Name: Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie vakuoläre Ruptur durch intrazelluläre Erreger wie Shigella flexneri und Mycobacterium tuberculosis in Einzelzellen verfolgen. Diese CCF4-basierte Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen für Antibiotika-Screening.

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Diese Arbeit wurde von der Agence Nationale pour la Recherche und durch den European Research Council finanziert.

Der Test arbeitet in verschiedenen Formaten, jedoch empfehlen wir Verkleinerung das Probenvolumen um Reagenzien, insbesondere CCF4-AM zu speichern. Deshalb wird das folgende Protokoll für feste oder HeLa-Zellen THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen in einer 96-Well-Format beschrieben, dann für lebende HeLa-Zellen in 35 mm Petrischalen mit Glasboden. Der Assay kann für andere Krankheitserreger anzupassen. Neben Shigella-Infektion, beschreiben wir die Assay für THP-1 phagozytierenden verschiedenen m y cobacterial Stämme. Wichtig ist, dass nach CCF4-AM Laden, verlangen, dass alle Reagenzien und Puffer einschließlich Waschpuffern das Vorhandensein von Probenecid bei 1 mM. Probenecid ein Anion Kanal-Inhibitor, der cytosolischen Beibehaltung CCF4 fördert während aller Schritte des Protokolls. Feste Proben sollten innerhalb von ein paar Stunden nach dem Experiment erworben werden, da die CCF4 Signal ist nicht für lange Zeiträume stabil. 1. CCF4 Assay auf fixierten Proben mit Shigella flexneri (96 Well-Platten) <ol><li> Vorbereiten Bakterien für Übernacht-Kulturen. Impfen die bakteriellen Vorkulturen Wildtyp (M90T AFAI) und Mutante (BS176 AFAI) Stämme 1 Tag vor der Infektion in 8 ml Trypsin Casein-Soja-Bouillon (TCSB) mit Ampicillin (50 ug / ml) in einem Shaker ergänzt bei 37 ° C über Nacht . </li><li> Plating Zellen für eine Infektion. Seed HeLa-Zellen in 96-Well-Platten 1 Tag vor Infektion in einer Dichte von 5 × 10 3 Zellen pro Vertiefung in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 1% Penicillin-Streptomycin in einer 5% CO 2-Inkubator in einem Endvolumen von 100 ul. Im Fall von THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen wird die Zelle Plattieren 2 Tage vor Infektion in einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung durchgeführt, und sie sind mit 30 nM Phorbolmyristatacetat (PMA) in RPMI mit 10% inkubiert fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol. </li><li> Vorbereiten Bakterien für Subkultur. Impfen Nacht Bakterienkulturenbei einer Verdünnung 1/100 in TCSB mit 50 ug / ml Ampicillin in einem Schüttler bei 37 ° C und werden für 2,5 h (OD600 = 0,3 bis 0,4). </li><li> Loading-Zellen mit CCF4-AM. Bereiten Sie die CCF4-AM Laden-Mix für ein Endvolumen von 25 ul pro Well mit 1 mM Probenecid (Sigma), 1,5 uM CCF4-AM (6 pM bei THP-1) und 1,25 ul Laden Lösung B (100 mg / ml Pluronic F127-Tensid in DMSO/0.1% Essigsäure entlang CCF4-AM LiveBlazer geladen Kit von Invitrogen) in EM-Puffer (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 0,8 mM MgCl 2, 5 mM Glucose, 25 mM HEPES bei pH 7,3). Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und fügen Sie 25 ul CCF4-AM Laden Mischung pro Vertiefung bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2,5 Stunden. </li><li> Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Spin 1 ml der bakteriellen Subkulturen bei 9.000 rpm für 1 min. Waschen Sie einmal mit 500 ul PBS, Schleudern bei 9000 rpm für 1 min und Resuspendieren in 500 ul PBS mit 10 ug / ml Poly-L-Lysin (Sigma) und 40 ug / ml β-lacta ergänztMase (Sigma). Nach 10 min Inkubation auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur, einmal waschen mit 500 ul PBS resuspendieren und Bakterien in 500 ul EM Puffer / 1 mM Probenecid. </li><li> Handy-Infektion und Fixierung. Waschen Sie die Zellen einmal mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid, bereiten eine Mischung von 10 ul von Bakterien in einem Gesamtvolumen von 100 ul EM Puffer / 1 mM Probenecid resuspendiert und verteilen sie in jede Vertiefung. Nach 15 min Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur, schalten Sie die Platte auf 37 ° C für 1 Stunde (90 min bei THP-1) mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und fix mit 50 ul Paraformaldehyd 4% / 1 mM für 10 min im Dunkeln Probenecid. Dann, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid, für 30 min mit 30 ul 10 uM Kerne Farbstoff DRAQ5 (Biostatus) inkubieren waschen, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und verlassen Proben in 100 ul PBS / 1 mM Probenecid. </li><li> Acquisition Einstellungen festen Proben. Erwerb erfolgt entweder über (i) eine invertierte Epifluoreszenz microszu bewältigen mit einem 20x (0.5 Numerische Apertur (NA), 2.1 Arbeitsabstand (WD)) oder 40x (NA 0,75, 0,72 WD) N-Plan Luftobjektiv oder (ii) mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 10-fach Objektiv. Fluoreszenz-Bildgebung mit Anregung bei 405 nm durchgeführt (Semrock, FF01-387/11-25) und Emission über 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) und 535 nm (Semrock, erkannt FF01-520/35- 25) mit Belichtungszeiten von 5 ms (Durchlicht), 1000 msec (535 nm) und 500 ms (450 nm). Konfokale Bildgebung unter Verwendung des folgenden Belichtungszeit: 240 ms (450 nm) und 360 ms (535 nm) für die 405-nm-Laser (870 uW), 640 ms (DRAQ5) für die 640-nm-Laser (2560 uW). </li><li> Post-Akquisition-Analyse. Anschließend werden die Bilder von einem Computer-Algorithmus, der automatisch Scoring des Fluoreszenz-Signals für jeden einzelnen Zellen ermöglicht analysiert. Software wie Metamorph 7.1 oder Acapella kann verwendet werden, um ein Skript für die Messung des Verhältnisses zwischen den 450nm und 535nm Emission Signale zu schaffen (auf Anfrage). Zu beachten ist, ermöglicht die Verwendung eines Fokuskalibrierung gekoppelt automatisierte Mikroskopie während der Erfassung Erfassen Dutzenden von verschiedenen Positionen in mehreren Mulden gleichzeitig. </li></ol> 2. CCF4 Assay auf Live-Samples mit Shigella flexneri (35 mm Glas-bottom-Format, MatTek) <ol><li> Vorbereiten Bakterien für Übernacht-Kulturen. Gehen Sie wie zuvor beschrieben. </li><li> Plating Zellen für eine Infektion. Seed HeLa-Zellen in 35 mm Glasboden Kulturschalen (10 mm MatTek Microwell, MatTek corporation) 1 Tag vor der Infektion bei einer Dichte von 2 x 10 5 Zellen / Schale in einem Gesamtvolumen von 2 ml. </li><li> Vorbereiten Bakterien für Subkultur. Gehen Sie wie zuvor beschrieben. </li><li> Loading-Zellen mit CCF4-AM. Bereiten Sie die CCF-AM Laden Mix wie vorher für ein Endvolumen von 2 ml pro Schale beschrieben. Vor dem Laden, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. </li><li> Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Gehen Sie wie zuvor beschrieben. </li><li> AcquisitIonen-Einstellungen von Live-Proben. Die Erfassung wird für 60 min alle 90 sec mit einer invertierten Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x (NA 0.5, 2.1 WD) oder 40x (NA 0,75, 0,72 WD) N-Plan Luftobjektiv in einem 37 ° C Heizkammer durchgeführt. Fluoreszenz-Bildgebung mit Anregung bei 405 nm durchgeführt (Semrock, FF01-387/11-25) und Emission über 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) und 535 nm (Semrock, erkannt FF01-520/35- 25) mit Belichtungszeiten von 5 ms (Durchlicht), 200 ms (535 nm) und 100 ms (450 nm). </li><li> Handy-Infektion und Live-Akquisition. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml PBS / 1 mM Probenecid, 2 ml EM / 1 mM Probenecid, montieren Sie die Schüssel auf dem Tisch des Mikroskops und starten Sie die Übernahme. Nach 6 min (Zeitpunkt 4), setzen Sie den Erwerb zu halten, fügen Sie 250 ul Bakterien Resuspension auf der Oberseite der Zellen und starten Sie den Erwerb. </li><li> Post-Akquisition-Analyse. Filme können visualisiert werden mit Metamorph oder ImageJ. 450/535 nm Intensitätsverhältnissen für jeden einzelnenDual-Zelle unter Verwendung ImageJ werden. Wie bereits erwähnt, ermöglicht die Verwendung eines Fokuskalibrierung gekoppelt automatisierte Mikroskopie während der Erfassung Erfassen mehreren verschiedenen Positionen in Abhängigkeit von dem Zeitabstand. </li></ol> 3. CCF4 Assay auf Fixed Proben unter Verwendung von Mykobakterien (96 Well Format) <ol><li> Vorbereiten Bakterien. Wachsen Mykobakterienstämme bis zur mittleren logarithmischen Phase in 7H9 Albumin enthält Dextrose Katalase (ADC) bei 30 ° C (für Mycobacterium marinum) oder 37 ° C (für Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Plating Zellen für eine Infektion. Platte THP-1 Makrophagen 2 Tage vor Infektion Inkubation mit 30 nM PMA in RPMI mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin und 0,05 mM 2-Mercaptoethanol in einer 5% CO 2-Inkubator in einem Endvolumen von 100 ul mit einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung. </li><li> Vorbereiten Bakterien für eine Infektion. Harvest Kulturen, waschen und mit PBS resuspendieren vor Beschallung und Filtration durch eine Spritze, um zu vermeiden verklumpen. Bestimmen Sie die Konzentration von jedem Stamm von OD600 Messung und infizieren THP-1-Zellen bei einer MOI von 1:1 bei 30 ° C (für Mycobacterium marinum) oder 37 ° C (für Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis) in RPMI-Medium mit 5% CO 2. Nach 2 Stunden, Entfernen Mittel, 3 x waschen mit PBS und füge alle frisches Medium für 1 bis 2 Tage (im Fall von Mycobacterium marinum) oder 3 bis 7 Tagen (im Falle von Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis). </li><li> Loading-Zellen mit CCF4-AM und Fixierung. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS und bereiten die CCF4-AM Laden-Mix, wie zuvor für ein Endvolumen von 25 ul pro Well mit einem CCF4-AM Endkonzentration von 6 uM beschrieben. Die Beladung erfolgt bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 Stunden vor dem Waschen mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid und behebenation mit 50 ul Paraformaldehyd bei 4% ergänzt mit1 mM für 30 min im Dunkeln Probenecid. Dann, mit 150 ul PBS / 1 mM Probenecid waschen und verlassen Proben in 100 ul PBS / 1 mM Probenecid. </li><li> Acquisition Einstellungen und Post-Akquisition-Analyse. Gehen Sie wie bisher in den ersten Absatz mit Shigella flexneri beschrieben. </li></ol> Supplemental Protokoll Fluorimetrische Tests werden durchgeführt, um β-Lactamase-Aktivität an der Oberfläche der Bakterien zu überprüfen. Dies sollte für jeden Bakterienstamm bestimmt ist, in dem beschriebenen Test verwendet werden erfolgen. Zu diesem Zweck sind gewaschenen Bakterien in Kontakt mit 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml Schweine-Esterase Leberextrakten (Sigma) in 1 ml PBS setzen für 1 Stunde bei 37 ° C im Dunkeln. Lösliche Lactamase 1 mg / ml (Invitrogen) als positive Kontrolle verwendet werden. Dann wird ein Scan-Emission bei 405 nm Anregung unter Verwendung eines PTI Quantamaster Fluorimeter und 1 ml quartz Küvette. Der Verlust von FRET bei 535 nm und das Auftreten eines hohen Spitzenwert 450 nm sichtbar gemacht auf Bakterien neben der CCF4 Sonde.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die CCF4-AM/β-lactamase Assay ist eine einfache Methode, um Störungen durch intrazelluläre vacuolar Shigella flexneri und Mykobakterien in verschiedenen Zelltypen induziert verfolgen. Es nutzt eine Lactamase empfindlich zytoplasmatischen FRET Reporter, die von einem aktiven Enzym auf der Oberfläche der Bakterien gespalten wird. Verlust des CCF4-AM Substrat kann leicht durch Zugabe von Probenecid zu allen Lösungen nach dem Laden des Substrats vermieden werden. Wie gezeigt, kann der Test mehrere Zelltypen (Epithelzellen Phagozyten) und Formate (96 Vertiefungen, 35 mm Petrischalen mit Glasboden, 6/12/24 Well-Platten) angepasst werden. Für die Verwendung der 6/12/24 Well-Platte werden sterile Deckgläser am Boden jeder Vertiefung vor der Aussaat der Zellen verteilt. Am Ende des Versuches werden die Deckgläser auf Objektträger in Montage-Medium überführt, wie zum Beispiel Gold-Verlängern Antifade Reagent (Invitrogen). Auf diese Weise wird das Signal über einen längeren Zeitraum stabil nach dem Testim Vergleich zu den Vertiefungen 96 in dem Format Proben in PBS nach Fixierung erhalten bleiben. Die hohen Kosten der CCF4-AM Substrat sollte berücksichtigt vor der Bestimmung des Volumens der Probe zu entnehmen. Das ist, warum wir Verkleinern sind zu empfehlen. Experimente sind teurer in 6/12/24 Well-Format, aber die Signale sind seit Tagen stabil. Im Gegenteil, sind Versuche billiger in der 96-Well-Format, aber sind die Proben am Tag des Experiments analysiert werden. Bemerkenswert ist, daß Live-Experimente auch an der 96-Well oder 384-Well-Format durchgeführt werden. Dies ermöglicht die Durchführung Live-Experiment mit Dutzenden von Bedingungen zur gleichen Zeit (Bakterienmutanten, MOI, Plasmid oder siRNA-Transfektion, Chemikalien usw.) mit einer Anzahl von Positionen pro Vertiefung. Obwohl für Shigella flexneri geeignet, markieren wir, dass &quot;echte&quot; Echtzeit oder Zeitraffer-Experimente sind nicht für Mykobakterien Studien möglich, da die Infektion Zyklus übersteigt messbaren Konzentrationen von CCF4, die im Cytosol zurückgehalten werden kann. FürAus diesem Grund ist die CCF4-AM Substrat auf Zellen angewendet erst nach Einfall erreicht wird. Bei MetaMorph Software für die Erfassung und Analyse verwendet wird, empfehlen wir die Verwendung des Moduls &quot;Bildschirm Übernahme&quot;, die den Erwerb eines ganzen 96/384 Well-Platte mit einer bestimmten Anzahl von Bildern pro Vertiefung ermöglicht. Ferner sind die Module &quot;Beurteilung Bildschirm Daten&quot; können (i) die Visualisierung der Stickbild Mosaik von jeweils gut für jeden Kanal zur gleichen Zeit auf einem großen &quot;Plakat&quot; und (ii) eine spezielle Looping Algorithmus zur Messung der Intensitäten in der 535 und die 450 nm-Kanälen. Auch wenn wir in der Lage gewesen zu vacuolar Bruch durch einzelne Bakterien mit Zeitraffer-Mikroskopie zu messen, möchten wir darauf hinweisen, dass die enzymatische Aktivität auf der Oberfläche der einzelnen Bakterien Rendering variiert es schwierig, genau zu korrelieren Anzahl der intrazellulären Bakterien und Wirksamkeit der Vakuole Bruch. Aufgrund der Robustheit des Assays ist es für h geeignetoch Durchsatz nähert sich in 96 oder 384 Well Format. Wir haben auch erfolgreich dieses Protokoll für die FACS-Analyse, um die Infektion von Zellen in Suspension 16 studieren angepasst. Der Assay kann auch zur Untersuchung anderer Bakterien oder Träger präsentiert Lactamase auf ihrer Oberfläche, die zu einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden. Zum Beispiel kann dieser Ansatz verwendet werden, um vacuolar Bruch durch andere Erreger wie β-Lactamase exprimieren, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes und Salmonella typhimurium 12 induziert untersuchen. Da Listeria monocytogenes hat einen kurzen Zyklus Infektion vergleichbar mit Shigella flexneri sind Zeitraffer-Experimente möglich. Im Gegensatz dazu, weil Legionella pneumophila und Salmonella typhimurium Display lange Zyklen Infektion, empfehlen wir Ihnen Endpunkt Experimente durchzuführen. Die Vielfalt der möglichen Anwendungen macht das CCF4-AM/β-lactamase Assay eininteressant fluorometrische Verfahren zur Verfolgung vacuolar Bruch durch intrazelluläre Erreger in fixierten Proben oder in Echtzeit induziert.

Zahlreiche bakterielle Krankheitserreger sind in Membran-Kompartimente von eukaryotischen Zellen während ihrer Verlauf der Infektion verinnerlicht. Eintritt in die Zelle erfolgt entweder durch Phagozytose durch spezialisierte Wirtszellen, wie es der Fall für Mycobacterium tuberculosis, die von Makrophagen aufgenommen werden, oder die Erreger aktiv induzieren ihre Aufnahme in der Regel nicht Fresszellen. Bei der induzierten Aufnahme, beispielsweise zum Shigella flexneri, spritzt das Pathogen Effektorproteinen in den Wirt Cytosol, die unter anderem die Zellfunktionen streng reguliert endomembrane Sortiermaschinen was bakteriellen Lokalisierung innerhalb einer Endosomen 1,2 entführen. Anschließend stört Shigella das umschließende Membran führt zu vacuolar Bruch und cytosolischen Zugang des Erregers stören Wirtmembran Menschenhandel und die Vermeidung Lieferung an den Lysosomen. In jüngerer Zeit hat phagolysosomale Bruch auch als Infektion str gefundenategy von Mycobacterium tuberculosis, dass ein Erreger für eine lange Zeit, um ausschließlich innerhalb eines membrangebundenen Kompartiment 3,17 lokalisiert gedacht wurde. Um die Dynamik der subzellulären Membran Menschenhandel invasiver Krankheitserreger zu untersuchen, haben große Verbesserungen seit der Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) basiert Studien der späten 1980er Jahre 4,5 erreicht worden. Zum Beispiel, Fluoreszenzmikroskopie Methoden unter Verwendung von Farbstoffen, nahm Antikörper gegen bakterielle Oberfläche Komponenten oder Marker für die Co-Lokalisation mit subzellulären Kompartimenten über 6,7. Doch sie immer noch nicht erhalten genaue raumzeitliche Auflösung und Robustheit vacuolar Bruch durch bakterielle Erreger quantitativ zu messen. Diese Hürde wurde mit einem Test auf der Grundlage der Cephalosporin CCF4-AM FRET abgeleitet Reporter, die zum ersten Mal verwendet wurde, um die Genexpression studieren 8 angesprochen. Dann wurde sie in Zusammenhang mit der verwendeten infection Biologie zu untersuchen Effektor-Sekretion und um die Aufnahme von Neisseria in Wirtszellen 9,10,11 folgen. Wir entwickelten einen Test unter Ausnutzung dieser Reporter für das Studium vacuolar Bruch durch Shigella flexneri 12 und Mycobacterium tuberculosis 17 induziert. Das Prinzip unserer Methode ist in Abbildung 1 beschrieben mit Shigella flexneri. Zuerst werden Wirtszellen mit dem FRET CCF4-AM Substrat, das innerhalb des Zytoplasmas nach Abspaltung der Uhr Estereinheiten eingefangen geladen. Dann werden die Zellen mit Shigella flexneri infiziert. β-Lactamase, die auf der Oberfläche der Bakterien kann zur Spaltung des Substrats CCF4 sobald vacuolar Bruch auftritt. Dies führt zu einem Verlust des FRET-Signals Umschalten des Emissionsmaximum von 535 nm bis 450 nm bei Anregung von der Probe bei 405 nm. Die Quotientenmeßschaltung der 450/535 nm Intensitäten hebt vacuolar Integrität: niedrige Verhältnisse widerspiegeln Membran-engeschlossenen oder extrazellulären Bakterien während hohe Verhältnisse widerspiegeln Kontakt zwischen den Bakterien und dem Host Cytosol. Wir berichten auch über eine Anpassung dieser Methode zur Untersuchung phagosomalen Bruch von Mycobacterium tuberculosis in THP-1 Makrophagen induziert. Die experimentellen Prinzipien bleiben die gleichen, obwohl die Reihenfolge umgekehrt, CCF4-AM Belastung erst nach bakterielle Infektion angewendet wird. Somit kann durch quantitative ratiometrische Fluoreszenzmessungen an der Ebene einer einzelnen Zelle, kann die Vakuole Bruch Shigella flexneri in Echtzeit und in festen Proben aus verschiedenen Zelltypen 12,13,14 verfolgt werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren eine Reihe von anderen invasiven Krankheitserreger wie in dieser Studie mit Mycobacterium bovis und Mycobacterium tuberculosis gezeigt angepasst werden. Schließlich ermöglicht die Miniaturisierung der Protokoll mit 96 Vertiefungen (oder 384-Well-) Formate Screening von zahlreichen Bedingungen bei hohem Durchsatz.

<table><tbody><tr><td>LiveBlazer FRET-B/G Ladesatz (CCF4-AM) </td><td>Invitrogen</td><td>K1089</td><td>Schutz vor Licht, lagernd - 80 &de; aliquote</td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus</td><td>DR50050</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>&mu; CLEAR-PLATE, BLACK, 96 well </td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glasbodenschalen</td><td>MatTek corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-Lactamase</td><td>Sigma</td><td>P0389</td><td></td></tr></tbody></table>

single cell messungen vacuolar rupture durch intrazelluläre erreger verursacht

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri sind pathogene Bakterien, die Wirtszellen Eingehen einer endozytischen Vakuole eindringen. Anschließend kann der Bruch dieser Membran umschlossenen Kammer Bakterien im Cytosol zu bewegen, vermehren und weiter einzudringen Nachbarzellen. Mycobacterium tuberculosis durch Immunzellen phagozytiert, und vor kurzem zum Bruch phagosomalen Membran in Makrophagen gezeigt. Wir entwickelten einen robusten Assay zur Verfolgung phagosomalen Membranzerstörung nach Wirtszelle Eintrag von Shigella flexneri oder Mycobacterium tuberculosis. Der Ansatz nutzt CCF4 ein FRET Reporter empfindlich auf β-Lactamase, die in das Cytosol der Wirtszelle ausgleicht. Beim Eindringen von Wirtszellen, die durch bakterielle Pathogene, bleibt die Sonde intakt, solange die Bakterien in der Membran-Kompartimente befinden. Nach Unterbrechung der Vakuole, β-Lactamase-Aktivität auf der Oberfläche der intrazellulären Erregers spaltet CCF4 sofort führenING zu einem Verlust von FRET-Signals und der Umstellung seiner Emissionsspektrum. Diese robuste ratiometrischen Assay liefert genaue Informationen über den Zeitpunkt der Vakuole Bruch durch die eindringenden Bakterien induziert, und es kann zu automatisierten Mikroskopie und Bildverarbeitung durch spezialisierte Algorithmen für die Erkennung der Signale der Emission gekoppelt werden FRET-Donor und Akzeptor. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung der Dynamik der Vakuole Störungen, hervorgerufen durch intrazelluläre Bakterien in Echtzeit in einzelne Zellen. Schließlich ist es perfekt für das Hochdurchsatz-Analyse mit einer räumlich-zeitlichen Auflösung als bisherige Methoden geeignet. Hier bieten wir die experimentellen Details beispielhafter Protokolle für die CCF4 vacuolar Bruch Assay auf HeLa-Zellen und THP-1 Makrophagen für Zeitraffer-Experimente oder Endpunkte Experimente mit Shigella flexneri sowie mehrere Mykobakterienstämme wie Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, und Mycobacterium tuberculosis.

Die CCF4-AM/β-lactamase Ansatz ist eine robuste und sensitive Methode für die Verfolgung vacuolar Ruptur intrazelluläre Erreger wie Shigella flexneri (Abbildung 1). Die Shigella-Stämme, die in dieser Studie verwendet werden, sind M90T AFAI und BS176 AFAI bezeichnet. M90T AFAI ein Shigella flexneri Stamm, der das Adhäsin AfaE, die in der Lage, effizient binden CD55 auf der Oberfläche von Epithelzellen 15 drückt. Daher AfaE exprimierenden Stämmen zeigen viel höhere Invasion Fähigkeiten im Vergleich zum Wildtyp-Stamm M90T in Epithelzellen. BS176 AFAI ist ein Ausdruck AfaE mutierte Shigella flexneri Stamm frei von der Shigella Virulenzplasmid. Dieser Stamm ist nicht HeLa-Zellen einzudringen. Dennoch Dieser Stamm ist in der Lage, THP-1-Zellen geben, da die Aufnahme in dieser Zelllinie nur verlassen sich auf klassische Phagozytose und erfordert keine funktionellen Typ-3-Sekretionssystem. Beide Stämme exprimieren β-LactamaseUnd Anzeigen von β-Lactamase-Aktivität an ihrer Oberfläche durch das Vorhandensein des AfaE kodierenden Plasmid. Nach Infektion von HeLa-Zellen mit dem nicht-invasive BS176 AFAI Belastung für 1 h, das FRET CCF4 Sonde intakt, wie in 2A durch die grünes Signal (535 nm) gezeigt. Im Gegenteil führt die Infektion mit dem virulenten Stamm M90T AFAI für 1 Stunde mit einem Schalter des Signals in Richtung blau (450 nm) Hervorhebung der Spaltung der Sonde im Cytosol. Um dies zu quantifizieren, entwickelten wir ein Skript für das Metamorph und Acapella Software, die automatische Erkennung von Zellen und die Messung der Intensitäten in den 535 und 450 nm Kanäle für die Bestimmung der ratiometrische Signals ermöglicht. Wie in 2B gezeigt, sind Kerne und Cytosol von Zellen unter Verwendung des segmentierten DRAQ5 Kanal. Dann wird der Algorithmus in der Lage, die 450 nm und 535 nm die positiven Zellpopulationen zum Berechnen der Verhältnisse zwischen den zwei Intensitäten für jede einzelne Zelle, die erkennendargestellt als Histogramm in 2C. Low-Verhältnisse für den mutierten Stamm gegen hohe Verhältnisse für den virulenten Stamm erhalten. Während dieser repräsentativen Experiment Infektion erworben wurde mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie wird Epifluoreszenzmikroskopie auch für diese Aufgabe geeignet Abbildungen 3 und 4 zeigen Beispiele aus 2 verschiedenen menschlichen Zelltypen:. HeLa Epithelzellen und THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen. Nach Infektion mit dem virulenten M90T AFAI Shigella-Stamm für 1 Stunde und 90 min für HeLa und THP-1-Zellen, einen Schalter für das von grünen (535 nm) bis blau (450 nm) im Vergleich zu BS176 AFAI infizierten Zellen (3A beobachtet und 4A). Das Skript wir MetaMorph entwickelte Software erkennt unmittelbar die CCF4 positive Zellpopulation und berechnet das Verhältnis zwischen den Intensitäten in 450 und 535 nm Kanäle für jeden einzelnen Zellen. Dann werden Zellen, in Abhängigkeit von deren Verhältnis mit einem Makro entwi eingestuftped in Excel, wodurch man Histogramme, die die Verteilung der Zellen. Wie es der Fall gewesen ist für den anderen Skript für Acapella entwickelt werden BS176 AFAI infizierten Zellen durch niedrige Verhältnisse gekennzeichnet, während M90T AFAI infizierte Zellen hohe Übersetzungen mit der MetaMorph Algorithmus auf HeLa-Zellen und THP-1 Makrophagen (3B und 4B) anzuzeigen . Schließlich wird eine Anpassung dieser Methode auf die Untersuchung von Mykobakterien in Abbildung 5 dargestellt. Mycobacterium bovis BCG liegt in der phagosome für den gesamten Verlauf des Experiments, wie durch die starke 535 nm Signal während des zeitlichen Verlaufs des Experiments detektierten reflektierten. Im Gegensatz dazu löst Mycobacterium tuberculosis phagosomalen Membranreißen in THP-1 Makrophagen nach mehr als 3 Tagen nach der Infektion, wie durch einen 450 nm-Signal an 7 Tagen nach Infektion (5A und 5B) hervorgehoben. Mit dem gleichen Algorithmus wie für das Studium vacuolar Bruch durch Shigella </em&gt;, fanden wir, dass Mycobacterium tuberculosis infizierte Zellen höher 450/535 nm-Verhältnis als Mycobacterium bovis BCG Anzeige nach 7 Tagen der Infektion (5C und 5D). <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schema repräsentiert das Prinzip der CCF4-AM/β-lactamase Assay für die Verfolgung von Shigella flexneri vacuolar Bruch. CCF4-Uhr frei diffundiert durch die Plasmamembran in das Zytoplasma, wo Estereinheiten durch cytosolische Esterasen Herstellung CCF4 Anionen gespalten werden. Diese Reaktion verhindert das Eindringen von CCF4 jede Membran eingebettet Fach. Bei diesem Schritt löst CCF4 FRET bei 535 nm nach Anregung bei 405 nm gemessen. Die Sonde bleibt bis β-Lactamase-exprimierenden Bakterien Zerplatzen intakte Die endozytischen Vakuole. Bei diesem Schritt wird das FRET-Signal verloren geht, weil CCF4 von β-Lactamase Auslösung eines Schalters in Emission von 535 nm bis 450 nm nach Anregung bei 405 nm gespalten wird. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="2.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig2.jpg" /> Abbildung 2. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden, HeLa-Zellen werden mit dem β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm für 1 Stunde und festen infiziert mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden Kerne mit DRAQ5 angefärbt und die Zellen werden aufgenommen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 10-fach Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden fusionierten Kanäle gewählt: die intakte Sonde CCF4 erscheint bei 535 nm (grünn), wird die Sonde gespalten CCF4 bei 450 nm (blau). (B) Beispiele von Bildern Hervorhebung das Detektionssystem der automatisierten Algorithmus auf der Acapella Software. Die Segmentierung der Zellen (Kerne + Cytosol) wird nach der DRAQ5 Kanal. CCF4 positive Zellen werden unter Verwendung der 450 und 535 nm Kanäle gebündelt zusammen. (C) Histogramm der Ergebnisse unserer automatisierten Analyse auf Acapella mit Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm zeigt. Der Mittelwert stellt das Verhältnis zwischen der Intensität in der 450 und 535 nm Kanäle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50116/50116fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig3.jpg" /> Abbildung 3. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch in HeLa-Zellen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden werden HeLa-Zellen mit der β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI virulenten Stamm für 1 Stunde und infiziert fixiert mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden die Zellen abgebildet mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt:. CCF4 intakte Sonde 535 nm (grün) und CCF4 geschnittenen Sonde 450 nm (blau) (B) Histogramm repräsentiert das Ergebnis unseres automatisierten Analyse auf MetaMorph Software. Die einzelnen Zellen werden in Abhängigkeit von ihrem Verhältnis der Intensitäten in den 450 und 535 nm Kanäle. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50116/50116fig4.jpg" /> &gt; Abbildung 4. Tracking-Shigella flexneri vacuolar Bruch in THP-1-Zellen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A) Nach 2 Stunden 30 min von CCF4-AM Laden, THP-1-Zellen mit dem β-Lactamase-Expression Shigella flexneri BS176 AFAI mutierten Stamm oder M90T AFAI infiziert virulenten Stamm für 1 h 30 min und fest mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Dann werden die Zellen abgebildet mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv. Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt:. CCF4 intakte Sonde 535 nm (grün) und CCF4 geschnittenen Sonde 450 nm (blau) (B) Histogramm repräsentiert das Ergebnis unseres automatisierten Analyse mit dem MetaMorph Software. Die einzelnen Zellen werden in Abhängigkeit von ihrem Verhältnis der Intensitäten in den 450 und 535 nm Kanäle. ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Tracking Mycobacterium bovis BCG und Mycobacterium tuberculosis phagosomalen Bruch in THP-1 Makrophagen mit Epifluoreszenzmikroskopie. (A, B) THP-1-Zellen mit β-Lactamase-exprimierenden Mycobacterium bovis BCG oder Mycobacterium tuberculosis 2 h infiziert und kultiviert für 3 bis 7 Tage . Nach dem Waschen werden die Zellen mit geladen CCF-4-AM für 2 Stunden oder Fest mit 4% Paraformaldehyd für 30 min vor der Belichtung mit Hilfe eines Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem 40x. . Gespalten CCF4, Sonde 450 nm (blau) (C, D) Histogramme präsentiert das Ergebnis unserer automatisierten Analyse mit MetaMorph Software intakt CCF4 Sonde, 535 nm (grün): Repräsentative Bilder wurden mit den folgenden Kanäle gewählt. Einzelne Zellen als Funktion des Verhältnisses zwischen der Intensität in der 450 und 535 nm Kanäle.

Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre Bakterien<em&gt; Shigella flexneri<em&gt;</em</em&gt; Und<em<em&gt;<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt;</em</em&gt; Auf Wirtszelle Invasion. Unsere Assay nutzt CCF4 FRET ein Host zytoplasmatischen Sonde in lebenden oder fixierten Zellen. Dieser Reporter abgebaut wird durch ein Enzym-Aktivität, die auf der bakteriellen Oberfläche.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Dieses Experiment überwacht die von intrazellulären Krankheitserregern ausgelöste VA-Perforation in einzelnen Zellen. Zunächst beladen Sie die Zellen mit der CCF 4:00 AM-Farbstofflösung, die durch zelluläre Esterasen gespalten wird. Danach bereiten Sie die FL-Neuro-Bakterien vor und geben sie zu den mit CCF vier beladenen Zellen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, damit die Bakterien in die Wirtszellen eindringen können.Bestimmen Sie anschließend das Verhältnis der Intensitäten, die in den Kanälen bei 450 Nanometer und 535 Nanometer emittiert werden. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Krankheitserregern im Cytosol. Aufgrund ihrer Anpassungsfähigkeit an Hochdurchsatz-Lys ermöglicht diese Technik die Identifizierung neuartiger Antibiotika, indem sie ein zentrales Problem der subzellulären Lokalisation von Bakterien während der Interaktion zwischen Wirt und Krankheitserregern adressiert.Zusammen mit meinem Kollegen Tran Vanu interessierten wir uns dafür, Methoden zu entwickeln, um intrazelluläre Pathogene mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Dies führte zur Etablierung des CCF four betalactamase regular ular rupture Assays. Heute wird dieser Ansatz experimentell von zwei Doktorandinnen im Labor, Nora MellU und Charlotte Keller, vorgestellt. Inokulieren Sie die Wildtyp- und mutante Bakterienstämme in acht Milliliter TCSB, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthalten, und stellen Sie die Kulturen in einen 37 Grad Celsius warmen Schüttelinkubator. Säen Sie nun jeweils fünf mal 10 hoch drei Hela-Zellen pro Mulde aus.In 100 µL DMEM, das 10 % Fetalrinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin-Kultur enthielt, wurden die Zellen am nächsten Tag in einem 5-%-CO₂-Inkubator bei einer Verdünnung von 1:100 in TCSB, das mit 50 µg/mL Ampicillin ergänzt war, subkultiviert und für zweieinhalb Stunden in einem Schüttelinkubator bei 37 °C inkubiert. Um die Hela-Zellen für die Beladung vorzubereiten, bereiten Sie CCF 4:00 Uhr-Farbstoff in EM-Puffer vor, waschen die Zellen einmal mit PBS und geben anschließend 25 µL CCF 4:00 Uhr-Lademischung pro Vertiefung bei Raumtemperatur im Dunkeln für zwei Stunden und 30 Minuten hinzu. Um die Bakterien für die Infektion vorzubereiten, pelletieren Sie 1 mL Kultur durch Zentrifugation, waschen sie danach einmal mit 500 µL PBS auf, resuspendieren die Bakterien in 500 µL PBS, das mit 10 µg/mL Poly-L-Lysin und 40 µg/mL Beta-Lactamase ergänzt wurde.Inkubieren Sie 10 Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur, waschen Sie dann einmal mit 500 Mikrolitern PBS und resuspendieren Sie jedes bakterielle Pellet in 500 Mikrolitern eines einmillimolaren Probenecid in EM-Puffer; waschen Sie die Zellen einmal mit 150 Mikrolitern eines einmillimolaren Prob in EM-Puffer. Verdünnen Sie anschließend 10 Mikroliter Bakterien in 100 Mikrolitern einer einmillimolaren Probed-Lösung und geben Sie diese auf jede Vertiefung mit Hela-Zellen. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur überführen Sie die Platte für eine Stunde auf 37 Grad Celsius.Einmal mit 150 Mikrolitern einer einmillimolaren Probit-Lösung waschen. Anschließend die Proben mit 50 Mikrolitern 4 %iger Paraformaldehyd-Lösung in einer einmillimolaren Pro-Lösung 10 Minuten im Dunkeln fixieren. Nach einer Wäsche mit Probenecid-Lösung 30 Mikroliter einer 10-Mikromolar-Lösung des nuklearen Farbstoffs DRAQ5 zur optimalen Zellsegmentierung hinzufügen. Die Zellen 30 Minuten lang inkubieren, einmal waschen und 100 Mikroliter einer einmillimolaren Lösung zugeben, um die Bilder mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop aufzunehmen.Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 405 Nanometern. Detektieren Sie die Emission über Filter bei 450 Nanometern und 535 Nanometern mit Belichtungszeiten von fünf Millisekunden für transmittiertes Licht, 1000 Millisekunden für 535 Nanometer und 500 Millisekunden für 450 Nanometer.Die Verwendung einer Fokus-Kalibriervorrichtung in Kombination mit automatisierter Mikroskopie ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von Dutzenden verschiedener Positionen in mehreren Vertiefungen. Bei Verwendung eines konfokalen Mikroskops sollten Belichtungszeiten von 240 Millisekunden bei 450 Nanometern, 360 Millisekunden bei 535 Nanometern für den 405-Nanometer-Laser und 640 Millisekunden für den 640-Nanometer-Laser gewählt werden. Analysieren Sie die Daten mithilfe eines Computeralgorithmus, der eine automatisierte Bewertung des Fluoreszenzsignals für jede einzelne Zelle ermöglicht.Verwenden Sie beispielsweise Software wie Metamorph und Acapella, um ein Skript zur Messung des Verhältnisses zwischen den Emissionssignalen bei 450 Nanometer und 535 Nanometer zu erstellen. Beginnen Sie für diesen Assay eine HELOC-Kultur mit zwei mal 10 hoch fünf Zellen in einem Endvolumen von zwei Milliliter. Bereiten Sie die Bakterien für die Infektion vor und beladen Sie die Hela-Zellen mit CCF 4:00 AM. Richten Sie ein Konfokalmikroskop mit einer N-Plan-Luft-Objektivlinse innerhalb einer 37 Grad Celsius-Heizkammer ein.Stellen Sie den 405 Nanometer Laser ein und leiten Sie die Emission über 450 Nanometer und 535 Nanometer Filter ab. Geben Sie außerdem Belichtungszeiten von fünf Millisekunden für das durchgehende Licht, 200 Millisekunden für 535 Nanometer und 100 Millisekunden für 450 Nanometer ein.Stellen Sie die Datenaufnahme alle 90 Sekunden über 60 Minuten ein. Waschen Sie die Zellen nun einmal mit zwei Milliliter einer einmillimolaren Probenecid-Lösung. Geben Sie zwei Milliliter einer einmillimolaren Probenecid-Pufferlösung hinzu.Danach die Schale auf den Mikroskopständer stellen und die Aufnahme nach sechs Minuten starten. Die Aufnahme anhalten. 250 Mikroliter der bakteriellen Suspension auf die Zellen geben und die Aufnahme für die Nachanalyse erneut starten.Stellen Sie Filme mit Velocity Metamorph oder ImageJ dar. Ermitteln Sie Intensitätsverhältnisse von 450 bis 535 Nanometer für jede einzelne Zelle. Die CCF 4:00 AM Beta-Lactamase-Methode ist eine robuste und empfindliche Methode, um die Lyse intrazellulärer Erreger wie Shigella flexneri während der Infektion von HEp-2-Zellen zu verfolgen. Bei nicht-invasiver Inkubation der Stammzelle BS 176 AFA für eine Stunde bleibt die CCF-vier-FRET-Sonde intakt und emittiert ein grünes Signal.Im Gegensatz dazu schaltet der virulente Stamm M 90 TFA I das Signal in Richtung Blau um, was mit einer Spaltung des Probes im Cytosol zur Bestimmung des ratiometrischen Signals übereinstimmt. Wir haben ein Skript für die Metamorph- und Acapella-Software entwickelt, um die Detektion der Zellen und die Messungen in den Kanälen mit 535 und 450 Nanometer zu automatisieren. Kerne und Cytosol der Zellen werden mithilfe des DR5-Kanals segmentiert.Dann ist der Algorithmus in der Lage, die positiven Zellpopulationen bei 450 Nanometer und 535 Nanometer zu detektieren und zu quantifizieren. Die berechneten mittleren Verhältnisse sind niedrig für den Mutantenstamm und hoch für den virulenten Stamm. Experimente können an verschiedenen menschlichen Zelltypen durchgeführt werden, wie beispielsweise Gila-Epithelzellen und THP-1-ähnliche Makrophagenzellen.Beide Zelltypen reagieren auf den virulenten Stamm M 90 T AFA one cha, indem sie das emittierte Signal während der Infektion von grün auf blau umschalten. Bei dem nicht-invasiven Stamm bleibt das grüne Signal bestehen. Die Quantifizierung erfolgt mithilfe eines in Metam-Software entwickelten Skripts und eines in Excel erstellten Makros, die Histogramme der Zelllyse in Abhängigkeit von der Zellverteil游戏副本Beispielsweise zeigt dieser Datensatz Mycobacterium bovis. BCG verbleibt während des gesamten Experiments im Phagosome, wie durch das anhaltende grüne Signal dargestellt. Im Gegensatz dazu verursacht Mycobacterium tuberculosis nach sieben Tagen Infektion eine Ruptur der vaga omal Membran in THP-1-Makrophagen, was durch das Auftreten eines Signals von 450 Nanometer nach sieben Tagen Infektion mit dem gleichen Algorithmus verdeutlicht wird.Bezüglich der Untersuchung der Vakuolenruptur durch Ella stellten wir fest, dass Zellen, die mit Mycobacterium tuberculosis infiziert sind, nach sieben Tagen Infektion höhere Verhältnisse von 450 zu 535 Nanometern aufweisen als solche, die mit Mycobacterium bovis BCG infiziert sind. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Vakuolenruptur durch Pathogene mit dem CCL4-Betalactamase-Assay untersucht. Sobald dieser Protokoll beherrscht ist, kann es innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden, doch denken Sie daran, dass Sie während des gesamten Protokolls Proben in jedem Puffer hinzufügen müssen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Elektronenmikroskopie oder der Membranfraktionierung, liegt darin, dass sie in Echtzeit durchgeführt werden kann, ohne dass biochemische Behandlungen erforderlich sind.Weitere Analysen wie die Aktin-Markierung oder der Gentamicin-Schutztest können durchgeführt werden, um die Aufnahme und die Proliferation der Bakterien in Wirtszellen zu bewerten.

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Dieses Video zeigt einen Assay zur Quantifizierung von zytosolischem und vakuolärem Salmonella typhimurium in aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen mittels differentieller Permeabilisierung. Die Makrophagen sind mit einer fluoreszierenden Protein-exprimierenden Salmonelle infiziert, die in einer spezialisierten Vakuolenstruktur namens Salmonellen-haltige Vakuole oder SCV internalisiert ist. Eine Untergruppe von Bakterien entkommt dem SCV und dringt in das Zytosol ein. Die cholesterinreiche...

Ein Assay zur Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonellen in infizierten primären Makrophagen

Vacuolar und cytosolischen pH-Wert kann in lebende Hefe gemessen werden...

Messung von pH Vacuolar und Cytosolic<em&gt; In Vivo</em&gt; In Hefe Zellsuspensionen

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Der Prozess der Heilung verletzten Zellen beinhaltet Handel spezifischer Proteine ​​und subzellulären Kompartimenten an der Stelle der Zellmembran Verletzung. Dieses Protokoll beschreibt Assays, um diese Prozesse zu überwachen.

Imaging Cell Membrane Verletzung und subzellulärer Prozesse in der Reparatur beteiligt

Wir beschreiben die Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium in Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen mittels differentieller Digitonin-Permeabilisierung.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Die AlPcS2a-vermittelte Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der raumzeitlichen Schädigung intrazellulärer Vesikel (IVs) in lebenden Zellen.

Ein photodynamischer Ansatz zur Untersuchung der Funktion der intrazellulären Vesikelruptur

Salmonellen dringen in intestinale Epithelzellen ein und replizieren sich sowohl in Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (Hyperreplikation). Hier wird ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll beschrieben, um die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen durch zwei komplementäre Bildanalysen durch ImageJ zu quantifizieren, um Einzelzellauflösung und Scoring zu erreichen.

Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Dieses Protokoll beschreibt ein Lebendzell-Bildgebungsverfahren zur Überwachung der lysosomalen Membranpermeabilisierung während der Nekroptose unter Verwendung von Fluoreszenzsonden, die Veränderungen der Integrität der lysosomalen Membran und der Versauerung nachweisen.

Lebendzell-Bildgebung der Permeabilisierung der lysosomalen Membran während der Nekroptose

Erfahren Sie, wie Sie vakuoläre Ruptur durch intrazelluläre Erreger wie Shigella flexneri und Mycobacterium tuberculosis in Einzelzellen verfolgen. Diese CCF4-basierte Methode ermöglicht Echtzeit-Analysen für Antibiotika-Screening.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

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