Name: Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus Plasmodium berghei ANKA-infizierte Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Leukozyten aus Gehirngefäßen bei Plasmodium berghei ANKA-infizierten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die quantifizierende und phänotypische Charakterisierung durch Flusszytometrie.

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Die Autoren bedanken sich bei Frau Liana Mackiewicz für die technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde ermöglicht durch Victorian State Government Operational Support der Infrastruktur und der australischen Regierung National Health and Medical Research Council IRIISS und Project Grant 1031212.

Ein. Infektion von Mäusen mit P. berghei-ANKA <ol><li> Defrost ein Aliquot von kryokonservierten P. berghei ANKA PRBC. </li><li> Restrain eine zerebrale Malaria-resistente BALB / c Donor-Maus (8-12 Wochen alt) mit dem two-handed Zurückhaltung Technik. Inject Maus mit 100-200 ul PRBC mit einer 1 ml Insulinspritze (28G Nadel). Routinemäßig werden 1-2 Spender-Mäusen injiziert. </li><li> Am Tag 4-5 nach der Infektion (pi) zu entfernen Donor-Maus aus dem Käfig und legen Sie sie auf einer Workstation oder einem Einweg arbeiten Pad. </li><li> Gently zurückzuhalten Maus bis zum Ende des Schwanzes und mit einer kleinen Schere schneiden Sie die Schwanzspitze (ca. 1 mm). Alternativ könnte ein kleiner Einstich mit einem Schwanz 25 G Nadel vorgenommen werden. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Blut aus der Maus Schwanzvene am Ende einer mattierten-End-Mikroskop-Objektträger. </li><li> Legen Sie einen zweiten Schieber (Spreader) auf einem 45 ° Winkel und es zurück in den Blutstropfen. Sobald das Blut breitet sich entlang der Kante, drücken Sie den Streuer-slide evenly auf dem Objektträger um die Blutausstrich machen. Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen. </li><li> Fix Blutausstrichen in 100% Methanol für 30 Sekunden und dann färben Folien in frisch hergestelltem Giemsa für 10 min. </li><li> Spülen Blutausstrich mit fließendem Wasser für 1 min, an der Luft trocknen lassen und untersuchen Objektträger unter dem Mikroskop (100x, Öl-Immersion). Aufzählen PRBC in 1.000 Erythrozyten und berechne Prozent Parasitämie. Donor Mäuse sollten Parasitämie Ebenen zwischen 2,5-5% erreichen, bevor sie für die Infektion von Versuchstieren entlüftet werden. </li><li> Blutentnahme von dem Spender Maus durch retroorbitale Blutungen unter Verwendung eines Mikro-heparinisierten Hämatokrit Kapillarrohr. Alle Versuche werden in Übereinstimmung mit den Walter &amp; Eliza Hall Institut Animal Ethics Committee Anforderungen durchgeführt. Je nach den örtlichen Tier Ethic Committee andere Anforderungen Blutungen Verfahren verwendet werden könnten. Aufzulösen erforderliche Blutmenge in RPMI-Medium mit einer Endkonzentration von 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Bedenken Sie, dasseine normale Maus Hämatokrit ~ 6x10 9 roten Blutkörperchen / 1 ml. </li><li> Infect experimentellen C57BL / 6 Mäuse (8-12 Wochen alt) durch Einspritzen intraperitoneal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml. </li><li> Um Parasitämie Ebenen der infizierten Mäusen beobachten die Schritte 1,3-1,8. Parasitämie sollte ermittelt alle 2-3 Tage, beginnend am Tag 2 oder 3 pi </li><li> Auftreten einer schweren Malaria in C57BL / 6 Mäusen manifestieren könnte als gekrümmte Erscheinung, ruffed Fell und geringe Aktivität. Einige Mäuse können in dieser Phase zu erholen, aber Progression zu Verlust der Selbstkontrolle aufrichtenden Reflex zeigt irreversible Krankheit und Tiere müssen eingeschläfert werden. </li></ol> 2. Intrakardiale Perfusion von Mäusen und Brain Extraction <ol><li> Montieren einer manuellen Schwerkraft Perfusionssystem durch Befestigen eines 500 ml Reservoir zu einer Säule angebrachten Halter Anfang einer 60 cm Säule Ständer. Verbinden Kunststoffrohr am unteren Ende des Reservoirs und sichern eine Schlauchklemme zum Puffer zu steuern. Befestigen Sie Schlauch mit einer 23 G Nadel. Fill bis das Reservoir mit PBS (gehalten bei 22 ° C), öffnen Sie klemmen und ermöglichen Puffer durch den Schlauch laufen, um alle Luftblasen zu entfernen. </li><li> Euthanize P. berghei ANKA-infizierten Maus durch CO 2-Inhalation. Bestätigen Tod durch das Fehlen des Pedals, Schwingschleifer und respiratorischen Reaktionen. </li><li> Merken eingeschläfert Maus durch den Hinterbeinen und Vorderpfoten dorsal auf einem Styropor-Dissektion Bord in einer Plastikschale enthalten. Je nach den örtlichen Tier Ethic Committee Anforderungen Anästhesie konnte vor Beginn der intrakardialen pefusion verabreicht werden. </li><li> Wischen Bauchseite mit 70% Ethanol. </li><li> Verwenden Sie große Schere und Pinzette die Haut entlang der Mittellinie öffnen, um die Brusthöhle aussetzen. Fach und Pin Haut an den Seiten. </li><li> Halten das Brustbein mit feinen Pinzetten und schneiden das Diaphragma und auf beiden Seiten des Brustbeins Durchtrennen der Rippen. Achten Sie darauf, dass keine großen Blutgefäße schädigen. </li><li> Pin der Brustkorb von dem Brustbein lose neben dem Kopf. </li><li> Halten Ventrikel with feinen Pinzette vorsichtig incise rechten Vorhof mit feinen Schere. </li><li> Legen 23G Nadel Schwerkraft Perfusionssystem in die linke Herzkammer zur Aorta ascendens während PBS läuft. Legen Sie nur 0,5 cm der Nadelspitze. </li><li> Perfundieren Maus für 5 min oder bis Ablauf ist klar. </li><li> Unpin Maus und legen Sie sie auf ihren Bauch. Wischen Sie den Kopf mit 70% Ethanol. </li><li> Mit großen Schere, einen Schnitt oberhalb des zervikalen Rückenmarks Bereich. </li><li> Verwenden feinen Schere zu machen eine mediane caudal-rostral Schnitt beginnend an der Basis des Schädels und schälen Haut weg, um den Schädel freizulegen. </li><li> Halten den Kopf, legen Sie die Blätter eines kleinen Schere in jeder Augenhöhle und einen Schnitt zwischen den Umlaufbahnen. </li><li> Machen Sie einen Längsschnitt entlang der Pfeilnaht und sorgfältig schälen Schädel auf jeder Gehirnhälfte nach außen. </li><li> Mit einem Spatel, heben das Gehirn und legen Sie sie in einem 10 ml Zentrifugenröhrchen mit RPMI-Medium. </li></ol>3. Isolierung von Brain-sequestered Leukozyten (BSL) <ol><li> Arbeiten in einer Sicherheitswerkbank, Ort frisch Gehirns auf einem Edelstahl-Zellsieb (40-60 Maschenweite) in eine Petrischale mit 3-5 ml RPMI Zellkulturmedium geerntet. </li><li> Cut Hirngewebe in kleine Stücke schneiden. </li><li> Push kleine Stücke von Hirngewebe durch die Zelle unter Verwendung eines Kristalls Sieb Druckfläche. </li><li> Übertragen Gehirnhomogenat in ein 10 ml Röhrchen und Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet in 3 ml RPMI-Medium, das 0,05% Collagenase D und 2U/ml DNAse I. </li><li> Drehen Mischung wird 30 min bei Raumtemperatur. Zelltrümmer zu entfernen, indem das Gemisch durch einen 70 um Nylon Zellsieb und / oder durch Inkubation auf Eis für 5 min. </li><li> Lay Hirnhomogenisat auf eine 7 ml 30% Percoll Kissen und Zentrifuge bei 400 × g (ungebremst) 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> Pellet in 1 ml Erythrozyten Lysepuffers und Inkubation auf Eis für 5 min auflysieren adhärenten PRBC, die nicht vom Gehirn konnte durch intrakardiale Perfusion entfernt werden. </li><li> 9 ml RPMI-Medium, waschen Zellen und Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren BSL-enthaltende Pellet in 50-100 ul RPMI-Medium und Transfer Zellen zu einem Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Verdünnte eine 5-10 ul Aliquots der Zellprobe 1:2 in Trypanblau zur Identifizierung von lebensfähigen Zellen. </li><li> Graf lebensfähigen Zellen unter dem Mikroskop mit einer Zählkammer. Von Tag 6 pi an, als P. berghei ANKA-infizierten Mäuse zeigen neurologische Symptome, 20.000-100.000 BSLs wiederhergestellt werden können. </li></ol> 4. Immunphänotypisierung der BSL durch Multicolour Durchflusszytometrie <ol><li> Zentrifuge Zellen bei 250 xg für 10 min bei 4 ° C, den Überstand aspirieren und Pellet in 50 ul Färbepuffer (PBS, 1% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mm EDTA). </li><li> Fügen Sie die 1 ul gereinigt anti-CD16/32 Antikörper (Fcblock). </li><li> Inkubieren Zellen für 10 min auf Eis. </li><li> Waschen der Zellen mit 1 ml der Färbung Buffer. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand. </li><li> Die Zellen in 50 ul Färbepuffer mit vorgegebenen optimalen Verdünnungen der erforderlichen fluoreszierenden Antikörpern, dh anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR-und Anti-NK1.1. </li><li> Inkubieren für 1 Stunde auf Eis. </li><li> Waschen der Zellen mit 1 ml der Färbung Buffer. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand. </li><li> Die Zellen in 100 ul PBS. </li><li> Übertragen Zellen einem Durchflusszytometrie Kunststoffrohr. </li><li> Mit einem Durchflusszytometer, erwerben mindestens 5.000-10.000 Ereignisse. Entsprechende ungefärbten Zelle steuert und Fluorochrom Entschädigung Proben enthalten, wie benötigt werden. </li><li> Analyse der Ergebnisse mit Hilfe geeigneter Durchflusszytometrie Software. </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Isolierung und Analyse der BSL ist eine Methode, Charakterisierung und Quantifizierung von Entzündungszellen die Migration auf das Gehirn als Reaktion auf Gewebeverletzung oder Infektion in experimentellen Mausmodellen können. Die Einführung eines intrakardialen Perfusion Schritt zur Entfernung des Organs Blutabteil vor Extraktion und anschließende Zellisolation ist nützlich, um eine Kontamination von entzündlichen Zellen mit nicht-entzündliche zirkulierenden Leukozyten zu verhindern. Dies könnte nicht eine wesentli...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösungen und Puffer </td></tr><tr><td> Giemsas azur Eosin-Methylenblau-Lösung </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 1:10-Verdünnung in destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> RPMI-Medium </td><td></td><td></td><td> Maus Tonus </td></tr><tr><td> Maus Tonus PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM Natriumphosphat, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% Trypanblau </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:2 Verdünnung </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Worthington Biochemical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DeoxyribonuClease (DNAse) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Von Rinderpankreas </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% ige Lösung in PBS </td></tr><tr><td> Ultrapure Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumchlorid (NH 4 Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14Nm NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA Dinatriumsalz </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antikörper und Konjugate </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD16/CD32 (Fc Block), Klon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 ul in 50 ul Färbepuffer (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-Maus-CD4, Klon H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-Maus-NK1.1, Klon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-Anti-Maus-CD8, Klon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-Maus-TCR-β, Klon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-Maus-CXCR3, Klon 220.803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Biotinyliertem Anti-Maus-CCR5, Klon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung und Material </td></tr><tr><td> SuperFrost Mikroskopobjektträger </td><td> Lomb Menzel-Gläser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection Zangen, Scheren </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS Reservoir </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gummischlauch </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G Nadel </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Zelldissoziationslösung Kit mit Metallsieb </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um Nylon Zellsieb </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Durchflusszytometrie </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und analyse von brain-sequestered leukozyten aus<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; anka-infizierte mäuse

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Wir beschreiben ein Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von adhärenten Entzündungszellen aus Gehirn Blutgefäße von P. berghei ANKA-infizierten Mäusen. Infektion von empfänglichen Maus-Stämme mit diesen Parasiten Dehnung ergibt sich bei der Induktion von experimenteller zerebrale Malaria, eine neurologische Syndrom daß rekapituliert bestimmte wichtige Aspekte des Plasmodium falciparum-vermittelte schwerer Malaria beim Menschen 1,2. Reifen Formen von Blut-stufigen Malaria exprimieren parasitäre Proteine ​​auf der Oberfläche der infizierten Erythrozyten, wodurch sie an vaskulären Endothelzellen binden können. Dieser Prozess induziert Hindernisse in den Blutfluss, was zu Sauerstoffmangel und Blutungen 3 und stimuliert auch die Rekrutierung von Entzündungszellen Leukozyten an den Ort der Parasit Sequestrierung. Im Gegensatz zu anderen Infektionen, also Viren neutrotopic 4-6, beide Malaria-Parasiten befallenen Erythrozyten (PRBC) sowie zugehörigen InflammAtory Leukozyten bleiben abgesondert innerhalb von Blutgefäßen als Infiltration des Hirnparenchym. So eine Kontamination des einsamen Leukozyten mit nicht-entzündlichen zirkulierenden Zellen, umfangreiche intrakardiale Perfusion von infizierten-Mäuse vor Organentnahme und Gewebe Verarbeitung zu vermeiden wird in diesem Verfahren erforderlich, um die Blut-Kompartiment zu entfernen. Nach Perfusion, werden geerntet und seziert Gehirne in kleine Stücke. Das Tissue-Struktur wird weiter durch enzymatische Behandlung mit Kollagenase D und DNAse I gestört Die resultierende Hirnhomogenisat wird dann auf einem Percoll-Gradienten, die Trennung von brain-sequestered Leukozyten (BSL) von Myelin und andere Gewebedebris ermöglicht zentrifugiert. Isolierte Zellen werden dann gewaschen, gezählt unter Verwendung eines Hämozytometers und gefärbt mit fluoreszierenden Antikörpern für die anschließende Analyse durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht eine umfassende phänotypische Charakterisierung von entzündlichen Leukozyten Migration auf das Gehirn in retion auf verschiedene Stimuli, einschließlich Schlaganfall sowie viralen oder parasitären Infektionen. Das Verfahren stellt auch ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung von neuartigen anti-inflammatorische Therapien in präklinischen Tiermodellen.

Die Ergebnisse in Abb.. 2 zeigen Prozentsätze und absolute Zahl der verschiedenen BSL Populationen aus Gehirnen von perfundierten oder unperfused Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen erholt. Isolated BSL wurden mit PE-anti-NK1.1 und APC-anti-TCR-β-Antikörper gefärbt, wie im Protokoll Text angezeigt. Übereinstimmend mit früheren Resultaten 7-9, bestehend αβTCR + T-Zellen einen hohen Anteil an der BSL Pool in Gehirnen von perfundierten Malaria-infizierte Mäuse (6 Tage pi). Diese Population z...

Verfahren zur Isolierung von adhärenten entzündliche Leukozyten aus dem Gehirn Blutgefäße<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierten Mäusen beschrieben. Das Verfahren ermöglicht die Quantifizierung sowie phänotypischen Charakterisierung von isolierten Leukozyten nach Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern und anschließende Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infizierte Mäuse

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, adhärente entzündliche Leukozyten aus Hirnblutgefäßen von mit Plasmodium burge eye anca infizierten Mäusen zu isolieren, um experimentelle zerebrale Malaria zu induzieren. Mäuse infizieren sich durch Injektion mit Plasmodium berge eye anca parasitierten roten Blutkörperchen. Nachdem die Mäuse Anzeichen einer Krankheit zeigen, werden die zirkulierenden Zellen der mit Malaria infizierten Mäuse durch intraorale Perfusion entfernt.Das Gehirn wird dann entnommen und das Gewebe mit Enzymen verdaut, um die Isolierung von entzündlichen Leukozyten zu ermöglichen. Anschließend wird eine mehrfarbige Durchflusszytometrie zum Immunphänotyp durchgeführt. Die Analyse der resultierenden Daten durch sequestrierte Leukozyten im Gehirn zeigt den prozentualen und absoluten Prozentsatz der Leukozyten, die in das Gehirn von Malaria-infizierten Mäusen wandern.Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Malaria-Pathogenese zu beantworten, z. B. welche Art von Entzündungszellen an den Ort der Parasitenbindung im Gehirn infizierter Tiere unter verschiedenen experimentellen Bedingungen wandern. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Die Perfusionsschritte sind schwer zu erlernen, da sie sowohl Schnelligkeit als auch Sorgfalt erfordern, um keine signifikanten Blutgefäße zu beschädigen. Einige Teile dieses Verfahrens werden von Leanna Mcic, einer Tiertechnikerin, Frau Victoria, Rick, einem Doktoranden, und Dr. Lisa Aez, einer Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstriert.Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Mäuse mit P berge eye anca auftauen, einem kryokonservierten Aliquot von P berge eye anca parasitierten roten Blutkörperchen oder pbcs, indem Sie es auf Raumtemperatur kommen lassen. Nehmen Sie eine acht bis 12 Wochen alte Spendermaus aus ihrem Käfig und legen Sie sie auf einen Arbeitsplatz. Fassen Sie das Genick des Halses zwischen Zeigefinger und Daumen.Drehen Sie die Maus um und injizieren Sie 100 bis 200 Mikroliter Plasmodium berge Auge in die Bauchhöhle. Routinemäßig werden zwei Spendermäuse mit PBCS injiziert. Setzen Sie die Mäuse nach der Injektion vier bis fünf Tage nach der Infektion in ihren Käfig.Nehmen Sie eine Spendermaus aus dem Käfig und platzieren Sie sie auf einer Workstation. Platzieren Sie einen Tropfen Blut aus der Schwanzvene der Maus in der Nähe des Endes eines mattierten Objektträgers. Platzieren Sie eine zweite Folie in einem 45-Grad-Winkel und setzen Sie sie wieder in den Blutstropfen.Sobald sich das Blut entlang der Kante ausbreitet, schieben Sie den Objektträger gleichmäßig über den Objektträger, um den Blutausstrich zu machen. Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen, um die Blutausstriche zu fixieren. Tauchen Sie die Objektträger 30 Sekunden lang in 100%Methanol.Anschließend die Objektträger 10 Minuten lang in frisch vorbereitetem GIM ZA färben, nach dem Färben mit GIM ZA den Objektträger 30 Sekunden lang unter fließendem Wasser abspülen. Lassen Sie den Objektträger an der Luft trocknen und untersuchen Sie ihn dann unter dem Mikroskop mit der 100-fachen Öl-Tauchlinse. Zählen Sie den PRBC innerhalb von tausend Erythrozyten auf und berechnen Sie Prozent para, wenn die Spendermaus die erforderlichen Werte von 2,5 bis 5 % erreicht hatParsit Sammeln Sie Blut von der Spendermaus durch Herzpunktion unter Narkose oder retroorbitale Blutung mit einem heparinisierten Mikrohämatokrit-Kapillarröhrchen.Lösen Sie das Blut in RPMI-Medium in einer Endkonzentration von eins mal 10 bis sechs PRBC pro 0,2 Milliliter pro Maus auf. Bedenken Sie, dass ein normaler Hämatokrit der Maus etwa sechsmal 10 bis zum neunten roten Blutkörperchen pro Milliliter beträgt. In der Tat, acht bis 12 Wochen alte experimentelle C 57 schwarz sechs Mäuse, indem sie einmal 10 bis zum sechsten PRBC in 0,2 Milliliter intraperitoneal injizierten, wie zuvor.Um die para-Spiegel infizierter Mäuse zu überwachen, bereiten Sie wie zuvor einen Blutausstrich vor. Para sollte alle zwei bis drei Tage ab dem zweiten oder dritten Tag nach der Infektion ab dem fünften Tag bestimmt werden. Ab der Infektion.Mäuse werden täglich auf Anzeichen von schwerer Malaria überwacht, sobald die Para-Werte mehr als 5 % betragen, und Mäuse zeigen etwa am sechsten Tag nach der Infektion neurologische Symptome. Die infizierten Mäuse werden durch CO2-Inhalation euthanasiert und sofort mit PBS perfundiert, wie im Begleitdokument beschrieben. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die intrakardiale Perfusion.Hier finden Sie eine Reihe von Tipps zur Fehlerbehebung: Mit der Maus auf einer Styropor-Sezierplatte. In einer Sezierschale. Wischen Sie die Bauchseite mit 70 % Ethanol ab und verwenden Sie dann eine große Schere und Pinzette, um die Haut entlang der Mittellinie zu öffnen, um die Brusthöhle freizulegen, die Haut zu falten und an den Seiten festzustecken.Halten Sie das Brustbein mit einer feinen Pinzette fest und schneiden Sie das Zwerchfell und entlang beider Seiten des Brustbeins, wobei Sie die Rippen durchtrennen. Achten Sie darauf, keine großen Blutgefäße zu beschädigen. Stecken Sie den Brustkorb am Brustbein locker neben den Kopf.Halten Sie die Ventrikel mit einer feinen Pinzette fest und schneiden Sie den rechten Vorhof vorsichtig mit einer feinen Schere ein. Führen Sie die 23-Gauge-Nadel, die am Schwerkraftperfusionssystem befestigt ist, in den linken Ventrikel in Richtung der aufsteigenden Aorta ein. Während PBS läuft, führen Sie nur 0,5 Zentimeter der Nadelspitze ein und perfundieren Sie die Maus fünf Minuten lang oder bis der Abfluss klar ist.Nach der interalen Perfusion wird das Gehirn präpariert und in ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit RPMI gelegt. Mittel. Legen Sie das frisch entnommene Gehirn auf ein Zellsieb aus Edelstahl mit einer Maschenweite von 40 bis 60 Maschen in eine Petrischale, die drei bis fünf Milliliter RPMI-Gewebekulturmedium enthält. Schneide das Hirngewebe in kleine Stücke.Dann schieben Sie mit einem Kristallkolben kleine Stücke Hirngewebe durch das Zellsieb. Übertragen Sie das Gehirnhomogenat in ein 10-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 250 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Schleudern den Überstand verwerfen und das Kügelchen in drei Millilitern RPMI auflösen.Medium, das Kollagenase D und DNA-Schwan enthält. Drehen Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie alle Zelltrümmer, indem Sie die Mischung durch ein 70-Mikron-Nylon-Zellsieb drücken.Nach der Inkubation in einem 10-Milliliter-Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis inkubieren. Das Gehirnhomogenat vorsichtig auf eine Zentrifuge mit sieben Millilitern und 30 % pro Anrufkissen bei 400 mal G für 20 Minuten bei Raumtemperatur auflegen, wobei die Unterbrechung abgebrochen wird. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Lyse roter Blutkörperchen, puffern Sie es und inkubieren Sie es fünf Minuten lang auf Eis.Zur Lyse von adhärenten PBCS, die nicht durch intraorale Perfusion aus dem Gehirn entfernt werden. Fügen Sie neun Milliliter RPMI-Medium-Waschzellen hinzu und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 250-fachem G. Bei der Reanimation werden die sequestrierten Leukozyten des Gehirns oder BSL-haltige Pellets in 50 bis 100 Mikrolitern RPMI-Medium suspendiert und die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, lebensfähige Zellen unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer und einem Trianblau-Ausschluss gezählt.Sechs Tage nach der Infektion können 20.000 bis 100.000 BSLs zurückgewonnen werden, sobald die Anzahl der lebensfähigen Zellen erhalten wurde. Die Zellen werden für die Analyse mittels Durchflusszytometrie vorbereitet. Die Einzelheiten zu diesem Verfahren sind im Begleitdokument aufgeführt, werden aber zunächst hier zusammengefasst.Alle aus jedem Gehirn isolierten Zellen werden in einem 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen zentrifugiert und in Färbepuffer mit Anti-CD 16- und CD 32-blockierenden Antikörpern resuspendiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis werden die Zellen mit Färbepuffer gewaschen, erneut zentrifugiert und in Färbepuffer resuspendiert, der Anti-CD 4, Anti CD 8, Anti TCR und Anti NK 1.1 Fluoreszenzantikörper enthält. Die Zellen werden eine Stunde lang auf Eis inkubiert, mit Färbemitteln, Puffer und Zentrifuge gewaschen.Nach dem Spin werden die Zellen in PBS resuspendiert und mindestens 5.000 bis 10.000 Ereignisse werden auf einem Durchflusszytometer erfasst. Die resultierenden Daten werden mit einer geeigneten Durchflusszytometrie-Software analysiert. BSL-Populationen wurden aus Gehirnen von perfundierten oder UN-perfundierten, Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen gewonnen und mit pe, anti NK 1.1 und einem PC anti TCR beta-Antikörper gefärbt.Diese Punktdiagramme zeigen den prozentualen Anteil von NK-Zellen, T-Lymphozyten, NK 1.1-positiven TCR-positiven Zellen und doppelt negativen Zellen. NK 1.1 negativer TCR-negativer in perfundierten oder nicht fusionierten, Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen, die mit früheren Befunden übereinstimmen. Alpha-beta-TCR-positive T-Zellen machten am sechsten Tag nach der Infektion einen hohen Anteil des BSL-Pools in Gehirnen von perfundierten Malaria-infizierten Mäusen aus.Diese Population schien in den Gehirnen von nicht durchbluteten Tieren deutlich unterrepräsentiert zu sein. Die offensichtliche Verringerung der T-Zell-Frequenzen in nicht perfundierten Gehirnen war bei diesen Tieren mit einem deutlich höheren Prozentsatz und einer höheren Gesamtzahl doppelt negativer Zellen verbunden. Ein hoher Prozentsatz und eine hohe Anzahl von doppelt negativen Zellen in nicht durchbluteten Gehirnen wurden nicht nur bei Malaria-infizierten Mäusen nachgewiesen, sondern auch bei naiven Kontrollen, was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen Zellen um nicht-entzündliche Leukozyten handelt, die in den Blutgefäßen des Gehirns vorhanden sind und zusammen mit Entzündungszellen wiederhergestellt werden, wenn keine intrakardiale Perfusion durchgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, vor der Organentnahme eine umfangreiche intrakardiografische Profusion von infizierten Mäusen durchzuführen, um eine Kontamination der sequestrierten Leukozyten mit nicht-entzündlichen zirkulierenden Zellen zu vermeiden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man hirnsequestrierte Leukozyten von mit Plasmodium virga infizierten Mäusen durch fließende Geometrie isoliert und analysiert.

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.

Isolierung von Brain-infiltrierenden Leukozyten

Dieses Video zeigt die Erstellung eines experimentellen Mausmodells für zerebrale Malaria. Sporozoiten, die aus mit Plasmodium berghei infizierten weiblichen Mücken isoliert wurden, werden in die Schwanzvenen einer gefesselten Maus injiziert, was zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke und einer Gehirnentzündung führt, die zerebrale Malaria verursacht. Dieses infizierte Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der mikrovaskulären Pathologie in vivo im Zusammenhang mit...

Generierung eines Mausmodells für experimentelle zerebrale Malaria unter Verwendung von Sporozoiten aus der Wirtsmücke

Dieses Video zeigt einen Assay zur Immunisierung eines Mausmodells mit lebenden abgeschwächten Sporozoiten. Die strahlengedämpften  Plasmodium-Sporozoiten werden in die dorsale Seite des Ohrs der Maus injiziert. Nach Injektionen an mehreren Stellen auf beiden Ohren kann sich die Maus erholen.

Intradermale Immunisierung mit lebenden abgeschwächten Sporozoiten in einem Mausmodell

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Isolierung myeloischer Zellen aus der Maushaut und der Drainage von Lymphknoten nach intradermaler  Injektion von Plasmodium-Sporozoiten. Die Durchflusszytometrie der gesammelten Zellen bietet einen zuverlässigen Assay zur Charakterisierung der Entzündungsreaktion der Haut und der Drainage von Lymphknoten auf den Parasiten.

Myeloischen Zellisolierung von Mäusehaut und ableitenden Lymphknoten Nach intradermale Impfung mit attenuierten Lebend<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoiten

Wir beschreiben ein Mausmodell der experimentellen zerebralen Malaria und zeigen, wie entzündliche und mikrovaskuläre Pathologien in vivo mit Hilfe der Magnetresonanztomographie verfolgt werden können.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

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Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu unterweisen, wie man murine Astrozyten- und Mikrogliazellen aus dem zentralen Nervensystem extrahiert, aufrechterhält und dissoziiert, gefolgt von einer Infektion mit Protozoenparasiten.

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Gleichzeitige Isolierung der wichtigsten Zelltypen des Zentralnervensystems aus adulten Autoimmun-Enzephalomyelitis-Mäusen

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Lernen Sie die Isolierung von Leukozyten aus Gehirngefäßen bei Plasmodium berghei ANKA-infizierten Mäusen. Diese Methode ermöglicht die quantifizierende und phänotypische Charakterisierung durch Flusszytometrie.

Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus

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