Name: Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Biegesteifigkeit von Mikrotubuli mit einem Kinesin-getriebenen Gliding Assay messen. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung der Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli für Studien zur Zytoskelettmechanik.

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Wir danken Melissa Klocke für die Unterstützung der Vorbereitung Abbildung 1 und Anna Ratliff für den Nachweis des Protokolls. Diese Arbeit wurde von der Research Corporation for Science Advancement unterstützt.

Ein. Mikrotubuli Gliding Assay Stammlösungen Bereiten Sie vor der gleitenden Assay. <ol><li> Polymerisieren 0,5 mg Mikrotubuli spärlich mit hellen organischen Fluorophor 22 markiert. Die Zielmarke Konzentration 1 Fluorophors pro Mikrometer Mikrotubuli, oder eine Kennzeichnung Dichte von ungefähr 1 pro 1500 Fluorophor Tubulindimere. Lagerung bei Raumtemperatur, Licht mit Aluminium, Folie für bis zu zwei Wochen geschützt. </li><li> Entschlacken Biotin-Kinesin 21 bei etwa 1 uM. Lagerung bei -80 ° C in 5 ul Aliquots für den Einsatz in einzelnen Experimenten. </li><li> Bereiten Sie die Assaypuffer (AB) von 50 mM imidiazole, 50 mM Kaliumchlorid (KCl), 4 mM Magnesiumchlorid (MgCl 2), 2 mM Ethylenglykol tetraessigsäure (EGTA), pH 6,7. Sterile Filter und bei 4 ° C. </li><li> Aufzulösen biotinylierten Rinderserumalbumin (Biotin-BSA) und 2 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter.Lagerung bei -80 ° C in 100 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu einem Monat. </li><li> Aufzulösen Streptavidin (SA) zu 10 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 20 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu zwei Wochen. </li><li> Aufzulösen α-Casein bis 5 mg / ml in AB. Filter mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 100 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu zwei Wochen. </li><li> Aufzulösen Dithiothreitol (DTT) in entionisiertem Wasser bei 200 mM. Lagerung bei -20 ° C in 100 ul Aliquots innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen verwenden. Kann wieder eingefroren werden. </li><li> Aufzulösen Paclitaxel (PT) in HPLC-Qualität Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 4 mM. Shop in 10 ul Aliquots bei -80 ° C langfristig -20 ° C kurzfristig. Verwenden Sie innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen. Kann wieder eingefroren werden. </li><li> Aufzulösen Glucose in deionisiertem Wasser bei 120 mg / ml. Shop in 100 ul Aliquots bei -20 ° C. Kann wieder eingefroren werden. </li><li> Dislösen Adenosintriphosphat (ATP) in entionisiertem Wasser auf 150 mM, pH 7,0. Shop in 5 ul Aliquots bei -80 ° C innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftauen verwenden. </li><li> Bereiten 100x sauerstoffabfangende Lager 25 durch Lösen 10.000 Einheiten Glucoseoxidase und 156.000 Einheiten Katalase in 600 ul Gesamtvolumen Assay-Puffer. Zentrifuge kurz in einer Mikrozentrifuge zu pelletieren Feststoffe, Filter Überstand mit 0,2 um Spritzenfilter. Lagerung bei -80 ° C in 10 ul Aliquots für längere Zeit bei 4 ° C bis zu einer Woche. </li></ol> 2. Mikrotubuli Gliding Assay, Same Day Herstellung der Lösung Bereiten der Lösungen in 2,1 bis 2,6 am Tag des Experiments. Mit etwas Übung können Lösungen 2,2-2,6 während Durchflusszelle Waschen vorbereitet werden. Sofern nicht anders angegeben, halten Stammlösungen auf Eis. <ol><li> Bereiten AB, 1 ml Assay-Puffer mit 10 ul DTT Lager (AB mit 2 mM DTT). Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten bio-BSA-Puffer, 40 &amp; mu; L einer 1:1-Mischung aus dem Biotin-BSA Lager und AB. Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Planen BSA-Puffer, 645 ul Mischen AB mit 5,5 ul BSA (1 mg / ml BSA in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten SA-Puffer, Mischen 57 ul der AB mit 3 ul Streptavidin Lager (0,5 mg / ml Streptavidin in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten α-Casein-Puffer, Mischen von 200 ul der BSA-Puffer, 50 ul Casein Lager, und 0,8 ul 15 uM ATP (1 mg / ml α-Casein, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Halten Sie bei Raumtemperatur. </li><li> Bereiten Fluoreszenz anti-bleach-Puffer, Mischen von 95 ul α-Casein-Puffer, 2,5 ul Glucose-Lager, 1 ul 100x sauerstoffabfangende mix, 1 ul Paclitaxel Lager, 1 ul 2-Mercaptoethanol (βME). Fügen βME unter Abzug vornehmen. Verwenden Fluoreszenz anti-bleach Puffer innerhalb 1 Stunde der Vorbereitung. ACHTUNG: βME ist hochgiftig und riecht schrecklich. Achten Sie darauf, nur unter dem Abzug zu öffnen. Shop Flasche imAbwesenheit von Licht; Licht verschlechtert βME und seine Fähigkeit, Photobleichen reduzieren. </li></ol> 3. Mikrotubuli Gliding Assay <ol><li> Konstrukt etwa vier Fahrspuren Strömung zwischen einem 24 x 60 mm Deckglas und 22 x 22 mm Deckglas mit Vakuumfett, extrudiert aus einer Spritze durch eine Pipettenspitze, als Abstandshalter. Jede Flow lane sollte etwa 10 ul Volumen (Skala nachfolgenden Volumina entsprechend) sein. </li><li> Waschen 10 ul Bio-BSA-Puffer in jede Spur. Inkubieren 5 min zu ermöglichen BSA zur Beschichtung der Glasflächen. </li><li> Waschen Sie jede Spur dreimal mit 15 ul BSA-Puffer zu entfernen freiem Biotin-BSA, während sie weiterhin die Gleitfläche zu blockieren. Verwenden Sie einen Kimwipe oder Filterpapier, um Buffer von der gegenüberliegenden Seite des Flusses Kammer zu entfernen, wobei Sie nicht zu erlauben, Luftblasen durch die Flusskammer gehen. </li><li> Waschen 15 ul SA-Puffer in jede Spur. 10 min warten, oder bis zu 2 Stunden. Das Streptavidin an die Oberfläche gebundene Biotin-BSA zu binden. </li><li> Waschen Sie jede Spur dreimal mit 15 ul BSA-Puffer auf freie SA zu entfernen, während weiterhin die Gleitfläche zu blockieren. </li><li> Waschen Sie jede Spur mit 15 ul α-Casein-Puffer. α-Casein hilft weiter blockieren, nicht-spezifische Bindung von Kinesin und Mikrotubuli auf das Glas. </li><li> Verdünnen Kinesin bis 10 nM in α-Casein-Puffer waschen und jede Gasse mit 15 ul dieser Kinesin - α-Casein-Lösung. Warte 15 min (oder bis zu einer Stunde) für das biotinylierte Kinesin spezifisch an der Oberfläche gebundenen Streptavidin. Die Kinesin-Motor-Domänen bleibt frei zu binden Mikrotubuli. </li><li> Verdünnen Paclitaxel bis 40 uM in Raumtemperatur α-Casein-Puffer, und waschen Sie jede Spur mit 15 ul dieser Lösung zu waschen freien Kinesin und vorab geladen jede Strömungskammer mit einer Paclitaxel-Lösung Mikrotubuli aus Depolymerisation zu verhindern. Kalte auch depolymerisiert Mikrotubuli, so stellen Sie sicher, dass diese Schritte erfolgen bei Raumtemperatur mit Raum-temperaturre Lösungen. </li><li> Fluoreszenzmarkierten verdünnten Mikrotubuli 1:100-1:1,000 der Fluoreszenz anti-bleach-Puffer mit 1 mM ATP. Waschen 15 ul in einer Fahrspur und beobachten innerhalb von 30 min. </li></ol> 4. Data Collection <ol><li> Beachten Sie die Mikrotubuli Gleiten mittels Fluoreszenzmikroskopie, ein Mikroskop auflösen können einzelne Fluorophore wie einer gewerblichen oder home-build TIRF Setup 26 (Abbildung 2) erforderlich. Die Mikrotubuli sollte durch die Kinesin-Motoren über das Substrat werden bei etwa 0,5 &amp;mgr; m / s angetrieben, je nach Temperatur. Wenn das Feld-of-view des Mikroskops 50 um, sollten die einzelnen Mikrotubuli sichtbar sein für ca. 100 sek. Set Beleuchtungsstärke, so dass einzelne Fluorophore nicht schneller als 100 sec Photobleichmittels tun. Bei der Verwendung von Laser-Anregung, ist eine Leistungseinstellung von etwa 3-5 mW angemessen. </li><li> Collect Bildfolgen zur Analyse. 600 Bilder auf5 Hz (2 min gesamt) gut funktioniert. Verwenden Sequenzen lange genug, dass Mikrotubuli das gesamte Feld-of-view zu durchqueren. </li></ol> 5. Data Analysis Ein IDL-Routine, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , ist beigefügt. Diese Routine gibt eine Persistenzlänge Wert auf allen Mikrotubuli Gleiten in einem gegebenen Bild Sequenz. Entweder laufen diese Routine auf jeder Bildsequenz, Modifizieren Intensität Parameter je nach Ihren speziellen Mikroskop-Setup, oder führen Sie die folgenden Schritte aus: <ol><li> Verfolgen Sie jedes Fluorophor an einem Mikrotubulus zu Fluorophor Trajektorien erstellen. </li><li> Vereinen alle Trajektorien von Fluorophoren auf einer gegebenen Mikrotubuli in ein Gesamtsystem Mikrotubulus Trajektorie; Wiederholung für jede Mikrotubuli in der Bildsequenz (Abbildung 3). </li><li> Berechnen den Tangentenwinkel an jedem Punkt entlang der Trajektorie (Abbildung 4)Und berechnen &lt;cos θ s&gt; in Gl. Ein durch Mittelung des Kosinus des Winkels Differenz für jedes Paar von Punkten durch eine Weglänge getrennt s (Abbildung 5). Finden Sie die Persistenzlänge für eine einzelne Mikrotubuli oder eine Gruppe von Mikrotubuli durch den Einbau &lt;cos θ s&gt; Gl. 1, Gewichten der einzelnen Datenpunkte in der Passung der Anzahl von unabhängigen Werten von cos θ s, mit dem der durchschnittliche berechnen sind. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Persistenzlänge Messungen sind eine gute Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften der einzelnen Biopolymeren. In diesem Artikel, haben wir ein Verfahren zur Messung der Persistenzlänge Mikrotubuli beschrieben. Wie in der Einleitung erwähnt, wird dieses Verfahren ohne weiteres zu prüfen Mikrotubulus mechanischen Eigenschaften in einer Vielzahl von Bedingungen durch einfaches Variieren der Reagenzien, die Temperatur oder Viskosität im letzten Schritt der gleitenden Assay, 3.9, oder durch Polymerisation von Mikrotu...

Das Zytoskelett, einem Netzwerk von Biopolymeren in den meisten eukaryotischen Zellen gefunden wird, spielt eine Rolle in der zellulären Organisation, den intrazellulären Transport und Zellmechanik. Die mechanischen Eigenschaften der Biopolymere des Cytoskeletts (primär Aktin und Mikrotubuli) spielen eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften der Zelle als Ganzes 12. Da Ganzzell Mechanik charakterisieren gesunden und kranken Zellen 13,14 und wird in zellulären Motilität 15 beteiligt sind, haben sich die mechanischen Eigenschaften der zugrundeliegenden Zytoskelett-Komponenten ein aktiver Bereich der Studie in den vergangenen zwei Jahrzehnten ein. Die Flexibilität (oder Steifigkeit) von Biopolymeren erhält Persistenzlänge kann die Länge des Polymers, welche Biegungen um etwa ein Bogenmaß unter thermischer Schwankungen bei Umgebungstemperatur ist. Eine Anzahl von Techniken entwickelt worden, um Persistenzlänge 16, zum Beispi messenle aktiven Techniken, die das Biegen des Polymers mit hydrodynamischen Fluss, optische Fallen, oder elektrische Felder 4,17,18 und passive Techniken, die die Schwankungen der freien Polymeren in Lösung 5,6 messen zu beteiligen. Die aktive Messungen erfordern jedoch spezielle Setups bekannten Kräfte im Mikrometerbereich zu implementieren und die freien Fluktuationsmessungen kann schwierig sein, durch Diffusion aus der Fokusebene des Mikroskops verwendet. In diesem Artikel beschreiben wir einen komplementären, passiv, Technik, um die Persistenz Länge der Mikrotubuli, ein Zytoskelett Polymers zu messen. Die Technik umfasst Gleiten Assays, was bedeutet, dass das Polymer bleibt immer in der Brennebene 19 sicherzustellen. Darüber hinaus ist es Tracking einzelnen Fluorophore dauerhaft mit dem Polymer von Interesse gebunden sind, so dass spezifische Stellen entlang der Polymer gut charakterisiert sind. Eine Karikatur des Verfahrens ist in Figur gezeigt,e 1. Kinesin bewegt speziell auf die + Ende der Mikrotubuli, so dass die Mikrotubuli in einem gleitenden Assays sind unidirektional angetrieben. Das führende Ende des Filaments, jenseits der letzten Kinesin befestigt, frei unter den thermischen Kräften der umgebenden Lösung schwanken. Da die Mikrotubuli vorn angetrieben wird, schwankt das Ende, bis die Bindung an eine neue Kinesin-Molekül weiter entlang der Glasträger friert in einem bestimmten Fluktuation. Weil Kinesin misst Mikrotubuli sehr stark, wird der Mikrotubulus gezwungen, den Weg des vorderen Endes folgen. Daher sind die statistischen Schwankungen in den Mikrotubuli Trajektorie eingefroren dieselben wie die statistischen Schwankungen des freien Endes der Mikrotubuli 11, und können daher verwendet werden, um die Persistenzlänge nach Anspruch 20 zu berechnen <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; wobei l p die Persistenzlänge des Mikrotubuli ist, θ ist der Winkel zwischen Tangenten an die Bahn durch eine Konturlänge s getrennt sind, und &lt;&gt; bedeutet einen Durchschnitt über alle Paare von Positionen durch eine Konturlänge s getrennt. Das Gleiten Assay selbst verwendet Kinesin biotinyliert am Coiled-Coil 21 spezifisch an den Glasobjektträger über eine Streptavidin-Biotin-Verknüpfung gebunden ist. Diese Befestigung gewährleistet, dass die Motor-Domänen frei, zu binden und zu treiben Mikrotubuli sind. Um Mikrotubuli Trajektorien folgen, werden Mikrotubuli spärlich mit organischen Farbstoffen 22,23 beschriftet - die Etiketten müssen spärlich genug, dass einzelne Fluorophore auflösbar sind mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie. Einzelne Fluorophore verfolgt werden mittels Bildanalyse-Routinen in IDL geschrieben. Die Trajektorien der einzelnen Fluorophor zu einem bestimmten mic gebundenrotubule werden in ein zusammengesetztes Mikrotubulus Trajektorie automatisch 24 kombiniert. Die Tangentenwinkel θ zu jedem Punkt entlang einer Trajektorie berechnet werden; dieser Tangentenwinkel die &lt;cos s&gt; Wert wird für jede Kontur Länge s berechnet. Schließlich werden diese Daten an Gl passen. Ein um eine Persistenzlänge bei gegebener Mikrotubuli zu extrahieren, oder für viele Mikrotubuli in der gleichen Gleiteigenschaften Assay. Das Verfahren ist robust genug, um mit Mikrotubuli in einer großen Vielzahl von Bedingungen (mit verschiedenen Stabilisierungsmitteln oder andere kleine Moleküle, verbunden mit den Mikrotubuli, mit gebundenen Mikrotubulus-assoziierte Proteine ​​(MAPs), oder mit einer Vielzahl von viskosen Lösungen) hergestellt arbeiten. Im Test wurde die Technik verwendet worden, um die Persistenzlänge Mikrotubuli als Funktion der Länge entlang der Mikrotubuli und Mikrotubuli mit verschiedenen Stabilisierungsmitteln charakterisieren. Die wichtigste Einschränkung ist, dass die Mikrotubuli muss noch support Kinesin Motilität. Da Kinesin ist ein robuster Motor Enzym, ist dies eine ziemlich lockere Einschränkung. Mikrotubuli durch Ersetzen mit Aktin und Myosin-Kinesin mit einer Familie Enzym kann die Persistenzlänge Actin unter Verwendung der gleichen Technik werden.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reagenzien</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kaliumchlorid</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Magnesiumchlorid</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinylierten BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-Casein</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidin</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dithiothreitol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratories</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose-Oxidase</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Katalase</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-Mercaptoethanol</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Kaufen kleinen Betrag.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm Nr. 1 1/2 Deckglas</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22x22 mm Nr. 1 Deckglas</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hochvakuumfett</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Ausrüstung</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF-Mikroskop</td&gt;<td&gt; Viele</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Die TIRF-Mikroskop in diesem Verfahren eingesetzt war hausgemacht.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (Software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Könnte ersetzen MATLAB, ImageJ oder andere Software zur Bildanalyse.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

biegesteifigkeit maße von biopolymeren mit gliding assays

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Mikrotubuli sind Zytoskelett Polymere, die eine Rolle bei der Zellteilung, Mechanik und intrazellulären Transport. Jede dieser Funktionen erfordert Mikrotubuli, die steif und gerade genug, um eine signifikante Fraktion des Zelldurchmessers überspannen sind. Als Ergebnis hat die Persistenzlänge Mikrotubuli, ein Maß der Steifigkeit, aktiv in den vergangenen zwei Jahrzehnten 1 untersucht. Dennoch bleiben Fragen offen: kurze Mikrotubuli sind 10-50 mal weniger steif als lange Mikrotubuli 2-4, und noch lange Mikrotubuli Persistenz Längen, die von einer Größenordnung 5-9 unterschiedlich gemessen. Hier präsentieren wir eine Methode, um Mikrotubuli Persistenz Länge zu messen. Das Verfahren basiert auf einem Kinesin angetriebenen Gleitflug Mikrotubulus Assay 10 basiert. Durch die Kombination von spärlichen Fluoreszenzmarkierung einzelner Mikrotubuli mit single particle tracking einzelner Fluorophore an der Mikrotubuli, die gliding Trajektorien einzelner Mikrotubuli sind mit Nanometer-Ebene Präzision verfolgt. Die Persistenzlänge der Trajektorien ist die gleiche wie die Persistenzlänge des Mikrotubulus unter den verwendeten Bedingungen 11. Ein automatisiertes Tracking Routine wird verwendet, um Mikrotubuli Trajektorien aus Fluorophoren an einzelnen Mikrotubuli zu erstellen, und die Persistenzlänge dieser Trajektorie wird anhand Routinen in IDL geschrieben. Diese Technik ist rasch umsetzbar, und eine Messung des Persistenzlänge von 100 Mikrotubuli in einem Tag des Experimentierens. Das Verfahren kann erweitert werden, um Persistenzlänge unter einer Vielzahl von Bedingungen, einschließlich Persistenzlänge als Funktion der Länge entlang von Mikrotubuli zu messen. Darüber hinaus können die Auswerteroutinen zur Myosin-basierten Assays wirkenden Gleiten verlängert werden, um die Persistenzlänge Aktinfilamente sowie messen.

Ein Schnappschuss von einem Gleiten Test wird in Abbildung 2 dargestellt. Eine gute Mikrotubulus Dichte beträgt 1-10 Mikrotubuli je Sichtfeld; wesentlich in Falschabtastungen führen, wie Mikrotubuli einander kreuzen. Ein Plot der 11 Mikrotubulus Trajektorien aus den Segelflugplatz Assay in 2 ist in 3 gezeigt. Typische Trajektorien sind 10 bis 30 &amp;mgr; m lang, einige Bahnen haben Lücken, wo ein Mikrotubuli überquert anderen. Diese Trajektorien kann von der Analyse ve...

Ein Verfahren, um die Persistenzlänge oder Biegesteifigkeit von Biopolymeren messen beschrieben. Das Verfahren verwendet eine Kinesin-Mikrotubulus angetriebenen Gleitflug Assay experimentell die Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli und ist anpassbar an Aktin-basierten Assays Gleiteigenschaften.

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mit einem Gleitassay die UAL-Steifigkeit von Mikrotubuli zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Motorprotein Kinesin spezifisch an einen Objektträger gebunden wird, dessen Motordomänen frei sind, um Mikrotubuli zu binden. Der zweite Schritt besteht darin, der Probe fluoreszenzmarkierte Mikrotubuli hinzuzufügen, die durch das Kinesin translatiert werden.Die nächsten Videos von gleitenden Mikrotubuli werden mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen. Der letzte Schritt ist die Analyse der Gleit-Assay-Videos, um die Biegesteifigkeit der Mikrotubuli zu berechnen. Letztendlich werden die Gleitassays verwendet, um die Biegesteifigkeit einzelner Mikrotubuli zu bestimmen.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Zytoskelettmechanik zu beantworten, wie z.B. die Biegesteifigkeit einzelner Polymere des Zytoskeletts. Dieses Verfahren wird von Anna Ratliff, einer Studentin aus meinem Labor, demonstriert. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie den Arbeits-Assay-Puffer vor, indem Sie 10 Mikroliter 200 Millimol DIO, drei Atol oder DTT zu einem Milliliter der Stamm-Assay-Pufferlösung hinzufügen und mischen.Bewahren Sie diese und alle anderen Arbeitslösungen während des Eingriffs bei Raumtemperatur auf. Als nächstes bereiten Sie unter Verwendung des Arbeitsassay-Puffers 40 Mikroliter Biotin BSA-Puffer her, indem Sie steril filtriertes biotinyliertes Rinderserumalbumin in einer Menge von zwei Milligramm pro Milliliter mit dem Arbeitsassay-Puffer in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis kombinieren und die Lösung mischen. Bereiten Sie dann den BSA-Puffer vor, indem Sie 645 Mikroliter Assay-Puffer mit 5,5 Mikrolitern 117 Milligramm pro Milliliter BSA kombinieren und die Lösung mischen.Bereiten Sie den Tritinpuffer auch vor, indem Sie 57 Mikroliter Assay-Puffer mit drei Mikrolitern steril filtriertem Streptokokken-Din bei 10 Milligramm pro Milliliter im Assay-Puffer mischen. Als nächstes konstruieren Sie die Fließbahnen auf einem 24 x 60 Millimeter großen Deckglas, extrudieren Sie fünf dünne Linien Vakuumfett aus einer 10-Milliliter-Spritze. Mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze zur Regulierung des Durchflusses sollten die Leitungen etwa vier Millimeter voneinander entfernt sein.Legen Sie einen 22 x 22 Millimeter großen Deckschirm auf das Vakuumfett und drücken Sie ihn leicht nach unten, um die Kanäle zu formen. Bei einem Volumen von ca. 10 Mikrolitern sollten sich die Vakuumfettleitungen auf etwa die doppelte Breite ausbreiten. Der nächste Schritt besteht darin, die Bahnen mit biotinyliertem Rinderserumalbumin vorzupolieren, indem 10 Mikroliter des bioTE BSA-Puffers mit Kapillarkraft in jede Fließbahn pipettiert werden, um den Puffer einzuziehen und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren.Spülen Sie dann jede Bahn dreimal, indem Sie 15 Mikroliter des BSA-Puffers in eine Seite jeder Spur injizieren, während Sie die Lösung auf der anderen Seite mit einem Kim-Tuch oder Filterpapier herausziehen. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Fahrbahnen gelangen. Im nächsten Durchgang werden 15 Mikroliter Streptavidin in jede Spur gegeben und bis zu zwei Stunden mit einem Minimum von 10 Minuten inkubiert.Während der Inkubation wird das Alpha-KC in Puffer hergestellt, indem 200 Mikroliter BSA-Puffer, 50 Mikroliter steril filtriertes Alpha-KC mit fünf Milligramm pro Milliliter im Assay-Puffer und 0,8 Mikroliter mit 15 Mikromolar a TP bei pH 7 gemischt werden. Bereiten Sie auch die Kinesinlösung vor, indem Sie den alpha-KCM-Puffer in ein neues Röhrchen pipettieren und das Biotin-Kinesin zu 10 Nanomolaren hinzufügen und dann nach der Inkubation mit dem Streptavidin-Puffer mischen. Spülen Sie jede Bahn dreimal mit 15 Mikrolitern BSA-Puffer.Spülen Sie dann jede Bahn mit 15 Mikrolitern Alpha-kcn-Puffer, um die unspezifische Bindung von Kinesin und Mikrotubuli an das Glas zu reduzieren. Als nächstes fügen Sie 15 Mikroliter Kinesinlösung zu jeder Bahn hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bis eine Stunde lang. Während dieser Zeit geht das Biotin-Kinesin eine starke Bindung mit dem oberflächengebundenen Streptavidin ein und ermöglicht es, die motorischen Domänen des Kinesins für die Bindung von Mikrotubuli zugänglich zu machen.In der Zwischenzeit eine Lösung aus 40 mikromolaren Paclitaxel und alpha KC und Puffer herstellen. Das Paclitaxel ist wichtig, um die Depolymerisation von Mikrotubuli zu verhindern. Bereiten Sie in einem Abzug den Fluoreszenz-Antibleichpuffer vor, indem Sie 95 Mikroliter Alpha-KCM-Puffer, 2,5 Mikroliter Glukosefond und einen Mikroliter 100-fache Sauerstoffabscheidung mischen.Mischen Sie einen Mikroliter Paclitaxel und DMSO mit vier Millimolaren. Und schließlich ein Mikroliter Beta-Me-Capto-Ethanol. Spülen Sie nach der Inkubation das freie Biotin-Kinesin ab, indem Sie jede Bahn mit 15 Mikrolitern Raumtemperatur waschen.Paclitaxel in alpha-Kian-Lösung unter Verwendung von kaltem Puffer kann Mikrotubuli depolymerisieren. Zum Schluss spritzen Sie den Fluoreszenz-Anti-Bleichpuffer in ein neues Röhrchen und fügen Sie die fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli in einer Verdünnung von eins bis 100 bis eins bis 1000 hinzu. Fügen Sie dann ein Millimolar und ein TP hinzu und mischen Sie.Injizieren Sie 15 Mikroliter der Mikrotubuli-Lösung in eine Bahn und beobachten Sie innerhalb von 30 Minuten mit Fluoreszenzmikroskopie. Der kritischste Aspekt dieses Verfahrens ist eine optimale Konzentration der Mikrotubuli, um sicherzustellen, dass sie sich nicht überlappen und einen geringen Hintergrund haben. Die verbleibenden Lanes werden verwendet, um die Konzentration der Mikrotubuli zu optimieren, und wir verwenden das Mikroskop selbst, um sie auszurichten und zu fokussieren.Die Bildgebung von gleitenden Mikrotubuli erfolgt mit einem selbstgebauten Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop. Ein Objektiv mit 100 x hoher numerischer Apertur zeigt ein Feld von etwa 50 Mikrometern x 50 Mikrometern an, was ausreichend Platz ist, um Bewegungen für etwa 100 Sekunden mit einer eingestellten Rate von 0,5 Mikrometern pro Sekunde zu betrachten. Der Laser wird zur Anregung auf eine Leistungseinstellung von drei bis fünf Milliwatt verwendet.Diese Leistung ist niedrig genug, um ein Photobleichen des Viererbodens schneller als 100 Sekunden zu verhindern und so eine angemessene Bildgebungszeit zu ermöglichen. Erfassen Sie mit einer Bilderfassungssoftware zwei Minuten lang Bildsequenzen mit fünf Bildern pro Sekunde. Die Sequenzen sollten lang genug sein, damit die Mikrotubuli das gesamte Sichtfeld durchqueren können.Analysieren Sie die Bilddaten mit einer IDL-Routine wie der Datei, holen Sie sich LP Pro, die aus dem Zusatzmaterial bezogen werden kann. Diese DL-Routine gibt einen Wert für die Persistenzlänge zurück, der auf allen gleitenden Mikrotubuli in einer bestimmten Bildsequenz basiert. Ändern Sie die Intensitätsparameter je nach Fluoro-Vier-Intensität und Mikroskop-Setup.Hier ist ein Gleitassay zu sehen, der mit Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurde. Die Fluor-Vieren sind spärlich verziert entlang der Länge der Mikrotubuli. Die soeben gezeigten einzelnen Fluor-Vier-Trajektorien werden zusammengeführt, wobei durchschnittlich 10 Fluor-Vieren zu einem einzigen Punkt pro 100 Nanometer kombiniert werden, um die Datenanalyse zu verbessern.Wenn man sich einen einzelnen Mikrotubuli ansieht, kann der Tangentenwinkel zwischen den einzelnen Punkten leicht berechnet und als Funktion der Länge kartiert werden. Mit Hilfe von Tangentenwinkeln kann die Persistenzlänge berechnet und die durchschnittliche Cosign-pro-Segmentlänge mit der hier gezeigten Gleichung aufgetragen werden. Eine Best-Fit-Linie kann bestimmt werden: Einmal gemeistert.Mit dieser Technik kann die Biegesteifigkeit von mehreren Dutzend Mikrotubuli in drei oder vier Stunden gemessen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

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In diesem Video zeigen wir die experimentelle Techniken verwendet, um konform, extrazellulären Matrix (ECM) beschichtete Substrate für Zellkulturen herzustellen, und die durchaus in Zugkraft Mikroskopie und Beobachten Auswirkungen der ECM Steifigkeit auf das Verhalten der Zelle.

Vorbereitung der Beschwerde Matrizen zur Quantifizierung von Cellular Kontraktion

Die Haltbarkeit von Polymeren und faserverstärkten Polymerverbundwerkstoffen im Betrieb ist ein kritischer Aspekt für ihre Konstruktion und zustandsorientierte Wartung. Wir präsentieren eine neuartige, kostengünstige Labortestplattform zur Untersuchung des Einflusses gleichzeitiger mechanischer und umweltbedingter Belastungen, die dazu beitragen kann, effizientere und dennoch sicherere Verbundstrukturen zu entwerfen.

Eine Testplattform in Haltbarkeit Studien von Polymeren und faserverstärkten Polymerverbundwerkstoffe unter Concurrent Hygrothermogeber mechanischen Stimuli

Hier wird eine Methode beschrieben, die eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multiwell-Plattenformat ermöglicht. Die Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann von jedem Forschungslabor leicht übernommen werden. Es wäre besonders nützlich in der Forschung, die sich auf das Verständnis steifigkeitsabhängiger Zellreaktionen konzentriert.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Eine neuartige Methode wird vorgestellt zu synthetisieren und Programmhauptkette flüssigkristallinen Elastomeren unter Verwendung von im Handel erhältlichen Ausgangs Monomeren. Eine Vielzahl von thermomechanischen Eigenschaften wurde durch Einstellen der Menge an Vernetzer zugeschnitten, während die Betätigungsfunktion war abhängig von der Menge der aufgebrachten Belastung während des Programmierens.

Synthese von Programmierbare Hauptkettenflüssigkristalline Elastomere unter Verwendung eines Zwei-Stufen-Thiol-Acrylat-Reaktions

Semiflexiblen Polymere zeigen einzigartige mechanische Eigenschaften, die ausgiebig von Lebewesen angewendet werden. Systematische Studien über Biopolymere sind jedoch beschränkt, da Eigenschaften wie Polymer Steifigkeit nicht zugänglich sind. Dieses Manuskript wird beschrieben, wie diese Einschränkung durch programmierbare DNA-Nanoröhren, experimentelle Studien über die Auswirkungen der Glühfaden Steifigkeit ermöglicht umgangen wird.

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die Durchführung von drei-Punkt-Biegeversuche auf Sub-Millimeter Skala Fasern mit einer speziell angefertigten mechanische Prüfeinrichtung. Das Gerät kann Kräfte von 20 µN bis zu 10 N bis hin zu messen und kann daher eine Vielzahl von Faser Größen unterbringen.

Ein Millimeter Skala Biege-Prüfsystem zur Messung der mechanischen Eigenschaften von marinen Schwamm Knochensplitter

Substrate mit Steifheit im Bereich Kilopascal sind nützlich, um die Reaktion der Zellen auf physiologisch relevanten Mikroumgebung Steifigkeit zu studieren. Verwenden nur ein Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop, kann des Elastizitätsmoduls weichen Silikon-Gel mit einer Einbuchtung mit einer geeigneten Kugel bestimmt werden.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Eine neue Kraft-Clamp Rheometrie-Technik wird verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von geringem Volumen Protein-basierten Hydrogel Proben zwischen ein Voice-Coil-Motor und einen Kraftsensor angebunden zu untersuchen. Ein analoges Proportional-Integral-Derivat (PID) System ermöglicht das Spannen der Kraft erfahren, um das gewünschte Protokoll.

Kraft-Clamp Rheometrie zur Charakterisierung von Protein-basierten Hydrogele

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Entwicklung von kundenspezifischen Assays auf der ViBE Plattform für empfindlichere, reproduzierbare, automatisierte Ergebnisse in komplexen Matrices beschrieben ist. Die Universal-Kassette ermöglicht Assays zu leicht für die Verwendung mit benutzerdefinierten Tests angepasst werden. Diese Vielseitigkeit ermöglicht die schnelle Entwicklung und Validierung neuer Tests oder automatisierte Versionen bestehender manueller Tests, in diesem Video veranschaulicht.

Entwickeln von benutzerdefinierten Chinesischen Hamsters-Wirtszellprotein Assays mit Akustikvlies Mikropartikeltechnologie

Erfahren Sie, wie Sie die Biegesteifigkeit von Mikrotubuli mit einem Kinesin-getriebenen Gliding Assay messen. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung der Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli für Studien zur Zytoskelettmechanik.

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

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