Name: Generación de ratas transgénicas por vía tópica En el útero La electroporación y En vivo Detección bioluminiscencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T11:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende a generar ratas transgénicas mediante electroporación in utero y detección bioluminiscente in vivo. Este método permite seleccionar animales modificados genéticamente para estudios de neurodesarrollo y comportamiento en adultos.

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Los autores agradecen a Tracy Young-Pearse y Atsushi Kamiya para proporcionar plásmidos. Este trabajo fue financiado por NEURON-ERANET DISCover a O y CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) para CK, y (DE 792/2-4) para MASS

Todos los experimentos con animales fueron autorizados por el responsable Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301), de conformidad con la legislación nacional y europea. 1. En el útero de electroporación Este método ha sido descrito en detalle en JoVe para la rata por Walantus et al. 3, así como Rice et al. 4 y se resumen aquí sólo brevemente. Un tamaño de la camada de 6-8 cachorros se obtiene un buen resultado. Debe haber por lo menos dos embriones no electroporadas con el fin de aumentar la tasa de supervivencia global (ver más abajo). <ol><li> Preparar ADN-Mezcla que contiene 1,5 g / l de meta-plásmido (shRNA: pENTR-U6; Invitrogen, Eugene, Oregón / DISC1 sobreexpresión: pCAX 21), 0,5 g / l de luciferasa que contiene el plásmido (pCAX), 0,5 g / l de GFP que contiene el plásmido (pCAGGS 22) en 1x PBS solución teñida azul ligeroe con Fast Green Dye. </li><li> Preparar agujas de inyección de capilares de vidrio con una aguja de pipeta Extractor. Y esterilizar instrumentos quirúrgicos, ya sea en autoclave o por incubación con un desinfectante a base de alcohol (Kodan Tinktur forte). </li><li> Administrar una dosis pre-operatorio de la buprenorfina (0,05 mg / kg) 15 min antes de la cirugía a una rata preñada 16 días después de la fertilización (E16). Entonces anestesiar al animal en una cámara de isoflurano. <ol><li> Tras la anestesia, colocar la rata en una posición supina en una mesa de operación de calentado-C 37 ° con la máscara de respiración conectado al dispositivo de anestesia, mediante configuración de oxígeno a 0,4 L / min y isoflurano en 1,8%. </li><li> Después de afeitarse el abdomen, desinfectar la zona afeitada tres veces con Kodan Tinktur Forte (un desinfectante a base de alcohol). </li><li> Cubra la rata con paños estériles, exponiendo sólo el campo de operación afeitado. </li></ol></li><li> Realizar en el útero de la electroporación. <ol><li> Cortar el abdomen con un scissor lo largo de la línea alba (~ 2 cm). </li><li> Exponer los cuernos uterinos con cuidado con unas pinzas de anillo. </li><li> Tenga cuidado de mantener la pared del útero húmedo con PBS estéril calentado durante toda la cirugía. </li><li> Inyectar la solución de ADN con una aguja de vidrio fina en uno del ventrículo lateral de los embriones. </li><li> Coloque el electrodo 7 mm alrededor de la cabeza del embrión. Para golpear una población de células de las capas corticales superiores, realice el IUE en E16 23 y coloque el electrodo positivo en el hemisferio por encima del ventrículo inyectado con una ligera tendencia dorsal / lateral. Para dirigirse a las células del hipocampo cambian la colocación de los electrodos positivo hacia el lado opuesto de la ventrículo inyectado con lateral a ligeramente dirección dorsal (Figura 1). </li><li> Lleve a cabo la electroporación por cinco pulsos 50 ms a 55 V con 950 saltos ms con una onda cuadrada electroporador pulso. </li><li> Piezas de la primera embrión en el extremo vaginal de cada cuerno uterino con el fin de aumentar la Tque las posibilidades de supervivencia de todos los embriones. </li><li> Ponga los cuernos del útero de nuevo en la rata madre. </li><li> Stich de la pared abdominal con un material de sutura quirúrgica absorbible Vicryl. </li><li> Cierre la piel con el material de sutura Vicryl o con clips de sutura. </li><li> Coloque la rata madre de nuevo en la jaula y mantenerlo caliente durante 2-3 horas. </li><li> Mantenga las ratas solo en su jaula en la sala de instalaciones de animales y se alimentan ad libitum. Dan a luz entre E22-24. </li><li> Mantenga las crías de rata con su madre durante tres semanas y luego separarlos por sexo. </li></ol></li></ol> 2. La bioluminiscencia de imágenes en vivo de la reacción enzimática de luciferasa Este método se utiliza para analizar la posición de las células transfectadas en el útero. Electroporación-Co ADNc de luciferasa de luciérnaga se traduce en luciferasa activa, que, después de la metabolización de D-luciferina a oxiluciferina, emite un fotón (Figura 2 </strong&gt;). La luminiscencia resultante se puede detectar en el cerebro de ratas jóvenes a electroporación positivos en un espectro IVIS hasta la edad de alrededor de 35 días después del nacimiento (Figura 4). En el presente estudio, se realizó el ensayo de luciferasa de imágenes y bioluminiscencia comenzando en P7. Este punto de tiempo fue elegido para permitir la madre y los cachorros para recuperarse del estrés del nacimiento. Cuando se trabaja inicialmente con los cachorros en P0, supervivencia de las crías se vio gravemente afectada en que los cachorros fueron encontrados muertos o ingeridos por la madre. Inicialmente, las crías de rata con electroporación con éxito son identificados por una imagen 2D-bioluminiscencia con un tiempo de exposición de tres minutos. Posteriormente, cachorros positivos se utilizan para crear imágenes en 3D con el fin de especificar la ubicación de la zona a electroporación. <ol><li> Diluir la sal de sodio-D luciferina en PBS a una concentración de 15 mg / ml y esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa estéril. </li><li> Sopesar los cachorros. </li><li> Tome el cachorro en una mano con el abdomen en la parte superior y estirar el abdomen ligeramente. Inyectar 10 l / g de peso corporal de luciferina intraperitoneal solución. Para los más viejos y más ágiles, pre-anestesiar a los cachorros con isoflurano en la cámara de inducción antes de la inyección de la luciferina. </li><li> Encienda la afluencia isoflurano del Sistema Gasista Anestesia XGI-8 dentro del espectro IVIS con 3% de isoflurano. </li><li> Ponga el hocico del animal en los conos de ojiva de cristal del Sistema de Anestesia. </li><li> Mantenga el animal en una posición boca abajo hasta que esté en anestesia profunda (2-3 min). Entonces reducir la afluencia isoflurano al 1,5%. </li><li> Elija una medición 2D-bioluminiscencia para seleccionar cachorros positivos de toda la camada. Utilice la siguiente configuración <img alt="Pantalla 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol><li> Establezca un CHECkmark en la fotografía con binning medio y F / Stop a las 8, la cámara toma una foto desde arriba después de comenzar la medición. </li><li> Establece filtro de excitación: bloque. </li><li> Establece filtro de emisiones: abierto. </li><li> Establecer Binning a medio. </li><li> Set F / Stop en 1. </li><li> Ajuste el nivel de la etapa A. </li><li> Establecer luminiscencia tiempo de exposición a 180 seg. </li></ol></li><li> Para la creación de imágenes en 3D con el fin de cuantificar mejor el área a electroporación de los cachorros positivos, utilice la siguiente configuración DLIT de luciferasa de luciérnaga. <img alt="Pantalla 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <ol><li> Establecer una marca de verificación en la fotografía, la cámara toma una foto desde arriba después de comenzar la medición. </li><li> Establecer una marca de verificación en la estructura, la superficie del animal se escanea por el IVIS antes de la medición de bioluminiscencia. </li><li> USE siguientes filtros de emisión y los ajustes de tiempo de exposición hasta la edad de dos semanas; Filtro de Emisiones 1: 590 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de Emisiones 2: 600 nm, tiempo de exposición 240 sec Filtro de emisión 3: 620 nm, tiempo de exposición de 180 segundos Filtro de emisión 4: 640 nm, tiempo de exposición de 120 segundos Para las ratas mayores de P20 Filtro de Emisiones 1: 600 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de Emisiones 2: 620 nm, tiempo de exposición de 300 segundos Filtro de emisión 3: 640 nm, tiempo de exposición de 300 segundos <img alt="Pantalla 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . Debido a la disminución de la intensidad de la señal en los animales más viejos, el tiempo de exposición se amplía para los tres mejores filtros de emisión. </li><li> Ajuste el nivel de la Etapa B </li><li> Establecer Binning a medio. </li><li> Set F / Stop en 1 </li></ol></li><li> Después de la medición, mar<html> k las ratas por un código earhole para diferenciarlos unos de otros y hacerlo coincidir con las imágenes en vivo de imágenes IVIS </li><li> Al final del procedimiento de medición, apague afluencia isoflurano y mantener la rata en la placa calentada durante algunos minutos antes de volver a su jaula. </li></ol> 3. Análisis de la bioluminiscencia Imágenes La generación de imágenes en 3D, películas en 3D y la cuantificación del volumen de la fuente de la señal se realiza mediante el software Living Image preinstalado en el espectro IVIS. <ol><li> Generación de imágenes en 3D <ol><li> En primer lugar, la reconstrucción de una topografía de la superficie, por lo tanto, establecer el umbral entre el 20-30%. <img alt="Pantalla 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Pantalla 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> een 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li> Comience reconstrucción DLIT 3D con un umbral de imagen del 10% para cada longitud de onda. <img alt="Pantalla 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Pantalla 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Pantalla 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . </li><li> Cree películas en 3D utilizando el botón animar dentro de la barra de herramientas 3D. </li><li> Elige diferentes orientaciones de la imagen 3D, así como vistas de zoom como fotogramas clave y pulse el &#39;Record &amp; #39, el botón, la grabación de la transición de una posición / orientación a otra. <img alt="Pantalla 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . </li></ol></li></ol> 4. Las pruebas de comportamiento Las pruebas de comportamiento se realizó con el fin de determinar si la manipulación de genes mediados por IUE en ratas podrían iniciar efectos a largo plazo que persisten en la edad adulta. En el presente caso, el efecto de los transitorios, unilateral de larga duración DISC1 humana cortical sobreexpresión después IUE fue investigado por probar la locomoción en un campo abierto (OF), con y sin una dosis baja de la anfetamina, como una prueba específica para la dopamina relacionada comportamiento 24. En un procedimiento similar realizado por Niwa et al. En ratones IUE utilizando caída DISC1, los ratones IUE pero no los controles mostraron hipersensibilidada la anfetamina 18. Las ratas que fueron en el útero a electroporación con un vector que sobreexpresa DISC1 se llevaron a cabo en condiciones de laboratorio con 12 h de luz 07 a.m.-7 p.m. y se alimentaron ad libitum. A los 3 meses de edad, las ratas se sometieron a pruebas de comportamiento. Para la cuantificación de la locomoción como una lectura de los efectos de la anfetamina, un campo abierto de un sistema de actividad Tru Scan situado en una cámara de sonido y de luz aislados se utilizó. Este sistema mide el tiempo de duración y distancia el animal se mueve, el tiempo y la distancia que pasó en el margen o en el centro del campo, así como la cría de comportamiento 25. <ol><li> En el primer día, pruebe después de la inyección de solución salina <ol><li> Pesar los animales. </li><li> Inyectar por vía intraperitoneal 1 l / g de peso corporal de una solución salina (PBS 1x). </li><li> Inmediatamente después de la inyección, el sacrificio del animal en el campo abierto y comenzar la medición del sistema TruScan. Registro durante 15 minutos unad subdividir los datos en 3 x 5 partes min. </li><li> Ponga el animal de nuevo en su jaula. </li></ol></li><li> Segundo día, prueba en la inyección de anfetamina <ol><li> Pesar los animales. </li><li> Inyectar por vía intraperitoneal 1 l / g de peso corporal de una solución de anfetamina 0,5 mg / ml. </li><li> Inmediatamente después de la inyección de sacrificio del animal en el campo abierto y comenzar la medición del sistema TruScan. Registro durante 15 min y subdividir los datos en 3 x 5 partes min. </li><li> Volver al animal a su jaula. </li></ol></li><li> Analizar la locomoción y el comportamiento de crianza generado por un software específico Tru Scan. Crear gráficos con GraphPad (Prism) y calcular las estadísticas por el software de SPSS Statistics. </li></ol>

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<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960(2012).</li>
</ol>

Los autores de este estudio no tienen interés financiero en este estudio y no han sido patrocinados por la industria para este estudio. Las tarifas de acceso abierto fueron aportados por correo publicación PerkinElmer Inc..

Nuestro estudio demuestra que la IUE es adecuado para generar ratas adultas con neuronas que expresan un transgén en un área selectiva del cerebro y que, como resultado de esta intervención, estos animales presentan cambios en el comportamiento que indica la funcionalidad de la manipulación realizado. En este estudio, como un ejemplo, las ratas que sobreexpresan DISC1 unilateralmente en una pequeña parte de la corteza prefrontal mostraron hipersensibilidad hacia la anfetamina (Figura 9). Selección de las ratas para el éxito de la electroporación in vivo por imágenes de bioluminiscencia fue eficaz en el control de la variabilidad inherente de la transfección de células IUE y se aplicó para generar grupos con una superficie IUE homogénea de baja variabilidad interindividual para investigaciones posteriores. En este estudio, hemos podido seleccionar cachorros de la camada a electroporación mediante la detección de la fluorescencia inducida por GFP-co-electroporated en el animal recién nacido, incluso aunqueuf al mismo tiempo y en el mismo animal una señal de bioluminiscencia de la luciferasa igualmente co-electroporación podría ser detectado después de la inyección luciferina (Figura 6), y la neuronas que expresan GFP estaban aún presentes en el cerebro a una edad de seis meses. Llegamos a la conclusión de que, en la rata, la reacción luciferasa / luciferina es muy adecuado para diferenciar los animales con cerebros electroporadas exitosas (Figura 3). El control cuantitativo de éxito IUE se refiere a la fuerza de la señal de bioluminiscencia que se mide por los recuentos de fotones dentro del mismo tiempo de exposición (Figura 3) y corresponde a la actividad enzimática de luciferasa co-expresado. Las señales pequeñas bioluminiscencia son detectables por 100-200 cargos de fotones, y, en un resplandor de ~ 1x10 4 fotones / s / cm 2 / mostrar estereorradián 1.000-2.000 células GFP-manchado en la histología en 6 meses de edad el cerebro de rata. La más alta disp señallayed una radiación de hasta ~ 5x10 6 fotones / s / cm 2 / estereorradián y ~ 64.000 cuentas. En la cepa de rata Sprague Dawley utilizado, se observó un debilitamiento de la señal de bioluminiscencia longitudinalmente con aumento de la edad y la señal desapareció más allá de la edad de P35 (Figura 4). En este punto, no sabemos si alguno de lo transitorio, de expresión basado en vectores plásmido de luciferasa disminuye, o si la señal de bioluminiscencia se debilita debido al aumento de la masa cerebral, o ambos, son las causas de la desaparición de la señal. Para el ensayo funcional presente en las ratas adultas, la selección para los estudios de comportamiento se limitó a hacer sobre la base de la ubicación de la señal, pero no por la fuerza de la señal de bioluminiscencia. A pesar de que la supervisión de bioluminiscencia cuantitativa 3D permite la diferenciación entre las diferentes zonas a electroporación (Figura 5), su exactitud se limitó para las células situadas en la moneda de diez centavos profundidadnsion del cerebro. Figura 6 muestra un ejemplo de una electroporación del hipocampo, donde la medición de bioluminiscencia en la 2D y la imagen 3D indicó un buen posicionamiento de la electroporación. En el cerebro post mortem diseccionado, se detectó una señal de GFP fluorescencia o menos a la misma posición que la señal de la bioluminiscencia, lo que indica la orientación correcta del hipocampo. Pero muestra la histología de que también las células en la corteza dorsal del hipocampo habían sido blanco (Figura 7). Esto indica que el ensayo de bioluminiscencia es una herramienta útil para detectar, cachorros IUE positivos y también para tener una idea de la zona a electroporación, pero, en última instancia, la imagen no puede sustituir a la histología post mortem para localizar exactamente las células positivamente orientadas. Nuestra demostración indica promesa para la aplicación de la tecnología de IUE para generar sutiles manipulaciones específicas de regiones cerebrales corticales o del hipocampo para simular aberrances en Cmigración ortical u otros defectos del neurodesarrollo que pueden influir en el animal adulto. Si bien la electroporación bilateral 26 tiene la ventaja de un efecto probablemente más grande en el comportamiento, también hay más de mortalidad de los embriones. Electroporación unilateral fue elegido con el fin de comparar los dos hemisferios con uno como un control interno, así como para mostrar que incluso manipulación IUE en una pequeña región unilateral, es suficiente para cambiar el comportamiento. Los cambios inducidos por el IUE en la conectividad o la arquitectura entre las neuronas pueden así ser inducida sin provocar una lesión y el partido requiere de la región a-ser-IUE manipulada con la prueba de comportamiento apropiado depende de la pregunta científica. Solución de problemas Reducción del tamaño de la camada Hay varias sugerencias con respecto a aumentar la supervivencia de las crías de IUE. En primer lugar, el uso de capilares de vidrio muy finas durante la electroporación con el fin de minimizar el tejido LesioSe recomienda n. En segundo lugar, no electroporar el primer embrión al final vaginal de cada cuerno uterino: la muerte de los primogénitos de embriones aumenta las posibilidades de una interrupción de todos los otros embriones. En tercer lugar, después del nacimiento, las ratas madre a menudo matan a parte de su progenie debido al estrés perinatal. Con el fin de reducir el estrés adicional, no comenzar con la formación de imágenes en directo justo después del nacimiento, pero esperar durante siete días. Detección de buenas prácticas agrarias en la fluorescencia de los cachorros A la semana después de su nacimiento, no hay señal de fluorescencia, ya sea usando la fluorescencia binocular en directo imágenes microscópicas o imágenes de fluorescencia con el IVIS Spectrum (modos de epifluorescencia y transfluorescence; para la excitación GFP / Emisión: 465/520 nm y 500/540 nm). Es posible que ambos, la transmisión limitada de onda de excitación y emisión de luz corta a través del tejido, como el cráneo y el alto fondo de autofluorescencia de la piel a prevenir el uso de la fluorescencia bajo la described condiciones en la rata. Como se muestra en la Figura 6, la señal de luciferasa en el animal vivo también se puede detectar en el cerebro diseccionado (sin cráneo) y allí, también una señal de fluorescencia es detectable (Figura 6D). Diferenciación de la bioluminiscencia en áreas del cerebro estrechamente espaciados Incluso en la ilustración 3D la ubicación de la zona de la bioluminiscencia no se puede predecir a 100%. Especialmente las células en la parte superior o debajo de la superficie prevista también pueden utilizarse y se transfectaron de forma accidental. La posición exacta tiene que ser controlado por post mortem (fluorescencia) la histología (véase la Figura 7).

El desarrollo de la electroporación in utero método (IUE), que permite una modulación de la expresión génica en el cerebro en desarrollo, ha sido un gran avance, ya que permitió estudiar el neurodesarrollo con relativa facilidad. 1-7 Cambios en los niveles de expresión de un gen diana en una región específica del cerebro durante el desarrollo embrionario y / o perinatal en los roedores se demostró de manera crítica la influencia proliferación neuronal, migración, arborización y conectividad. 8-10 La esquizofrenia es una enfermedad mental compleja, con síntomas agudos y crónicos que se han relacionado con alteraciones del desarrollo neurológico 11, 12 y, por tanto, muchos de los genes candidatos identificados para la esquizofrenia son investigados por posibles efectos de modulación sobre el desarrollo neurológico, como por ejemplo para la interrupción-en-la esquizofrenia -1 (DISC1) gen 13-15. El desarrollo del cerebro es regulatcado por factores genéticos y sus interacciones con el medio ambiente que juegan un papel en la pre,-períodos de desarrollo peri y postnatal. Un factor de riesgo genético importante para diversos trastornos de comportamiento es DISC1 los 16 genes. DISC1 cables desmontables a defectos de la migración en los ratones 13, 17, y la manipulación de la expresión DISC1 en el desarrollo de la corteza por IUE se ha demostrado que el impacto comportamiento de los ratones adultos 18. La manipulación de la expresión génica cerebro por IUE tiene varias ventajas sobre 19 la generación de líneas de animales transgénicos. En primer lugar, la expresión de genes dentro de las áreas de interés se logra en cuestión de semanas o meses en lugar de varias generaciones de cría líneas de roedores transgénicos. En segundo lugar, se evitan los mecanismos de compensación durante el desarrollo temprano que pueden blindar fenotipos en los animales de la línea germinal de ingeniería 20. En tercer lugar, a través de la orientación sólo una población celular específica o área específica del cerebro, migratio diferencias de proliferación pueden ser comparados directamente con la no-mutante o de control del lado contralateral si se eligen electroporaciones unilaterales. Por otro lado, IUE no tiene la exactitud de CRE / LOX temporización inducida-promotor impulsado de expresión y sólo una subpoblación de las células en un área determinada está dirigido conduce a una especie de mosaico de patrón de expresión génica. Para muchas aplicaciones experimentales en roedores adultos, una transfección transitoria de un número limitado de células en una región del cerebro puede ser suficiente, o incluso deseado, de modo que la principal ventaja de la línea germinal, roedores-transgénicas estables es insignificante. De hecho, la IUE es útil para investigar si algunas células desarrolladas anormalmente puede afectar a toda una red de células o circuitos. Otra ventaja puede ser la capacidad de demostrar los efectos no-células autónomas de un gen debido a la naturaleza del mosaico de la exitosa. Por otra parte, la generación de ratas transgénicas y knockout se encuentra todavía en su infancia y el usode IUE en esta especie para el estudio de las consecuencias del desarrollo cerebral aberrantes es de gran interés. Hasta el momento, el mayor obstáculo de la utilización de IUE para la investigación de las consecuencias de intervención en aquellos animales que a los adultos es la falta de éxito de la vigilancia de la electroporación. Hasta ahora, GFP-co-transfectadas neuronas fluorescentes en las crías de rata recién nacidos vivos no se pudo detectar con un microscopio de fluorescencia binocular adecuado o con la formación de imágenes de fluorescencia del espectro IVIS. Para superar este obstáculo, que co-transfectadas un gen indicador de luciferasa y se realizó la bioluminiscencia de imágenes en vivo de las crías por 3 dimensiones (3D) la cuantificación de la zona del cerebro IUE. Como un ejemplo para demostrar la aplicabilidad de este método en un ensayo funcional más adelante prueba de la manipulación genética del desarrollo neurológico, un co-inyección de plásmidos que contienen DISC1 humana, luciferasa, y GFP en el ventrículo lateral de embriones de rata <sup&gt; 3 seguido por electroporación con un electrodo de pinza se realizó. Si bien las señales de fluorescencia no podían ser detectados en etapas postnatales en vivo, una señal de bioluminiscencia sólido derivado del metabolismo luciferina por el gen de la luciferasa co-transfectadas se detectó hasta cinco semanas después del nacimiento. 3D-mediciones de la cuantificación permitido área cerebral a electroporación mediante el cual se identificaron los cachorros con electroporación insuficiente o equivocada desde el principio, por lo tanto, lo que permite la asignación de los animales IUE (gen de interés y revueltos control) a los grupos experimentales con áreas cerebrales electroporadas emparejados de baja variabilidad . El uso de ratas adultas IUE en paradigmas de comportamiento se demostró como un ejemplo de la utilidad de este protocolo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Nombre del reactivo</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) de DulbeccoInvitrogen</td><td></td> <td>14190-250</td><td>sin calcio, sin magnesio</td></tr><tr><td>D-luciferina, sal sódica</td><td>SynChem OHG, Alemania</td><td>BC218</td><td>Número CAS: 103404-75-7 sustrato para luciferasa luciferasa</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich, EE. UU.</td><td>F7258-25G</td><td>CAS: 2353-45-9</td></tr><tr><td>D-Anfetamina</td><td>Sigma Aldrich, USA</td><td>A 5880</td><td>CAS: 51-63-8</td></tr><tr><td>kodan Tinktur forte</td><td>Sch&#252; lke Mayr GmbH, Alemania</td><td>104 005</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Material / producto</capilares ></td></tr> <tr><td>vidrio</td> fuerte <td>Sutter Instrument</td><td>Novato, California, EE. UU</td>. <td>Diámetro exterior del vidrio de borosilicato: 1 mm, diámetro interior: 0,78 mm</td></tr><tr><td>Extractor de pipetas de aguja</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Tujunga, California, EE. UU</td><td></td></tr><tr>.<td>Electrodo de pinza</td><td>Nepa Gene CO., LTD.</td><td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japón</td><td> Electrodos de disco de platino de 7 mm de diámetro (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>) </td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas - afiladas </td><td>Fine Science Tools</td><td>Heidelberg, Alemania</td><td> Recto, 12 cm (14002-12) </td></tr><tr><td>Pinzas de anillo</td><td>Fine Science Tools</td><td>Heidelberg, Alemania</td><td> 2,2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) </td></tr><tr><td>Electroporador de pulso de onda cuadrada (CUY21SC)</td><td>Nepa Gene CO., LTD.</td><td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japón</td><td>(CUY21SC)</td></tr><tr><td>Material de sutura quirúrgica Vicryl </td><td>Ethicon</td><td>Norderstedt, Alemania</td><td>3-0; 2 Ph. Eur;</td></tr><tr><td>Aplicador de clip para heridas </td><td>Fine Science Tools</td><td>Heidelberg, Alemania</td><td>Reflex 9 mm (12032-09)</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>VWR</td><td>Darmstadt, Alemania</td><td>0.45 &mu; m acetato de celulosa</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum </td><td>Caliper Ciencias de la Vida / PerkinElmer</td><td>Waltham, MassachusettsEE. UU.</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 Sistema de anestesia de gas</td><td>PerkinElmer</td><td>Waltham, Massachuset tsUSA</td><td></td></tr><tr><td>Coulbourn Instruments</td> de<td>campo abierto</td><td>Allentown, EE. UU.</td> <td>(40 x 40 x 39 cm)</td></tr><tr><td>Sistema de actividad Tru Scan </td><td>Coulbourn Instruments</td><td>Allentown, EE. UU.</td><td></td></tr> <<tr>td colspan="4"> <table border="1"> <tbody><tr> <td colspan="4">Tabla de recetas</td> </tr> <tr> <td> Number</td> <td>Nombre del búfer</td> <td>Content </td> <td>Comentarios </td> </tr> <tr> <td>1</td> <td>Mezcla de ADN para sobreexpresión de DISC-1</td> <td>1.5 &mu; g/&mu; l pCAX humanDISC-1, 0.5 &mu; g/&mu; l pCAX-luciferasa, 10x PBS (10 %) Colorante verde rápido (0,5 %) añadir H2O</td> <td>100 &mu; l de la mezcla son suficientes para ~5 IUE</td> </tr> <tr> <td>2</td> <td>DNA-Mixure para control</td> <td>0,75 &mu; g/&mu; l control shRNA1, 0,75 &mu; g/&mu; l control shRNA2, 0.5 &mu; g/&mu; l pCAX-luciferasa, 0,5 &mu; g/&mu; l pCAGGS-GFP 10x PBS (10 %) Tinte verde rápido (0,5 %) añadir H2O</td> <td>100 &mu; l de la mezcla son suficientes para ~ 5 IUE< / td> < / tr> <tr> <td>3< / td> <td>Fast green Dye< / td> <td>10 mg / ml Fast Green FCF en ddH2O< / td> <td></td> </tr> <tr> <td>4< / td> <td>D-luciferina solución</td> <td>15 mg/ml D-luciferina, sal sódica en PBS</td> <td></td> </tr> <tr> <td>5</td> <td>Solución de anfetamina</td> <td>0,5 mg/ml D-Anfetamina en PBS</td> <td></td> </tr> </tbody></table> </td></tr></tbody></table>

generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; en el útero</em&gt; la electroporación y<em&gt; en vivo</em&gt; detección bioluminiscencia

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

En electroporación in utero (IUE) es una técnica que permite la modificación genética de las células en el cerebro para investigar el desarrollo neuronal. Hasta ahora, el uso de IUE para investigar el comportamiento o la neuropatología en el cerebro adulto se ha limitado por métodos insuficientes para la vigilancia del éxito de la transfección IUE mediante técnicas no invasivas en animales postnatales. Para el presente estudio, se utilizaron ratas E16 para la IUE. Después de la inyección intraventricular de los ácidos nucleicos en los embriones, el posicionamiento de los electrodos de pinza era crítico para la orientación o bien el desarrollo de la corteza o el hipocampo. Ventricular co-inyección y la electroporación de un monitoreo gen de la luciferasa permitido de las células transfectadas después del nacimiento después de la inyección intraperitoneal luciferina en el anestesiados crías P7 vivo por bioluminiscencia in vivo, utilizando un dispositivo de IVIS Spectrum con el software de cuantificación 3D. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Definición de Zona por bioluminiscencia puede diferenciar claramente entre electroporaciones corticales y del hipocampo y detectar una señal en sentido longitudinal en el tiempo hasta 5 semanas después del nacimiento. Esta técnica de formación de imágenes nos permitió seleccionar las crías con un número suficiente de células transfectadas asumidos necesario para desencadenar efectos biológicos y, posteriormente, para llevar a cabo las investigaciones de comportamiento a 3 meses de edad. Como un ejemplo, este estudio demuestra que la IUE con el gen DISC1 humana de longitud completa en la corteza de rata dio lugar a hipersensibilidad anfetamina. GFP transfectadas-CO puede ser detectado en las neuronas post mortem por microscopía de fluorescencia en secciones criogénicas que indican la expresión de genes presentes en ≥ 6 meses después del nacimiento. Llegamos a la conclusión de que imágenes de bioluminiscencia postnatal permite evaluar el éxito de las transfecciones transitorias con IUE en ratas. Las investigaciones sobre la influencia de los tópicos manipulaciones génicas durante neurodevelopment en el cerebro adulto y su conectividad se facilita en gran medida. Para muchas preguntas científicas, esta técnica puede complementar o incluso reemplazar el uso de ratas transgénicas y proporcionar una tecnología novedosa para la neurociencia conductual.

<html> La Figura 3 muestra viven mediciones de imágenes de tres crías de rata en P7 después de la inyección de 150 mg luciferina / kg de peso corporal. Las diferencias de intensidad de la señal que indica la variabilidad en la eficiencia de la IUE son visibles. Señales de bioluminiscencia Se registraron fuertes hasta P36 (Figura 4). En la Figura 5, la capacidad de definir cortical (Figuras 5A y 5C) y del hipocampo (Figuras 5B y 5D) por electroporación imágenes de bioluminiscencia se representan. Correlación de la señal de bioluminiscencia (Figura 7A) con su señal de fluorescencia después de la eliminación del cráneo (Figura 7B) y las células GFP-electroporación correspondientes en el cerebro cryosectioned (Figura 8) en P14 se representan en las Figuras 6-8. De nota, no había detección de una señal de fluorescencia en ratas vivas en cualquier punto de tiempo. tienda de campaña &quot;&gt; En vivo de imágenes de bioluminiscencia permite la discriminación aproximado de diferentes áreas del cerebro a electroporación por 2D (figuras 5A y 5B) que se mejora en gran medida con el programa DLIT del software de IVIS Espectro de generación de imágenes en 3D (Figuras 5C y 5D). En los ejemplos mostrados , la electroporación de la corteza prefrontal y el hipocampo podía distinguirse. Cabe señalar que mientras que el objetivo para electroporar el hipocampo, algunas células progenitoras de la corteza acostado dorsal del hipocampo pueden también ser golpeado (Figura 7). Las ratas de manera unilateral en el útero a electroporación con pCAX vector en el córtex y posteriormente sobreexpresan longitud DISC1 humano pleno fueron investigados por tanto espontánea como la hiperactividad inducida por anfetamina como adultos. Las ratas sometidas a electroporación con pCAX-DISC1 eran hipersensibles a una baja dosis de anfetamina. Estas ratas se movieron significativamente more después de tratamiento con anfetaminas que después de la inyección de solución salina, mientras que los animales de control no lo hizo (Figura 10). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la posición del electrodo para A) electroporación y B corteza) electroporación hipocampo; verde = inyecta ADN-Mix en el ventrículo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> Figura 2. Reacción de la luciferasa. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> Figura 3. Medición de luminiscencia de ratas P7 después de la inyección de 150 mg / kg de peso corporal luciferina; tiempo de exposición 180 seg; Una) de rata sin señal de luminiscencia; B) de rata<html> con una señal de bioluminiscencia débil, C) de la rata con una señal de luminiscencia fuerte. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> Figura 4. Línea de tiempo de las mediciones de bioluminiscencia consecutivos de la misma rata después de la inyección de 150 mg / kg luciferina demostrando una ventana de tiempo grande donde el éxito IUE puede ser detectado. <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . Figura 5 Ilustración de las diferencias entre la electroporación cortical y del hipocampo en P7 A) y B) imágenes 2D;. C) y D), ver fotos en 3D, A) y C) de la corteza; B) y D) del hipocampo.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="La figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> Figura 6. Ilustración de E16 electroporación del hipocampo de una cría de rata en P14 A) 2D-imagen de bioluminiscencia B) Ilustración 3D de la señal de bioluminiscencia C) diseccionó cerebro con bioluminiscencia señal D) del cerebro con GFP señal de epi-fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> Figura 7. Detalle de una imagen de fluorescencia de una sección crio 20 m de la misma P14 cerebro de rata a electroporación con GFP y luciferasa que contiene el plásmidovector, tinción de núcleos con DAPI; CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = giro dentado, FC = Fasciolarum cinereum. Video 1. Animación 3D de un hipocampo de rata a electroporación en P14. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> Figura 8. Esquema de prueba de anfetaminas: la inyección de solución salina primer día antes de la prueba de 15 minutos, 24 horas más tarde la inyección de anfetaminas antes de la prueba en la cámara de campo abierto. <img alt="Figura 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> La Figura 9. Prueba de anfetaminas. Gráfico de barras que muestra la distancia recorrida (en cm) del animal registrado por un sistema TrueScan más de 15 min barras blancas = grupo de control;. Barras grises = grupo sobreexpresan DISC1; grupo control n = 10; DISC1 grupo sobreexpresión n = 11; ANOVA: * geno tratamiento p = 0,043; prueba t para el tiempo total de solución salina vs ns = anfetaminas no Pcontrol significativo = 0,172, pDISC1 = 0,001.

Los genes pueden ser manipulados durante el desarrollo de la corteza o el hipocampo de la rata en el útero a través de electroporación (IUE) en el E16, para permitir modificaciones rápidas y focalizadas en la conectividad neuronal para estudios posteriores de comportamiento o neuropatología en los animales adultos. Postnatal de imágenes in vivo para el control del éxito IUE se realiza mediante bioluminiscencia de la activación de luciferasa co-transfectadas.

Generación de ratas transgénicas por vía tópica<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación y<em&gt; En vivo</em&gt; Detección bioluminiscencia

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

El objetivo general de este procedimiento es seleccionar con éxito envolturas electroporadas en el útero para su posterior análisis. Esto se logra inyectando primero el ADN objetivo y luego realizando una electroporación en el útero para el área seleccionada dentro del cerebro. Los embriones electroporados se desarrollan dentro del útero de la madre y nacen vivos normalmente.Las imágenes 2D se utilizan para identificar animales electroporados con éxito en puntos de tiempo postnatales definidos. Finalmente, el área objetivo se caracteriza con más detalle mediante imágenes 3D. En última instancia, estas ratas transgénicas tópicamente se pueden utilizar en pruebas de comportamiento para mostrar las consecuencias de un desarrollo neurológico alterado en el comportamiento de los adultos.Si bien la electroporación es una técnica establecida, no se ha utilizado ampliamente para la generación de animales adultos transgénicos tópicamente. Esto se debe en parte a las habilidades técnicas requeridas, pero también a nuestra incapacidad actual para seleccionar solo a los cachorros recién nacidos electroporados exitosos. Presentamos una solución a este problema mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia in vivo en vivo para permitir la obtención exitosa de imágenes de esencia bios in vivo de ratas eléctricas neutras.El gen reportado por los rayos Lucifer está coelectroporado. La detección de luminiscencia se puede activar mediante inyección luciferina para monitorear la posición aproximada de las celdas clasificadas. Esto permite seleccionar paletas rojas electroporadas con éxito.Para empezar, reúna los materiales estériles necesarios para la electroporación en el útero. A continuación, prepare la solución de ADN que contiene el vector D-N-A-G-F-P objetivo, el vector luciferasa y el tinte verde rápido. Bajo anestesia ISO con flúor se expone el útero para visualizar el embrión que se va a inyectar.Con una aguja de vidrio delgada, inyecte la solución de ADN en uno de los ventrículos laterales del embrión. Para golpear una población celular de capas corticales superiores, coloque un electrodo de siete milímetros alrededor de la cabeza del embrión y coloque el electrodo positivo sobre el ventrículo con una ligera tendencia lateral dorsal. Realice la electroporación con una electroporación de pulso de onda cuadrada pisando el pedal para dirigirse a las células del hipocampo.Coloque el electrodo positivo en el lado opuesto del ventrículo inyectado. Antes de electroporar, primero diluir la sal sódica de Lucifer en PBS a una concentración de 10 miligramos por mililitro y esterilizar por filtración estéril. Después de pesarlo, sostenga a un cachorro con el abdomen hacia arriba y ligeramente estirado antes de inyectar el Lucifer para comenzar el procedimiento de imagen.Las crías inyectadas por Lucifer se anestesian y se colocan en posición prona dentro del dispositivo de espectro Ivis. Se requieren primeras imágenes de bioluminiscencia en 2D para determinar qué cachorros se electroporaron con éxito trabajando en el panel de control de adquisición de Ivis, seleccione el modo de imagen bioluminiscente para tomar fotos aéreas al comienzo de la medición. Verifique la configuración de la fotografía y establezca el binning en medio y el número F en ocho, seleccione Usar altura del sujeto en la configuración de enfoque.A continuación, configure el filtro de excitación para bloquear el filtro de emisión para que se abra y el binning en medio. El número F debe establecerse en uno y el nivel del escenario o campo de visión debe establecerse en una imagen 2D de adquisición A. Con un tiempo de exposición de luminiscencia de 180 segundos, las áreas electroporadas de las crías positivas se investigan más a fondo tomando imágenes en 3D siguiendo la configuración de la luciferasa de luciferasa de luciérnagas.En primer lugar, confirme que la opción de fotografía está seleccionada para adquirir una foto aérea al inicio de la toma de imágenes. Para escanear la superficie del animal antes de la medición de la bioluminiscencia, seleccione la opción de estructura para cachorros de hasta dos semanas de edad. Los siguientes filtros de emisión y tiempos de exposición se seleccionan debido a la disminución de la intensidad de la señal en animales mayores, el tiempo de exposición se incrementa para los tres mejores filtros de emisión en ratas mayores de P 20.A continuación, establezca el nivel de la etapa para que sea el benning a medio y el número F a uno y adquiera la imagen 3D. Después de la toma de imágenes, marque las ratas con distintos orificios para las orejas para diferenciarlas entre sí y hacerlas coincidir con las imágenes en vivo de Ivis. Finalmente, retire al animal a una superficie caliente hasta que esté completamente recuperado.Las imágenes 3D se generan utilizando el software de imagen viva preinstalado en el sistema de espectro Ivis. El primer paso es reconstruir la topografía de la superficie. Para ello, recorte una región de interés y establezca el umbral entre 20 y 30%Iniciar reconstrucción DLIT 3D para tejido cerebral con un umbral de imagen del 10%para cada ajuste de longitud de onda.Para crear películas en 3D, seleccione el botón Animar Dentro de la barra de herramientas 3D, manipule la orientación y el zoom de la imagen 3D como desee. A continuación, presione el botón de grabación para realizar un seguimiento del cambio de una posición u orientación a otra. En estos ejemplos, las ratas P 7 fotografiadas después de una inyección luciferina no mostraron ninguna señal de luminiscencia, una señal débil o una señal de luminiscencia fuerte dependiendo del éxito de la electroporación.Estas imágenes muestran una línea de tiempo de mediciones consecutivas de bioluminiscencia en la misma rata, lo que demuestra una larga ventana de detección. Aquí, las imágenes en 2D muestran una electroporación exitosa en la corteza o el hipocampo. Las áreas objetivo se visualizan aún más utilizando imágenes 3D en animales electroporados corticalmente y en el hipocampo.Este video muestra el área electroporada con éxito desde múltiples perspectivas. En este ejemplo, las ubicaciones objetivo identificadas a partir de imágenes 2D y 3D en el animal vivo se validan aún más a través de la bioluminiscencia y la detección de epifluorescencia GFP en el cerebro disecado. Esta imagen tomada del mismo cerebro de rata electroporado con éxito muestra una vista detallada de las células que expresan GFP en P 14 cuando se realiza correctamente.Este método permite estudiar las consecuencias conductuales y neuropatológicas de los defectos del neurodesarrollo. La selección de solo las ratas electrorcalificadas con éxito reduce en gran medida los costos y el esfuerzo. El éxito con esta técnica requiere práctica y tiene tasas de motilidad y eficacia variables.La inmunohistología de la electro GFP central es importante para documentar el área exacta de la transfección a resoluciones anatómicas para la corrección post-hoc de los resultados conductuales.

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En la inyección intraventricular Utero y electroporación de embriones de rata E16

Con el creciente interés en terapias con células madre, las técnicas de imagen molecular son ideales para el comportamiento de las células madre de seguimiento tras el trasplante. Genes luciferase reportero le han permitido no invasiva, la evaluación repetida de la supervivencia celular, la ubicación y la proliferación in vivo. Este vídeo demuestra cómo realizar el seguimiento proliferación de células madre en un ratón vivo.

In vitro e in vivo de imágenes de bioluminiscencia gen reportero de células estaminales embrionarias humanas

Aquí se presentan dos técnicas para manipular la expresión génica en las células ganglionares de la retina murina (CGR)...

La electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

Un método para la incorporación de ADN plásmido en murino células de la retina con el propósito de llevar a cabo ya sea ganancia o pérdida de los estudios de...

En electroporación in vivo de la retina del ratón en desarrollo

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Fuente: Koza, P., et al. Generación de Ratones Transgénicos utilizando un Enfoque con Vector Lentiviral. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la administración asistida por microinyección de vectores lentivirales en embriones de rata fertilizados para lograr la integración estable de transgenes en la generación de ratas transgénicas.

Transducción de embriones fertilizados de rata mediante vectores lentivirales

A pesar de la importancia clínica y funcional del...

La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Heterotopia nodular periventricular (PNH) es la forma más común de malformación del desarrollo cortical (MCD) en la edad adulta, pero su base genética sigue siendo desconocido en los casos más esporádicos. Recientemente hemos desarrollado una estrategia para identificar genes candidatos novela de MCDs y confirmar directamente su papel causativo en vivo.

Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

Estudios convencionales de pérdida de función de genes knockout animales han sido a menudo costoso y desperdiciador de tiempo. Basada en la electroporación CRISPR-mediada mutagénesis somática es una poderosa herramienta para entender gen funciona en vivo. Aquí, Divulgamos un método para analizar los fenotipos de nocaut en la proliferación de las células del cerebelo.

Mediada por CRISPR pérdida de función análisis en gránulo cerebeloso células usando en el útero electroporación basado en la transferencia de genes

Este artículo tiene como objetivo proporcionar la metodología para la transgénesis lentiviral en embriones de rata utilizando múltiples inyecciones de una suspensión de virus en el espacio perivitelina cigota. Las ratas hembra que están apareadas con una cepa masculina fértil con un color de piel dominante diferente se utiliza para generar madres adoptivas pseudoembarazadas.

Generación de ratas transgénicas utilizando un enfoque vectorial lentiviral

Aprende a generar ratas transgénicas mediante electroporación in utero y detección bioluminiscente in vivo. Este método permite seleccionar animales modificados genéticamente para estudios de neurodesarrollo y comportamiento en adultos.

Generación de ratas transgénicas por vía tópica

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