Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch In utero Elektroporation und In-vivo- Biolumineszenz Screening

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, erfolgreich in utero elektroporierte Wrap-ups für die weitere Analyse auszuwählen. Dies wird erreicht, indem zuerst die Ziel-DNA injiziert und dann eine In-utero-Elektroporation für den ausgewählten Bereich im Gehirn durchgeführt wird. Die elektroporierten Embryonen entwickeln sich in der Gebärmutter der Mutter und werden normal lebend geboren.

Die 2D-Bildgebung wird verwendet, um erfolgreich elektroporierte Tiere zu definierten postnatalen Zeitpunkten zu identifizieren. Abschließend wird das Zielgebiet durch 3D-Bildgebung genauer charakterisiert. Letztendlich können diese topisch transgenen Ratten in Verhaltenstests verwendet werden, um die Folgen einer gestörten Neuroentwicklung auf das Verhalten von Erwachsenen zu zeigen.

Die Elektroporation ist zwar eine etablierte Technik, wird aber bisher nicht häufig für die Erzeugung topisch transgener adulter Tiere eingesetzt. Dies liegt zum Teil an den erforderlichen technischen Fähigkeiten, aber auch an unserer derzeitigen Unfähigkeit, nur die erfolgreichen elektroporierten Neugeborenen auszuwählen. Wir präsentieren eine Lösung für dieses Problem, indem wir live in vivo Biolumineszenz-Bildgebung verwenden, um eine erfolgreiche in vivo Bios-Essenz-Bildgebung einer neutralen Elektroratte zu ermöglichen.

Luziferstrahlen berichtet Gen ist co-elektroporiert. Die Lumineszenzdetektion kann durch luziferische Injektion aktiviert werden, um die ungefähre Position der bewerteten Zellen zu überwachen. Dies ermöglicht dann die Selektion für erfolgreich elektroporierte rote Pops.

Sammeln Sie zunächst die sterilen Materialien, die für die In-utero-Elektroporation benötigt werden. Bereiten Sie als Nächstes die DNA-Lösung vor, die den Zielvektor D-N-A-G-F-P, den Luciferase-Vektor und den schnellen grünen Farbstoff enthält. Unter ISO-Fluoranästhesie legen Sie die Gebärmutter frei, um den zu injizierenden Embryo sichtbar zu machen.

Injizieren Sie die DNA-Lösung mit einer dünnen Glasnadel in einen der Seitenventrikel des Embryos. Um eine Zellpopulation aus oberen kortikalen Schichten zu treffen, platzieren Sie eine sieben Millimeter lange Elektrode um den Kopf des Embryos und platzieren Sie die positive Elektrode über dem Ventrikel mit einer leichten dorsalen lateralen Tendenz. Führen Sie die Elektroporation mit einer Rechteckimpuls-Elektroporation durch, indem Sie auf das Fußpedal treten, um die Hippocampuszellen zu erreichen.

Platzieren Sie die positive Elektrode auf der gegenüberliegenden Seite des injizierten Ventrikels. Vor der Elektroporation zunächst Luzifer-Natriumsalz in PBS auf eine Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter verdünnen und durch Sterilfiltration sterilisieren. Halten Sie nach dem Wiegen einen Welpen mit dem Bauch nach oben und leicht gestreckt, bevor Sie den Luzifer injizieren, um mit dem Bildgebungsverfahren zu beginnen.

Luzifer-injizierte Welpen werden betäubt und in eine Bauchlage innerhalb des Ivis-Spektrum-Geräts gebracht. Zuerst sind 2D-Biolumineszenzbilder erforderlich, um zu bestimmen, welche Welpen erfolgreich elektroporiert wurden, indem sie im Ivis-Erfassungsbedienfeld arbeiten. Wählen Sie den Biolumineszenz-Bildgebungsmodus aus, um zu Beginn der Messung Overhead-Fotos aufzunehmen. Überprüfen Sie die Fotoeinstellung, und stellen Sie das Binning auf mittel und die Blende auf acht ein, wählen Sie unter der Fokuseinstellung die Option Motivhöhe verwenden.

Stellen Sie als Nächstes den Anregungsfilter so ein, dass er den Emissionsfilter auf "Öffnen" und das Binning auf "Mittel" blockiert. Die Blende sollte auf eins eingestellt werden, und die Bühnenebene oder das Sichtfeld ist auf ein 2D-Bild eingestellt. Mit einer Lumineszenz-Belichtungszeit von 180 Sekunden werden die elektroporierten Bereiche positiver Jungtiere dann weiter untersucht, indem 3D-Bilder nach den Einstellungen für die Glühwürmchen-Luziferase aufgenommen werden.

Vergewissern Sie sich zunächst, dass die Option "Fotografieren" ausgewählt ist, um zu Beginn der Bildgebung ein Overhead-Foto aufzunehmen. Um die Oberfläche des Tieres vor der Biolumineszenzmessung zu scannen, wählen Sie die Strukturoption für Jungtiere bis zu einem Alter von zwei Wochen. Die folgenden Emissionsfilter und Expositionszeiten wurden aufgrund der Abnahme der Signalstärke bei älteren Tieren ausgewählt, die Expositionszeit wurde für die drei besten Emissionsfilter bei Ratten, die älter als P 20 sind, verlängert.

Stellen Sie als Nächstes den Bühnenpegel auf die Benning auf mittel und den Anschlag F auf eins ein und nehmen Sie das 3D-Bild auf. Markieren Sie die Ratten nach der Bildgebung mit deutlichen Ohrlöchern, um sie voneinander zu unterscheiden und mit den Ivis-Live-Bildern abzugleichen. Nehmen Sie das Tier schließlich auf eine erwärmte Oberfläche, bis es sich vollständig erholt hat.

Die 3D-Bilder werden mit der Lebendbild-Software erzeugt, die auf dem Ivis spectrum System vorinstalliert ist. Der erste Schritt besteht darin, die Oberflächentopographie zu rekonstruieren. Schneiden Sie dazu einen interessierenden Bereich zu und legen Sie den Schwellenwert zwischen 20 und 30 % fest. Starten Sie die DLIT 3D-Rekonstruktion für Hirngewebe mit einem Bildschwellenwert von 10 % für jede Wellenlängeneinstellung.

Um 3D-Filme zu erstellen, wählen Sie die Schaltfläche Animieren Bearbeiten Sie in der 3D-Symbolleiste die Ausrichtung und den Zoom des 3D-Bildes wie gewünscht. Drücken Sie anschließend die Aufnahmetaste, um den Wechsel von einer Position oder Ausrichtung in eine andere zu verfolgen. In diesen Beispielen zeigten P 7-Ratten, die nach einer luziferischen Injektion abgebildet wurden, je nach Erfolg der Elektroporation entweder kein Lumineszenzsignal, ein schwaches Signal oder ein starkes Lumineszenzsignal.

Diese Bilder zeigen eine Zeitleiste aufeinanderfolgender Biolumineszenzmessungen an derselben Ratte, die ein langes Nachweisfenster zeigt. Hier zeigen 2D-Bilder eine erfolgreiche Elektroporation in den Kortex oder Hippocampus. Die Zielbereiche werden mit Hilfe von 3D-Bildgebung sowohl bei kortikal als auch bei hippokampalen elektroporierten Tieren weiter visualisiert.

Dieses Video zeigt den erfolgreich elektroporierten Bereich aus mehreren Perspektiven. In diesem Beispiel werden die Zielorte, die aus der 2D- und 3D-Bildgebung im lebenden Tier identifiziert wurden, durch Biolumineszenz und GFP-Epi-Fluoreszenzdetektion im präparierten Gehirn weiter validiert. Dieses Bild, das aus demselben erfolgreich elektroporierten Rattengehirn aufgenommen wurde, zeigt eine detaillierte Ansicht der GFP-exprimierenden Zellen bei P 14, wenn es korrekt durchgeführt wird.

Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der verhaltensbezogenen und neuropathologischen Folgen von neurologischen Entwicklungsstörungen. Die Auswahl nur der erfolgreich elektrisch bewerteten Ratten reduziert Kosten und Aufwand erheblich. Der Erfolg mit dieser Technik erfordert Übung und hat unterschiedliche Motilitäts- und Wirksamkeitsraten.

Die Immunhistologie der Kernelektro-GFP ist wichtig, um den genauen Bereich der Transfektion mit anatomischer Auflösung für eine post-hoc-Korrektur der Verhaltensergebnisse zu dokumentieren.