Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Dieses Experiment beobachtet die durch intrazelluläre Krankheitserreger in einzelnen Zellen ausgelöste VA-Ruptur. Beladen Sie die Zellen zunächst mit CCF 4:00 AM Farbstoff, der durch zelluläre Esterasen gespalten wird. Bereiten Sie dann die FL-Neurobakterien vor und legen sie auf den CCF: Vier beladene Zellen inkubieren die Zellen bei 37 Grad Celsius für die bakterielle Invasion der Wirtszellen.

Bestimmen Sie dann das Verhältnis der Intensitäten, die in den 450-Nanometer- und 535-Nanometer-Kanälen emittiert werden. Die Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Krankheitserregern im Zytosol Aufgrund seiner Anpassungsfähigkeit an Hochdurchsatzlys. Diese Technik erleichtert die Identifizierung neuartiger Antibiotika, indem sie ein Schlüsselproblem der subzellulären Lokalisierung von Bakterien während der Wechselwirkungen von Wirtserregern angeht.

Gemeinsam mit meinem Kollegen Tran Vanu waren wir daran interessiert, Ansätze zu entwickeln, um intrazelluläre Krankheitserreger mit hoher zeitlicher Auflösung zu betrachten. Dies führte zur Etablierung des CCF-Vier-Betalactamase-Assays für reguläre ulare Rupturen. Heute wird dieser Ansatz von zwei Doktorandinnen im Labor, Nora MellU und Charlotte Keller, experimentell vorgestellt. Inokulieren Sie die Wildtyp- und mutierten Bakterienstämme in acht Milliliter TCSB, die 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthalten, legen Sie die Kulturen in einen 37 Grad Celsius heißen Shaker und säen nun fünfmal 10 bis zur dritten Hela-Zellen pro Vertiefung aus.

In 100 Mikrolitern DMEM, die 10 % fötales Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin-Kultur enthalten, wachsen die Zellen in einem 5 %ige Kohlendioxid-Inkubator am nächsten Tag in einer Subkultur mit einer 100. Verdünnung in TCSB, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin, in einem Shaker bei 37 Grad Celsius für zweieinhalb Stunden. Bereiten Sie nun zum Laden der Hela-Zellen CCF 4:00 AM Farbstoff in em Puffer vor, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Fügen Sie dann 25 Mikroliter CCF 4:00 AM Loading Mix pro Vertiefung bei Raumtemperatur im Dunkeln für zwei Stunden und 30 Minuten hinzu, um die Bakterien auf die Infektion vorzubereiten, pelletieren Sie einen Milliliter Kultur durch Zentrifugation nach einer Wäsche mit 500 Mikrolitern PBS Resus, suspendieren Sie die Bakterien in 500 Mikrolitern PBS, ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Polyol-Lysin und 40 Mikrogramm pro Milliliter Beta-Lactamase.

Inkubieren Sie 10 Minuten lang auf einem rotierenden Rad bei Raumtemperatur, waschen Sie es einmal mit 500 Mikrolitern PBS und resuspendieren Sie jedes Bakterienpellet in 500 Mikrolitern eines Millimolaren Probenecid in EM-Puffer. Waschen Sie die Zellen einmal mit 150 Mikrolitern eines Millimolaren Probs in EM-Puffer. Als nächstes verdünnen Sie 10 Mikroliter Bakterien in 100 Mikrolitern einer millimolaren Sondierungslösung und verteilen Sie sie auf jede Vertiefung der Hela-Zellen. Nach 15 Minuten Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur die Platte für eine Stunde auf 37 Grad Celsius umstellen.

Einmal mit 150 Mikrolitern einer millimolaren Probit-Lösung waschen. Fixieren Sie dann die Proben mit 50 Mikrolitern 4%-Paraform-Aldehyd in einer millimolaren Pro-Lösung für 10 Minuten im Dunkeln. Nach einer Wäsche mit Probenecid-Lösung fügen Sie 30 Mikroliter des 10-mikromolaren Kernfarbstoffs Drac Five hinzu, um eine optimale Zellsegmentierung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang, waschen Sie sie einmal und fügen Sie 100 Mikroliter einer millimolaren Lösung hinzu, um Bilder mit einem inversen Epi-Fluoreszenzmikroskop aufzunehmen.

Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge bei 405 Nanometern. Detektieren Sie die Emission über 450-Nanometer- und 535-Nanometer-Filter mit Belichtungszeiten von fünf Millisekunden für das transmittierte Licht. 1000 Millisekunden für 535 Nanometer und 500 Millisekunden für 450 Nanometer.

Die Verwendung eines Fokuskalibrierungsgeräts, das mit der automatisierten Mikroskopie gekoppelt ist, ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von Dutzenden verschiedener Positionen in mehreren Wells. Wenn Sie ein konfokales Mikroskop verwenden, verwenden Sie Belichtungszeiten von 240 Millisekunden bei 450 Nanometern, 360 Millisekunden bei 535 Nanometern für den 405-Nanometer-Laser und 640 Millisekunden für den 640-Nanometer-Laser. Analysieren Sie die Daten mit einem Computeralgorithmus, der eine automatische Bewertung des Fluoreszenzsignals für jede einzelne Zelle ermöglicht.

Verwenden Sie beispielsweise Software wie metamorph und acapella, um ein Skript zum Messen des Verhältnisses zwischen den Emissionssignalen von 450 Nanometern und 535 Nanometern zu erstellen. Für diesen Assay wird eine HELOC-Kultur mit zwei mal 10 bis fünften Zellen in einem Endvolumen von zwei Millilitern gestartet. Bereiten Sie die Bakterien auf die Infektion vor und beladen Sie die Helazellen mit CCF 4:00 AM Ordnen Sie ein Konvo-Mikroskop mit einem N-Plan-Luftobjektiv in einer 37 Grad Celsius heißen Heizkammer an.

Stellen Sie den 405-Nanometer-Laser und die Emission über 450-Nanometer- und 535-Nanometer-Filter ein. Geben Sie auch Belichtungszeiten von fünf Millisekunden für Durchlicht ein. 200 Millisekunden für 535 Nanometer und 100 Millisekunden für 450 Nanometer.

Stellen Sie die Datenerfassung für alle 90 Sekunden über einen Zeitraum von 60 Minuten ein. Waschen Sie nun die Zellen einmal mit zwei Millilitern einer millimolaren Probenecid-Lösung. Fügen Sie zwei Milliliter eines millimolaren Probs in den em-Puffer hinzu.

Montieren Sie dann die Schüssel auf den Tisch des Mikroskops und starten Sie nach sechs Minuten die Erfassung. Legen Sie die Akquisition auf Eis. Geben Sie 250 Mikroliter Bakterienresuspension auf die Zellen und starten Sie die Erfassung für die Analyse nach der Aufnahme neu.

Visualisieren Sie Filme mit Velocity Metamorph oder Image J.Erhalten Sie Intensitätsverhältnisse von 450 bis 535 Nanometern für jede einzelne Zelle. Der CCF 4:00 AM Beta-Lactamase-Ansatz ist eine robuste und empfindliche Methode zur Verfolgung der ularen Ruptur von intrazellulären Krankheitserregern wie z.B. Gelflexneri nach HELOC-Zellinfektion. Mit dem nicht-invasiven BS 176 AFA one strain für eine Stunde bleibt die CCF-Sonde mit vier Bünden intakt und gibt ein grünes Signal ab.

Im Gegensatz dazu schaltet der virulente M 90 TFA I-Stamm das Signal in Richtung Blau, was mit der Sondenspaltung im Zytosol übereinstimmt, um das ratiometrische Signal zu bestimmen. Wir haben ein Skript für die Metamorph- und Acapella-Software entwickelt, um die Detektion der Zellen und Messungen in den 535- und 450-Nanometer-Kanälen zu automatisieren. Zellkerne und Zytosol werden mit Hilfe des DR-Fünfkanals segmentiert.

Dann ist der Algorithmus in der Lage, die 450 Nanometer und die 535 Nanometer positiven Zellpopulationen zu erkennen und zu quantifizieren. Die berechneten Mittelwerte sind für den mutierten Stamm niedrig und für den virulenten Stamm hoch. Experimente können an verschiedenen menschlichen Zelltypen wie Gila-Epithelzellen und THP-1-Makrophagen-ähnlichen Zellen durchgeführt werden.

Beide Zelltypen reagieren auf den virulenten M 90 T AFA Ein-Cha-Stamm, indem sie das emittierte Signal während der Infektion von grün auf blau umschalten. Bei dem nicht-invasiven Stamm bleibt das grüne Signal bei der Quantifizierung unter Verwendung eines Skripts, das auf der Metamorph-Software entwickelt wurde, und ein in Excel entwickeltes Makro stellt Histogramme der ularen Ruptur als Funktion der Zellverteilung dar. Die Methode kann erfolgreich angepasst werden, um die Infektiosität verschiedener Bakterien zu verstehen.

Dieser Datensatz zeigt zum Beispiel Mycobacterium Bovis. BCG befindet sich während des gesamten Verlaufs des Experiments im Phagosom, wie das persistente grüne Signal zeigt. Im Gegensatz dazu löst Mycobacterium tuberculosis bei THP-1-Makrophagen nach sieben Tagen der Infektion einen Vaga-Omal-Membranriss aus, wie die Erscheinung eines 450-Nanometer-Signals nach sieben Tagen der Infektion mit demselben Algorithmus zeigt.

Bei der Untersuchung der Valarruptur durch Ella fanden wir heraus, dass mit Mycobacterium tuberculosis infizierte Zellen nach sieben Tagen der Infektion ein höheres Verhältnis von 450 bis 535 Nanometern aufweisen als Mycobacterium bovis BCG. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die ulare Ruptur durch Krankheitserreger mit dem CCL-Vier-Betalactamase-Assay untersuchen können. Einmal gemeistert, kann dieses Protokoll in vier Stunden durchgeführt werden, aber denken Sie daran, dass Sie während des gesamten Protokolls in jedem Puffer Prozesse hinzufügen müssen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Elektronenmikroskopie oder Membranfraktionierung besteht darin, dass sie in Echtzeit ohne biochemische Behandlungen durchgeführt werden kann.

Weitere Analysen wie Aktinmarkierung oder Gentamicin-Schutz-Assay können durchgeführt werden, um die Aufnahme und Proliferation der Bakterien in den Wirtszellen zu bewerten.