Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, bestimmte Untergruppen von Neuronen im Hinterhirn des Kükens zu markieren und ihre axonalen Bahnen und Ziele zu verfolgen. Dies wird erreicht, indem man zuerst ein kleines ovales Fenster in der Mitte eines embryonalen Tages öffnet.2.75. Als nächstes werden DNA-Plasmide in das Hinterhirn im Lumen injiziert.

Dann wird das Hinterhirn einseitig elektroporiert, um die Expression der Konstrukte in der gewünschten neuronalen Gruppe zu ermöglichen, und die Eier werden inkubiert. Schließlich wird der Hirnstamm vom gesamten Embryo für die Präparation mit flacher Montur oder Gewebeschnitt präpariert. Letztendlich können durch Immunfluoreszenzfärbung und mikroskopische Analyse Ergebnisse erzielt werden, die axonale Projektionen und synaptische Ziele in der Hinterhand, im Gehirn und im Kleinhirn in verschiedenen Entwicklungsstadien zeigen.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsneurobiologie zu beantworten, z. B. wie bestimmte neuronale Zellen während der Embryonalentwicklung ihre Axone projizieren und synaptische Verbindungen bilden. Um sich auf die Elektroporation vorzubereiten, inkubieren Sie sie 65 bis 70 Stunden lang bei 37 bis 38 1/2 Grad Celsius, bis sie die Stadien 16 bis 17 erreichen. Während die Eier inkubiert werden, verbinden gezogene Glaskapillaren gebogene L-förmige Goldelektroden mit einem Adapterhalter mit dem Impulssprecher

Stellen Sie die Elektroporationsparameter auf 25 Volt, fünf Impulszahlen, 45 Millisekunden Impulslänge und 300 Impulsintervalle ein. Bereiten Sie eine Mundpipette, eine 10-Milliliter-Spritzennadel, Paraform-Streifen, eine weiche Bürste, eine scharfe Präparierschere und 25 Milliliter steriles PBS vor. Bereiten Sie eine geeignete Mischung von DNA-Plasmiden vor und fügen Sie schnellen grünen Farbstoff hinzu, um die injizierte DNA sichtbar zu machen.

Wenn die Eier das richtige Entwicklungsstadium erreicht haben, nehmen Sie sie aus dem Brutkasten und halten Sie sie in horizontaler Position. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Eierschalen zu reinigen. Behandeln Sie jeweils eine Eizelle, um die Exposition der Embryonen zu minimieren.

Zeit, mit den Spitzen der Schere zu lüften. Mache ein Loch in die Eierstange und entferne mit der Spritze drei bis vier Milliliter Albumin. Öffne mit der Präparierschere ein kleines ovales Fenster an der oberen waagerechten Stange der Eierschale.

Während des gesamten Prozesses tropfen Sie einige Tropfen PBS auf den Embryo, um Trockenheit zu vermeiden. Laden Sie mit einer Mundpipette eine kleine Menge des DNA-Gemischs in die Glaskapillare. Platzieren Sie dann den Embryo mit dem hinteren Ende in indirekter Sicht.

Halten Sie dann die Kapillare in einem Winkel von etwa 45 Grad und dringen Sie in das hintere Gehirn ein. Entfernen Sie keine Membranen um den Embryo herum, ohne dass sich Luftblasen bilden. Atmen Sie vorsichtig aus, um die DNA-Lösung in das Lumen des hinteren Gehirns zu injizieren.

Die Lösung breitet sich unmittelbar nach der DNA-Injektion anterior aus. Platzieren Sie die parallelen Elektroden in den präzisen Zielpositionen des AP- und DV-Hinterhirns. Ohne das Herz zu berühren, schieben Sie die Elektroden leicht nach ventral und pulsieren Sie den Elektro.

Die Elektroden sollten mit Blasen bedeckt sein, um die elektrische Leitfähigkeit anzuzeigen, die Elektroden vorsichtig entfernen und einige Tropfen PBS abtropfen lassen, um den Embryo zu kühlen und Blasen zu entfernen. Verwenden Sie einen Perfilstreifen, um die Eiöffnung richtig zu verschließen, um ein Austrocknen während der Inkubation zu verhindern. Waschen Sie die Elektroden mit einer weichen Bürste und PBS-Waschen Sie die Elektroden und legen Sie das Ei für die gewünschte Zeit in den Inkubator. Die Überlebensrate der Embryonen beträgt zwei bis drei Tage nach der Elektroporation etwa 90 % und reduziert sich 12 Tage nach der Elektroporation auf bis zu 50 %.

Um flache Präparationen des Hinterhirns herzustellen, präparieren Sie den Embryo vorsichtig und trennen Sie ihn von den umgebenden Membranen und Blutgefäßen. Legen Sie den Embryo in eine kleine silikonbeschichtete Petrischale, die PBS enthält, mit dem Embryo nach dorsal. Verwende Wolframstifte, um es an der Schale zu befestigen.

Dann mit einer scharfen Glaskapillare. Machen Sie mit einer scharfen Pinzette und einer Mikroschere einen dorsalen Schlitz in die Dachplatte des Hinterhirns. Halten Sie den oberen Teil des Kopfes fest und ziehen Sie das hintere Hirngewebe sehr vorsichtig vom Rostral zum Kleinkind.

Nach der Trennung des Hinterhirns wird das restliche ventrale Gewebe entfernt. Inkubieren Sie das Hinterhirn ein bis zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 4%iger Paraformaldehyd- oder PFA-Lösung. Waschen Sie es dann mit PBT, um das PFA zu entfernen.

Nach Befolgung des im Textprotokoll beschriebenen Immunfluoreszenzpräparats legen Sie das Hinterhirn nach dorsal auf einen Objektträger. Geben Sie fluoreszierendes Eindeckmedium auf das Hinterhirn und verwenden Sie Glaskapillaren oder Wolframnadeln, um das Hinterhirn auf dem Objektträger abzuflachen. Geben Sie an jeder Ecke eine kleine Menge Fett hinzu, um ein Zusammendrücken des Taschentuchs durch den Deckglas zu verhindern.

Legen Sie vorsichtig einen Deckzettel auf das Hinterhirn und vermeiden Sie Luftblasen, die anhaften. Nagellack auf die Ränder des Deckglases auftragen. Kryoschnitte des Hirnstamms können in jedem Entwicklungsstadium nach E 6.5 durchgeführt werden.

Sie sollten die bevorzugte Methode sein, da es schwierig ist, Axone im flach montierten Embryo zu visualisieren, der sehr dick wird. Darüber hinaus erfordert der Nachweis der Synapse das Schneiden des Gewebes und die Ansicht mit hoher Vergrößerung unter einem Mikroskop. Um eine Probe für den Kryoschnitt vorzubereiten, präparieren Sie den Embryo und entfernen Sie alle Gewebe, die das Gehirn umgeben.

Mit PBS ausspülen. Verwenden Sie dann eine Mikroschere und eine scharfe Pinzette, um den Embryo in der verwöhnten Region des Marks zu schneiden. Machen Sie einen weiten Schnitt zwischen dem Kleinhirn und dem Mittelhirn und entfernen Sie den gesamten Hirnstamm.

Das Gewebe sollte die Medulla pons und das cerebellum em enthalten. Im folgenden Beispiel wurde ein Enhancer-Element, das in der DA-Untergruppe von Interneuronen im Check-Hinterhirn exprimiert wird, stromaufwärts der Cree-Rekombinase kloniert und mit einem Cree-abhängigen zytoplasmatischen GFP-Reporterplasmid co-elektroporiert. Eine Flat-Mount-Präparation im Stadium E 4.5 zeigt zwei kontralaterale aufsteigende axonale Projektionsmuster, um die axonalen Projektionen von DA eins-Interneuronen in späteren Entwicklungsstadien zu kartieren.

Eine unbedingte GFP-Reporterkassette vor der Con wurde zwischen zwei Huckepack-Armen kloniert, zusammen mit dem A TOH One Creen Enhancer und dem Transpose-Vektor. Mit dieser Strategie wird das elektroporierte C precon bedingte MG FP in die Hühnerchromosomen integriert und folglich wird die Stoppkassette nur in D eins Neuronen entfernt, was eine verlängerte Expression von GFP ermöglicht. In DA eine Zellen.

Die mesylierte Form des GFP bindet es so an die Membran, dass es entlang der Axonmembran lokalisiert ist, anstatt im Zytoplasma verdünnt zu werden. Im Gehirn wurden Stängel bei E 13,5 gesammelt und in sagittalen Schnitten analysiert. Es wurde festgestellt, dass sich DA one Axone im Kleinhirn ansammeln und sich in Richtung der äußeren Körnerschicht oder EGL erstrecken, die durch ZI one positive Zellen gekennzeichnet ist.

Synaptische Ziele von D-1-Axonen im Kleinhirn wurden ebenfalls analysiert. E 2,75 Embryonen wurden mit einem synaptischen Vesikelprotein-Zwei-Reporter-Plasmid elektroporiert, zusammen mit einem H-eins-Cree-Enhancer und den Huckepack-Transponierungen. Diese Methode ermöglicht die Expression des GFP-Reporters in den präsynaptischen DA one axonalen Termini.

Das Kleinhirn wurde bei E 13,5 geschnitten und mit dem allgemeinen präsynaptischen Marker synaptischer Taman sowie mit Calbindin, das die Bikinischicht kennzeichnet, gefärbt. Eine Ansicht des Schnitts mit hoher Vergrößerung zeigt SV zwei GFP-positive synaptische Vesikel in mehreren Kleinhirnregionen, einschließlich der Bikinischicht. Dieses Ergebnis zeigt die synaptischen Verbindungen von DA und einem Hinterhirn in Interneuronen im Kleinhirn.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man DNA am zweiten Tag des Embryonals in den Vogel-Hein elektro einschleust, um eine Untergruppe von neuronalen Zellen spezifisch zu markieren. Dieses Verfahren ermöglicht es, die axonalen Projektionen und synaptischen Verbindungen der markierten neuronalen Zellen in mehreren Entwicklungsstadien zu verfolgen.