebung, eine ungiftige Mikroskopiemethode, die es Forschern ermöglicht, das Proteinverhalten und die Kerndynamik in lebenden Spalthefezellen während Derose und Meiose zu untersuchen.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Wir präsentieren ein Protokoll zur Lamellenpräparation von gefrorenen biologischen Proben mittels kryofokussiertem Ionenstrahl-Mikrobearbeitung für hochauflösende Strukturstudien von Makromolekülen in situ mit Kryo-Elektronentomographie. Das vorgestellte Protokoll enthält Richtlinien für die Herstellung von hochwertigen Lamellen mit hoher Reproduzierbarkeit zur strukturellen Charakterisierung von Makromolekülen innerhalb der Saccharomyces cerevisiae.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.

Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur

Spalthefe wird hier als heterologer Wirt verwendet, um bakterielle Zytoskelettproteine wie FtsZ und MreB als translationale Fusionsproteine mit GFP zu exprimieren, um deren Polymerisation sichtbar zu machen. Auch Verbindungen, die die Polymerisation beeinflussen, werden durch Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop identifiziert.

Spalthefe als Plattform für antibakterielle Wirkstoffscreenings, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Richtlinie für den Aufbau und die quantitative Überwachung von Co-Kulturen, einschließlich photoautotropher zuckersezernierender Cyanobakterien und heterotropher Hefen.

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Lernen Sie Kryoschnitte von Hefegemeinschaften zur Untersuchung räumlicher Verteilung fluoreszierender Zellpopulationen. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in mikrobielle Interaktionen.

Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster

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