Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus Plasmodium berghei ANKA-infizierte Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, adhärente entzündliche Leukozyten aus Hirnblutgefäßen von mit Plasmodium burge eye anca infizierten Mäusen zu isolieren, um experimentelle zerebrale Malaria zu induzieren. Mäuse infizieren sich durch Injektion mit Plasmodium berge eye anca parasitierten roten Blutkörperchen. Nachdem die Mäuse Anzeichen einer Krankheit zeigen, werden die zirkulierenden Zellen der mit Malaria infizierten Mäuse durch intraorale Perfusion entfernt.

Das Gehirn wird dann entnommen und das Gewebe mit Enzymen verdaut, um die Isolierung von entzündlichen Leukozyten zu ermöglichen. Anschließend wird eine mehrfarbige Durchflusszytometrie zum Immunphänotyp durchgeführt. Die Analyse der resultierenden Daten durch sequestrierte Leukozyten im Gehirn zeigt den prozentualen und absoluten Prozentsatz der Leukozyten, die in das Gehirn von Malaria-infizierten Mäusen wandern.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Malaria-Pathogenese zu beantworten, z. B. welche Art von Entzündungszellen an den Ort der Parasitenbindung im Gehirn infizierter Tiere unter verschiedenen experimentellen Bedingungen wandern. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Die Perfusionsschritte sind schwer zu erlernen, da sie sowohl Schnelligkeit als auch Sorgfalt erfordern, um keine signifikanten Blutgefäße zu beschädigen. Einige Teile dieses Verfahrens werden von Leanna Mcic, einer Tiertechnikerin, Frau Victoria, Rick, einem Doktoranden, und Dr. Lisa Aez, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert.

Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Mäuse mit P berge eye anca auftauen, einem kryokonservierten Aliquot von P berge eye anca parasitierten roten Blutkörperchen oder pbcs, indem Sie es auf Raumtemperatur kommen lassen. Nehmen Sie eine acht bis 12 Wochen alte Spendermaus aus ihrem Käfig und legen Sie sie auf einen Arbeitsplatz. Fassen Sie das Genick des Halses zwischen Zeigefinger und Daumen.

Drehen Sie die Maus um und injizieren Sie 100 bis 200 Mikroliter Plasmodium berge Auge in die Bauchhöhle. Routinemäßig werden zwei Spendermäuse mit PBCS injiziert. Setzen Sie die Mäuse nach der Injektion vier bis fünf Tage nach der Infektion in ihren Käfig.

Nehmen Sie eine Spendermaus aus dem Käfig und platzieren Sie sie auf einer Workstation. Platzieren Sie einen Tropfen Blut aus der Schwanzvene der Maus in der Nähe des Endes eines mattierten Objektträgers. Platzieren Sie eine zweite Folie in einem 45-Grad-Winkel und setzen Sie sie wieder in den Blutstropfen

Sobald sich das Blut entlang der Kante ausbreitet, schieben Sie den Objektträger gleichmäßig über den Objektträger, um den Blutausstrich zu machen. Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen, um die Blutausstriche zu fixieren. Tauchen Sie die Objektträger 30 Sekunden lang in 100%Methanol

Anschließend die Objektträger 10 Minuten lang in frisch vorbereitetem GIM ZA färben, nach dem Färben mit GIM ZA den Objektträger 30 Sekunden lang unter fließendem Wasser abspülen. Lassen Sie den Objektträger an der Luft trocknen und untersuchen Sie ihn dann unter dem Mikroskop mit der 100-fachen Öl-Tauchlinse. Zählen Sie den PRBC innerhalb von tausend Erythrozyten auf und berechnen Sie Prozent para, wenn die Spendermaus die erforderlichen Werte von 2,5 bis 5 % erreicht hatParsit Sammeln Sie Blut von der Spendermaus durch Herzpunktion unter Narkose oder retroorbitale Blutung mit einem heparinisierten Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen.

Lösen Sie das Blut in RPMI-Medium in einer Endkonzentration von eins mal 10 bis sechs PRBC pro 0,2 Milliliter pro Maus auf. Bedenken Sie, dass ein normaler Hämatokrit der Maus etwa sechsmal 10 bis zum neunten roten Blutkörperchen pro Milliliter beträgt. In der Tat, acht bis 12 Wochen alte experimentelle C 57 schwarz sechs Mäuse, indem sie einmal 10 bis zum sechsten PRBC in 0,2 Milliliter intraperitoneal injizierten, wie zuvor.

Um die para-Spiegel infizierter Mäuse zu überwachen, bereiten Sie wie zuvor einen Blutausstrich vor. Para sollte alle zwei bis drei Tage ab dem zweiten oder dritten Tag nach der Infektion ab dem fünften Tag bestimmt werden. Ab der Infektion.

Mäuse werden täglich auf Anzeichen von schwerer Malaria überwacht, sobald die Para-Werte mehr als 5 % betragen, und Mäuse zeigen etwa am sechsten Tag nach der Infektion neurologische Symptome. Die infizierten Mäuse werden durch CO2-Inhalation euthanasiert und sofort mit PBS perfundiert, wie im Begleitdokument beschrieben. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die intrakardiale Perfusion.

Hier finden Sie eine Reihe von Tipps zur Fehlerbehebung: Mit der Maus auf einer Styropor-Sezierplatte. In einer Sezierschale. Wischen Sie die Bauchseite mit 70 % Ethanol ab und verwenden Sie dann eine große Schere und Pinzette, um die Haut entlang der Mittellinie zu öffnen, um die Brusthöhle freizulegen, die Haut zu falten und an den Seiten festzustecken.

Halten Sie das Brustbein mit einer feinen Pinzette fest und schneiden Sie das Zwerchfell und entlang beider Seiten des Brustbeins, wobei Sie die Rippen durchtrennen. Achten Sie darauf, keine großen Blutgefäße zu beschädigen. Stecken Sie den Brustkorb am Brustbein locker neben den Kopf.

Halten Sie die Ventrikel mit einer feinen Pinzette fest und schneiden Sie den rechten Vorhof vorsichtig mit einer feinen Schere ein. Führen Sie die 23-Gauge-Nadel, die am Schwerkraftperfusionssystem befestigt ist, in den linken Ventrikel in Richtung der aufsteigenden Aorta ein. Während PBS läuft, führen Sie nur 0,5 Zentimeter der Nadelspitze ein und perfundieren Sie die Maus fünf Minuten lang oder bis der Abfluss klar ist.

Nach der interalen Perfusion wird das Gehirn präpariert und in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit RPMI gelegt. Mittel. Legen Sie das frisch entnommene Gehirn auf ein Zellsieb aus Edelstahl mit einer Maschenweite von 40 bis 60 Maschen in eine Petrischale, die drei bis fünf Milliliter RPMI-Gewebekulturmedium enthält. Schneide das Hirngewebe in kleine Stücke.

Dann schieben Sie mit einem Kristallkolben kleine Stücke Hirngewebe durch das Zellsieb. Übertragen Sie das Gehirnhomogenat in ein 10-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 250 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Schleudern den Überstand verwerfen und das Kügelchen in drei Millilitern RPMI auflösen.

Medium, das Kollagenase D und DNA-Schwan enthält. Drehen Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie alle Zelltrümmer, indem Sie die Mischung durch ein 70-Mikron-Nylon-Zellsieb drücken.

Nach der Inkubation in einem 10-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Das Gehirnhomogenat vorsichtig auf eine Zentrifuge mit sieben Millilitern und 30 % pro Anrufkissen bei 400 mal G für 20 Minuten bei Raumtemperatur auflegen, wobei die Unterbrechung abgebrochen wird. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Lyse roter Blutkörperchen, puffern Sie es und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf Eis.

Zur Lyse von adhärenten PBCS, die nicht durch intraorale Perfusion aus dem Gehirn entfernt werden. Fügen Sie neun Milliliter RPMI-Medium-Waschzellen hinzu und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 250-fachem G. Bei der Reanimation werden die sequestrierten Leukozyten des Gehirns oder BSL-haltige Pellets in 50 bis 100 Mikrolitern RPMI-Medium suspendiert und die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, lebensfähige Zellen unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer und einem Trianblau-Ausschluss

Sechs Tage nach der Infektion können 20.000 bis 100.000 BSLs zurückgewonnen werden, sobald die Anzahl der lebensfähigen Zellen erhalten wurde. Die Zellen werden für die Analyse mittels Durchflusszytometrie vorbereitet. Die Einzelheiten zu diesem Verfahren sind im Begleitdokument aufgeführt, werden aber zunächst hier zusammengefasst.

Alle aus jedem Gehirn isolierten Zellen werden in einem 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen zentrifugiert und in Färbepuffer mit Anti-CD 16- und CD 32-blockierenden Antikörpern resuspendiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis werden die Zellen mit Färbepuffer gewaschen, erneut zentrifugiert und in Färbepuffer resuspendiert, der Anti-CD 4, Anti CD 8, Anti TCR und Anti NK 1.1 Fluoreszenzantikörper enthält. Die Zellen werden eine Stunde lang auf Eis inkubiert, mit Färbemitteln, Puffer und Zentrifuge gewaschen.

Nach dem Spin werden die Zellen in PBS resuspendiert und mindestens 5.000 bis 10.000 Ereignisse werden auf einem Durchflusszytometer erfasst. Die resultierenden Daten werden mit einer geeigneten Durchflusszytometrie-Software analysiert. BSL-Populationen wurden aus Gehirnen von perfundierten oder UN-perfundierten, Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen gewonnen und mit pe, anti NK 1.1 und einem PC anti TCR beta-Antikörper gefärbt.

Diese Punktdiagramme zeigen den prozentualen Anteil von NK-Zellen, T-Lymphozyten, NK 1.1-positiven TCR-positiven Zellen und doppelt negativen Zellen. NK 1.1 negativer TCR-negativer in perfundierten oder nicht fusionierten, Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen, die mit früheren Befunden übereinstimmen. Alpha-beta-TCR-positive T-Zellen machten am sechsten Tag nach der Infektion einen hohen Anteil des BSL-Pools in Gehirnen von perfundierten Malaria-infizierten Mäusen aus.

Diese Population schien in den Gehirnen von nicht durchbluteten Tieren deutlich unterrepräsentiert zu sein. Die offensichtliche Verringerung der T-Zell-Frequenzen in nicht perfundierten Gehirnen war bei diesen Tieren mit einem deutlich höheren Prozentsatz und einer höheren Gesamtzahl doppelt negativer Zellen verbunden. Ein hoher Prozentsatz und eine hohe Anzahl von doppelt negativen Zellen in nicht durchbluteten Gehirnen wurden nicht nur bei Malaria-infizierten Mäusen nachgewiesen, sondern auch bei naiven Kontrollen, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen Zellen um nicht-entzündliche Leukozyten handelt, die in den Blutgefäßen des Gehirns vorhanden sind und zusammen mit Entzündungszellen wiederhergestellt werden, wenn keine intrakardiale Perfusion durchgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, vor der Organentnahme eine umfangreiche intrakardiografische Profusion von infizierten Mäusen durchzuführen, um eine Kontamination der sequestrierten Leukozyten mit nicht-entzündlichen zirkulierenden Zellen zu vermeiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hirnsequestrierte Leukozyten von mit Plasmodium virga infizierten Mäusen durch fließende Geometrie isoliert und analysiert.