In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

Erlebte abhängige molekulare Veränderungen in Neuronen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, sich als Reaktion auf Verhaltensherausforderungen anzupassen. Hier wird ein in vivo Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahren beschrieben, das es ermöglicht, solche molekularen Veränderungen in einzelnen kortikalen Neuronen durch genetisch kodierte Reporter zu verfolgen. Eines der gut etablierten erfahrenen abhängigen Gene ist das aktivitätsregulierte Zytoskelett-assoziierte Protein oder Arc.

Die Transkription von ARC wird schnell und stark durch eine verstärkte neuronale Aktivität induziert. Um die Untersuchung der Arc-Expression in lebenden Neuronen mit Hilfe von zwei Photomikroskopien zu ermöglichen, verwenden wir eine Knockin-Mauslinie, in der ein GFP-Reporter unter die Kontrolle des endogenen Arc-Promotors gestellt wird. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Vorbereitungen und bildgebenden Verfahren zur Verfolgung von erlebten abhängigen Lichtbogen-GFP-Expressionsmustern in neuronalen Ensembles im lebenden Tier. Zuerst beschreiben wir die Tiervorbereitung, die für diese Technik erforderlich ist.

Ein Arc-GFP-Tier wird einer Operation an einem Schädelfenster unterzogen und erholt sich etwa zwei Wochen lang von der Operation. Anschließend wird die Qualität des Schädelfensters überprüft und wenn Neuronen durch das Fenster abgebildet werden können, wird das Tier bis zum Beginn der Verhaltens- und Zwei-Photonen-Bildgebungsexperimente in eine qua-Umgebung gebracht. Diese Tiere werden dann immer wieder mit zwei Fotomikroskopien abgebildet.

Nachdem die gewünschten Verhaltensparadigmen im Laufe mehrerer Tage abgeschlossen sind, reinigen Sie alle Werkzeuge in einem Heißperlensterilisator. Reinigen Sie vor der aseptischen Operation die Operationsstelle mit 70% Ethanol und legen Sie saubere Tropftücher ab. Betäuben Sie das Tier mit einer 1,2%igen Everton-Lösung, die mit 0,02 Millilitern pro Gramm intraperitoneal verabreicht wird.

Überprüfen Sie den Anästhesiegrad mit Schwanz- oder Zehenkneifungen, um eine vollständige Sedierung zu gewährleisten. Bedecken Sie die Augen des Tieres mit steriler Augensalbe und injizieren Sie Dexamethason 0,2 Milligramm pro Kilogramm und Carprofen fünf Milligramm pro Kilogramm subkutan. Rasieren Sie die Haare über dem Schädel zwischen den Ohren und sterilisieren Sie die Haut mit Betadine-Peeling und drei abwechselnden Tupfern mit 70%igem Ethanol, bringen Sie das Tier in eine stereotaktische Operationsstufe mit Ohrstangen mit einem auf 37 Grad eingestellten Wasserzirkulationsheizkissen unter dem Tier.

Überprüfen Sie regelmäßig die Anästhesiewerte des Tieres und ergänzen Sie die ursprüngliche Anästhesiedosis nach Bedarf. Injizieren Sie 200 Mikroliter 0,5% Marcain unter die Kopfhaut, um den Bereich zu betäuben, die Haut einzuschneiden und den Hautlappen über dem Schädel zu entfernen. Entfernen Sie das Periost und trocknen Sie den Bereich mit sauberen Wattestäbchen.

Verwenden Sie einen Hochgeschwindigkeits-Dentalbohrer mit einem 0,5-Millimeter-Fräser, um je nach Bedarf einen Kreis mit einem Durchmesser von drei bis fünf Millimetern über die gewünschte Gehirnregion zu skizzieren. Befeuchten Sie die Bohrstelle regelmäßig mit steriler 0,9%iger Kochsalzlösung und entfernen Sie Knochenstaub mit sauberen Wattestäbchen. Wenn der Knochen blutet, verwenden Sie mit steriler Kochsalzlösung getränkten Gelschaum, um die Blutung abzutupfen, und warten Sie, bis sie aufhört.

Wenn die letzte Knochenschicht erreicht ist, heben Sie die Knocheninsel an und entfernen Sie sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze. Es kann vorkommen, dass durale Ansätze an der unteren Schale des Knochens vorhanden sind. Wenn Ihre Fensterkreuze aus Knochennaht bestehen, sollten diese vorsichtig entfernt werden.

Wenn der Knochenlappen angehoben wird, rollen Sie den feuchten und gelierten Schaum vorsichtig über die freiliegende Dura, um ihre Oberfläche zu reinigen, und warten Sie, bis die Duralblutung aufhört. Wenn sich Ihre Region unter einer Stelle befindet, an der eine Dura besonders dick ist, kann es erforderlich sein, die Dura darüber zu entfernen. Ist dies der Fall, trennen Sie die Dura vorsichtig mit einer sehr feinen Pinzette von der darunter liegenden PIA.

Machen Sie mit einer weiteren feinen Pinzette einen kleinen Schnitt in die angehobene Dura. Fassen Sie dann die Schnittkanten und spalten Sie die Dura vorsichtig. Die Dura ist dünn, aber stark, also achten Sie darauf, das Gehirn nicht mit den intakten Rändern der Dura zu schneiden.

Wenn Sie sich von Ihrem interessierenden Bereich entfernen, spülen Sie den Bereich großzügig mit sterilem A CSF oder steriler Kochsalzlösung ab. Wenn sich der umgebende Schädel stark um die freiliegende Dura oder Pia krümmt, verwenden Sie Schnellzellenkleber, um Lücken zu füllen, die keinen engen Kontakt mit dem Verrutschen der Fensterabdeckung in Bereichen haben, die nicht abgebildet werden. Legen Sie dann eine sterile Glasabdeckung vorsichtig über die Dura oder Pia.

Verwenden Sie Sano Acrylgel, um den Elastomerkleber und die Kanten des Glases abzudecken. Deckglas. Bedecken Sie den gesamten freiliegenden Schädel mit Sano-Cyanacrylat-Gel oder einer verrückten Mischung aus Kleber und Zahnzement.

Betten Sie eine speziell angefertigte Befestigungsstange für den Metallkopf am gegenüberliegenden Ende des Schädels ein. Bringen Sie das Tier nach einer intraperitonealen Injektion von fünf Milligramm Ketoprofen pro Kilogramm zur Schmerzbehandlung in eine warme Aufwachkammer zurück. Setzen Sie das Analgetikum zwei Tage nach der Operation fort.

Nach zwei Wochen postoperativer Genesung betäuben Sie das Tier mit ISO-Fluor. 5 % zur Induktion, 1,5 % zur Erhaltung. Montieren Sie es in einen speziell angefertigten Mikroskoptisch mit einem Kopffixierungsrahmen und überprüfen Sie das Schädelfenster auf optische Klarheit.

Unter Beleuchtung mit blauem Licht ist die Klarheit der Gehirnoberfläche der Blutgefäße ein starker Indikator für die Qualität der Schädelfenster. Wenn ihre Kanten scharf definiert sind, ist das Fenster wahrscheinlich verwendbar. Vor Beginn eines Verhaltensprotokolls sollte das Tier in einem einheitlichen häuslichen Käfig gehalten werden, um die täglichen Schwankungen zu minimieren.

Im Ausgangsbogen beginnen die GFP-Expressionsniveaus je nach interessierter Gehirnregion mit Verhaltenstrainings- oder Umweltstimulationsparadigmen. Zum Beispiel können Tiere über aufeinanderfolgende Tage verschiedenen visuellen Umgebungen ausgesetzt werden, um unterschiedliche Populationen von Neuronen im visuellen Kortex abzubilden, während die GFP-Fluoreszenz in Neuronen typischerweise zwei Stunden nach der Stimulation ihren Höhepunkt erreicht. Der experimentelle Zeitplan kann optimiert werden, um den Nachweis der ARC-GFP-Expression in Neuronen bei ihren maximalen Fluoreszenzniveaus zu erleichtern.

Nachdem ein Verhaltenstraining oder eine Umweltstimulation abgeschlossen ist, betäuben Sie das Tier mit ISO-Fluor 5 % zur Induktion und 1,5 % zur Erhaltung. Montieren Sie das Tier auf dem speziell angefertigten Mikroskoptisch mit Kopfbefestigungsrahmen. Unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop wird die Kopfposition des Tieres am Kopffixationsrahmen fixiert, der mit Hilfe der implantierten Metallstange am Schädel direkt mit dem Tisch verbunden ist.

ISO-Fluor und Sauerstoff werden der Maus kontinuierlich durch einen Nasenkonus zugeführt. Die Körpertemperatur wird mit einem Heizkissen aufrechterhalten. Stellen Sie sicher, dass die Mikroskopdetektoren vor Umgebungslicht geschützt sind.

Wenn Sie Zwei-Photonen-Laserscanning in einem dunklen Raum durchführen, verwenden Sie für die Bildgebung eine Wasserimmersionslinse mit 20 x oder 25 x 1,05 numerischer Apertur für die Bildgebung. Nehmen Sie zunächst unter Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung mit einer CCD-Kamera ein Bild der Oberflächenblutgefäßmuster über der interessierenden Gehirnregion auf. Starten Sie für die zukünftige Bildausrichtung das Zwei-Photonen-Laserscanning, um einen 3D-Bildstapel zu erfassen.

Die Anregungswellenlänge des Zwei-Photonen-Lasers ist auf 920 Nanometer und die Leistung auf etwa 50 Nanometer eingestellt. Die emittierte Fluoreszenz von Milliwatt wird gleichzeitig sowohl in einem grünen als auch in einem roten Kanalbogen detektiert. Die GFP-Fluoreszenz tritt nur im grünen Kanal auf, während die Gewebeautofluoreszenz in beiden Kanälen auftritt.

Typische Bildstapel haben Abmessungen von ca. 320 x 300, 20 x 100 Mikrometern, eine horizontale Auflösung von 0,5 Mikrometern pro Pixel und eine vertikale Auflösung von drei Mikrometern pro Pixel. Nachdem Sie den Bildstapel erfasst haben, bringen Sie das Tier in seinen Heimatkäfig zurück. Stören Sie das Tier nicht bis zur nächsten Verhaltens- und Bildgebungssitzung.

Wiederholen Sie das Verhalten und die Bildgebung wie gewünscht über mehrere Tage hinweg. Verwenden Sie das zuvor aufgenommene Bild der Blutgefäßoberfläche des Gehirns, um sich wieder an derselben Bildgebungsstelle zu orientieren. Die Stärke dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung von Veränderungen der Arc-Genexpression in derselben Gruppe von Neuronen über mehrere Tage hinweg ermöglicht.

Im lebenden Tier. Standard-HISTOCHEMISCHE Methoden können eine Einzelzellauflösung erreichen, aber keine Genexpressionsänderungen in denselben Neuronen über mehrere Tage verfolgen. Anderen bildgebenden Verfahren wie der Magnetresonanztomographie oder der nuklearen Bildgebung fehlt die Auflösung, um einzelne Neuronen abzubilden.

Daher kann keine andere bestehende Methode zur Messung von Genexpressionsänderungen sowohl mit der räumlichen Auflösung als auch mit der zeitlichen Abdeckung des hier beschriebenen bildgebenden Verfahrens mithalten. Ein kritischer Schritt bei diesem Eingriff ist die Schädelfenster-OP. Es sollte mit besonderer Sorgfalt durchgeführt werden, um ein Trauma des Gehirns oder das Zurückbleiben von Blut unter dem Glasdeckglas zu vermeiden.

Die Dura kann bei Bedarf entfernt werden. Denken Sie daran, dass die maximale Bildgebungstiefe im Gehirn bei diesem Verfahren von der Klarheit des Schädelfensters, dem Mikroskopaufbau und der Helligkeit der Fluoreszenzreporter abhängt. Dieses In-vivo-Bildgebungsprotokoll ist eine effiziente und vielseitige Methode, um Informationen über die mit Neuroplastizität zusammenhängende Molekulardynamik in einzelnen Neuronen als Reaktion auf verschiedene Verhaltenserfahrungen zu erhalten, und ist wahrscheinlich allgemein anwendbar auf transgene Mäuse, die Fluoreszenzreporter für andere erfahrene regulierte Gene tragen.