Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Querschnitte von Hefegemeinschaften zu erstellen, um die räumliche Verteilung verschiedener fluoreszierender Zellpopulationen innerhalb einer Gemeinschaft zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die Gemeinschaft zuerst eingefroren und dann mit Methanol fixiert wird, um die räumliche Verteilung der Zellen in der Gemeinschaft zu erhalten. Im zweiten Schritt wird das Methanol verdampft, um die Penetration der einbettenden OCT-Verbindung zu ermöglichen.

Die Embedded-Community wird dann eingefroren, um sich auf die Kryosektion vorzubereiten. Als nächstes wird ein Kryo-Ome geschnitten. Die Gemeinschaft und die Querschnitte können unter einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet werden. Es werden Ergebnisse erhalten, die die räumliche Verteilung von fluoreszierenden Zellpopulationen innerhalb einer Gemeinschaft zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der optischen Schnittbestimmung besteht darin, dass sie die räumliche Verteilung der Populationen tief im Inneren dieser Gemeinschaften aufzeigt. Um dieses Verfahren zu starten, züchten Sie Hefegemeinschaften auf einem Membranfilter. Dieses Protokoll entspricht einer typischen Gemeinschaft von weniger als zwei mal 10 auf die acht Zellen auf einem Membranfilter mit sechs Millimetern Durchmesser als nächstes in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius.

Um einen höheren Grad an Fluoreszenz zu erhalten, verwenden Sie ein Stück Watman 5 4 1 Filterpapier, um den Boden mit einem Durchmesser von einem Zentimeter abzudecken. Nun, dieses Filterpapier wird als Träger verwendet, um die Gemeinschaft zu übertragen In späteren Schritten fügen Sie einen Milliliter minus 20 Grad Celsius, 100% Methanol, in die Vertiefung hinzu und lassen Sie die Vertiefung bei minus 20 Grad Celsius, damit sich die Temperatur ausgleichen kann. Frieren Sie nun die Hefegemeinschaft ein, indem Sie den Membranfilter mit einer Pinzette mindestens 15 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff tauchen.

Als nächstes wird die gefrorene Gemeinschaft bei minus 20 Grad Celsius in den Brunnen umgefüllt. Methanol im Gefrierschrank sorgt dafür, dass die Gemeinschaft waagerecht gehalten wird. Wenn Sie es in das Methanol eintauchen, warten Sie 20 Minuten, dann beginnt der Membranfilter im Methanol zu zersetzen.

Nach 20 Minuten wird die Gemeinschaft mit dem Träger Watman-Filterpapier aus der Methanolvertiefung in eine kalte Petrischale mit einer Temperatur von minus 20 Grad Celsius umgefüllt. Halten Sie bei der Übertragung die Community über den Watman-Filter des Netzbetreibers auf dem Laufenden. Ziehen Sie überschüssige Tropfen Methanol mit einem weiteren Stück dickem Watman-Papier ab, bevor Sie es in die kalte Petrischale geben.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Verdampfungszeit des Methanols von Probe zu Probe gleich ist. Warten Sie vier bis sechs Stunden, bis das Methanol verdampft ist. Das Beenden der Verdunstung zum richtigen Zeitpunkt ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens.

Um ein Übertrocknen der Probe zu vermeiden, überprüfen Sie den Zustand der Hefegemeinschaft regelmäßig während der Verdampfung, während das Methanol verdampft. Stelle einen rechteckigen kubischen Behälter aus Aluminiumfolie her, der groß genug ist, dass die Probe von jeder Seite mindestens zwei Millimeter Rand hat. Geben Sie einen Tropfen OCT auf den Boden dieses Behälters, um sicherzustellen, dass die Probe von allen Seiten von OCT umgeben ist.

Wenn die Verdunstung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Probe aus dem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Schneiden Sie die Teile des Filterpapiers ab, die nicht von der Hefegemeinschaft bedeckt sind. Es ist wichtig, diesen Schritt schnell durchzuführen.

Um ein Übertrocknen der Probe zu vermeiden. Legen Sie die Community auf die Unterseite des Aluminiumfolienbehälters und bedecken Sie die Probe sofort mit OCT bis zu drei bis vier Millimetern über der Community-Höhe. Warten Sie 10 Minuten.

Legen Sie schließlich die in das OCT eingebettete Probe auf eine Metallplatte auf Trockeneis, um die gefrorenen Gemeinschaften bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius zu lagern. Stellen Sie zur Vorbereitung der Sektion von gefrorenen Gemeinschaften die Temperatur der Kryo-Schnittkammer auf minus 25 Grad Celsius ein. Lassen Sie die Proben in der Kammer, bis ihre Temperatur die Temperatur der Kammer erreicht.

Entfernen Sie dann die Folie von der Probe und schneiden Sie das überschüssige OCT ab. Tragen Sie einen Tropfen OCT auf eine Kryo-Halterung auf und montieren Sie die Probe auf die Kryo-Halterung. Verteilen Sie das OCT gleichmäßig auf der Seite der Probe mit freiliegendem Watman-Filterpapier, so dass die OCT-Dicke zwei bis drei Millimeter beträgt.

Die Gewährleistung eines OCT-Randes von zwei bis drei Millimetern auf allen Seiten der Probe trägt dazu bei, die Integrität der Schnitte zu erhalten. Lassen Sie das OCT in der Kryostatkammer einfrieren, bevor Sie es schneiden. Verwenden Sie die Seiten des OCT-Probenblocks, um die Probe in Bezug auf die Klinge auszurichten.

Wenn die Probe nicht in Bezug auf die Klinge ausgerichtet ist, beginnt das Schneiden an einer Ecke oder Seite der Probe. Stellen Sie die Halterung so ein, dass die Klinge eine perfekt vertikale Fläche des Probenblocks schneidet. Typische Abschnitte für Hefegemeinschaften sind etwa 14 Mikrometer dick.

Verwenden Sie nach dem Schneiden eines Schnitts einen Objektträger, der bei Raumtemperatur aufbewahrt wird, um den Schnitt zu entnehmen. Durch langsames Bewegen des Objektträgers in den Schnittbereich schmilzt der Schnitt und wird auf das Mikroskop übertragen. Folie bis zu 18 Sektionen können auf eine Folie übertragen werden.

Lagern Sie die Objektträger vor der Bildgebung bei kalten Temperaturen, vorzugsweise minus 20 Grad Celsius. Der Signalverlust ist minimal, wenn es eine Woche lang bei vier Grad Celsius gehalten wird, um ein maximales Fluoreszenzsignal zu erzielen. Die Bildgebung sollte unmittelbar nach dem Schnitt erfolgen.

Repräsentative Fluoreszenzbilder von vertikalen Querschnitten von Hefegemeinschaften, die unter identischen Bedingungen gezüchtet wurden, sind hier zu sehen. Die Gemeinschaft besteht aus zwei phototropen Stämmen von Vinier, die mit den fluoreszierenden Proteinen markiert sind. M-Kirsche als Rot und Y-E-G-F-P als grüne Konkurrenz um gemeinsam genutzte Ressourcen, einschließlich des Raums, führt zu säulenförmigen Mustern, wie sie in ihren vertikalen Querschnitten dargestellt werden.

Auflösungen bis hinunter zu einer einzelnen Zelle können in Querschnitten aufgelöst werden. In dieser Abbildung werden die Querschnitte verglichen, die mit der Methanol-Befestigung in der unteren Platte und ohne Methanol-Befestigung in der oberen Platte erhalten wurden. Das Fluoreszenzsignal bleibt in den Community-Abschnitten ohne Korrektur erhalten, aber die Integrität der Community ist gefährdet.

Infolgedessen schwimmen einige Zellen am Rand des Abschnitts weg und der Gesamtertrag ist im Vergleich zu festen Gemeinschaften geringer. Die Methanolfixierung hält die Zellen der Gemeinschaft zusammen, führt aber zu einer Schrumpfung, wie bei der Abnahme der Gemeinschaftshöhe zu beobachten ist. Diese Abbildung zeigt repräsentative vertikale Hellfeld- und Fluoreszenzquerschnitte einer Hefegemeinschaft, die aus zwei protopischen Stämmen besteht, die mit den fluoreszierenden Proteinen DS RED und YFP angereichert sind.

Zellen an der Spitze der Gemeinschaft bilden eine Krone, die sich von den Mutterzellen zu unterscheiden scheint und sich durch eine stärkere Streuung im Hellfeld und eine hellere Fluoreszenz auszeichnet. Diese Muster stimmen mit den berichteten Differenzierungsmustern in Hefekolonien überein. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Kryosektion zur Untersuchung der Fluoreszenz-Su-Raummuster innerhalb von Hefegemeinschaften einsetzen können.