Name: Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung mechanischer Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mittels Atomic Force Microscopy. Diese Methode misst direkt Modul und Dicke in lebenden Zellen für Einblicke in Vaskularbiologie.

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Die Autoren bedanken sich bei Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire und Eric Lam für ihre Unterstützung bei diesem Projekt danken. Dieses Projekt wurde durch die NIH # PO1 HL 018208 finanziert.

Ein. Methoden 1,1 Zelle Flusskammer Ein Strömungskammer, in Abbildung 1 dargestellt, wurde so konstruiert, dass Zellen unter einer Scherung von 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) angebaut werden könnten und dann direkt mit einer Asylum MFP3D AFM (Santa Barbara, CA) transferiert. <ol><li> Für 15 min und dann Waschen mit destilliertem Wasser: Die Strömungskammer wurde für den Versuch durch erste Reinigung der Glasträger in Piranhalösung (H 2 O 2 03.01 H 2 SO 4) hergestellt. Sie wurden dann zu backenden trockenen und beschichtet mit Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in einem Vakuum-Abscheidungskammer. </li><li> Eine Silikondichtung geschnitten wurde mit einer Silhouette SD Schneidwerkzeug. Dies erlaubte uns, fein steuern die Strömungskammer Dimensionen zur Steuerung der Durchflussmenge und Scherbeanspruchung während des Zellwachstums. Typischerweise wurde eine 6,4 mm breite Kanal von 19 mm Länge aus einem Blech von 0,4 mm geschnitten Silikon. Der Durchfluss erforderlich Gattungente eine Schubspannung von 1,0 Pa (10 dyn / cm 2) wird unter der Annahme berechnet laminare Strömung in einem rechteckigen Kanal mit der Gleichung: </li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="0.737in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq1.jpg" /> wobei Q die Strömungsrate ist, τ die Scherspannung, μ die Viskosität des Mediums, hier angenommenen bis 1,0 mPa (0,01 dyn * sec / cm 2) ist, h die Höhe und w die Breite der Strömungskammer . <ol start="3"><li> Das obere Stück der Strömungskammer wurde mit der Dichtung in der Zellkulturschale ausgerichtet und befestigt mit einem Magnetring. Die Anordnung wurde mit Isopropylalkohol (IPA) für die Sterilisation gefüllt. </li><li> Der vollständige Flow-System montiert wurde. Die Strömungsöffnungen in der Zellkulturschale wurden Dreiwegeventile verbunden. Die Ventile wurden mit 30 ml Spritze öffnens. IPA wurde durch das System, das dann mit 30 ml McCoy-Medium mit 4% fötales Kälberserum (FCS) gewaschen wurde gespült. Das System wurde dann mit 20 ml der Vec Technologies Zellwachstumsmedium gefüllt. Covers wurden auf den Gipfeln der Spritzen gesetzt. Der Auffangbehälter Spritzenkappe hatte eine Nadel im Ort bis mittlere zurück an den Vorratsraum. Sterile 0,2 um Filter wurden auf den Lufteinlässen in den Deckeln angebracht, um eine Kontamination des Systems zu verhindern. Die Flusskammer war dann bereit für die Zell-Aussaat. </li></ol> 1,2 Cell Culture <ol><li> Menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC&#39;S) und Wachstumsmedium wurden aus Vec Technologies gekauft (Rensselaer, NY) und bis zur Konfluenz in einer T25-Flasche. </li><li> Das Wachstumsmedium wurde aus dem Kolben und der Monoschicht der Zellen mit 2 ml 2,5% Trypsin entfernt freigesetzt. Sobald die Zellen in Lösung waren, wurde die Trypsinierung durch Zugabe von 10 ml Zellkulturmedium in den Kolben gequencht. </li><li> The Zellsuspension wurde 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde entfernt. Die Zellen wurden in 1 ml Zellkulturmedium (mit Serum) zur Injektion in die Strömungskammer resuspendiert. </li><li> Die Zellsuspension (0,5 ml, ~ 50.000 Zellen) wurde in eine Spritze gefüllt und in die Strömungskammer durch eine Drei-Wege-Ventil. </li><li> Die Zellen konnten sich absetzen und sich an dem Glassubstrat für 2 Stunden vor dem Flow wurde gestartet. Die Zellen wurden unter Strömungsbedingungen in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 bis 5 Tage bis zur Konfluenz. </li></ol> 1,3 Cantilever Vorbereitung und Cell Einzug <ol><li> Spitzenlose AFM Kragarme (NanoWorld, Schweiz) wurden in Salpetersäure für 5 min gereinigt und funktionalisiert mit Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in einer Dampfabscheidungskammer. </li><li> Eine Lösung von 5 mg / ml NHS Gew.-Sulfo-LC-Biotin in gepufferte Salz Hanks-Lösung (HBSS) wurde hergestellt. Die Ausleger wurden in die Lösung für 15 min bis konjugierte untergetauchtenTor das Silan mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) Chemie. </li><li> Eine Lösung von Biotin freiem Medium wurde durch Inkubation 20 ml Vec Technologies Zellkulturmedium (einschließlich Serum) mit 200 ul Streptavadin Perlen für 12 Stunden hergestellt. Die Perlen wurden vom Medium mit einem Magnet entfernt und das Medium wurde durch einen 0,22 um Sterilfilter filtriert. </li><li> Die Strömungskammer wurde aus der Zellkulturschale entnommen und die Zellen wurden in 37 ° C Biotin-freien Medium gewaschen. </li><li> Eine Stammlösung von 1 ul 2,4 um Perlen mit Streptavidin in 1 ml Biotin Medium beschichtet war bereit, und 100 ul der Aktie wurde auf der Zellkulturschale aufgenommen. </li><li> Streptavidin-Beads wurden mit dem Ausleger von der Landung die Spitze auf der Glasoberfläche neben einer Sicke, Zurückziehen, Positionieren der Spitze des Auslegers über den Wulst und dann Drücken des Auslegers nach unten auf die Sicke und ruhenden für mehrere Sekunden aufgenommen. </li><li> Die Empfindlichkeit des Auslegers war Maßnahmed durch Einrücken auf einen Bereich aus blankem Glas und unter Verwendung der Steigung der Kurve, um die Auslenkung der Spitze als eine Funktion der Spannung eingestellt. </li><li> Die Federkonstante des freitragenden wurde dann aus einem thermischen Kalibrierung im MFP3D Software berechnet. </li><li> Der kalibrierte Cantilever wurde dann verwendet, um Gedankenstrich der Proben, wie in Abbildung 2 dargestellt. Diese 2,4 um Perlen bieten eine größere Kontaktfläche mit der Zelloberfläche so dass die mechanischen Eigenschaften der weichmagnetischen Schicht Glykocalix detektiert werden kann. Der Cantilever wurde über eine Zelle nahe dem Zellkern und einem weichen Ansatz der Spitze auf der Zelle wurde verwendet, um den Cantilever Höhe etwa 3 um oberhalb der Zelloberfläche gesetzt positioniert. Die Software wurde für 20 wiederholt Vertiefungen mit einer Rate von 1 um / sec auf eine maximale Kraft von 7 nN eingestellt. Ungefähr 6 Sekunden zwischen den aufeinanderfolgenden Kontakten vergangen. Es ist möglich, unterschiedliche Raten der Einbuchtung verwenden, um für zeitabhängigen Eigenschaften der Glykocalix testen, obwohl in diesen anfänglichen<html> Versuche, lediglich eine einzige Einbuchtung Rate (1 um / sec) wurde verwendet. </li></ol> 2. Einrückung Theory Einbuchtung in einen elastischen Halbraum mit einer Kugel mit dem Radius R kann unter Verwendung Hertz Theorie wo die Kraft der Einbuchtung, F, durch die Gleichung gegeben ist: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="1.157in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq2.jpg" /> Wobei δ die Eindringtiefe und E * die reduzierte Modul des Materials unter Test (Abbildung 3). Im Falle einer unendlich steif Eindringkörper Aufprallen eines einheitlichen elastischen Halbraum wird E * nach folgender Formel berechnet: 3/50163eq3.jpg &quot;/&gt; wobei E der Elastizitätsmodul und ν ist die Poisson-Verhältnis des Materials. Neuere Arbeiten mit Polymerfilmen wurde die Entwicklung einer zweischichtigen Modell zur Bestimmung des Moduls und der Dicke von dünnen Filmen 1 angeregt. Wir wenden dieses Modell auf Zellbiologie durch Behandeln der Glykocalix als einheitliche dünne weiche Folie auf der Oberfläche der Zelle Körper. Mit diesem Modell wird der reduzierte Elastizitätsmodul des Systems: <img alt="Gleichung 4" fo:content-width="2.85in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq4.jpg" /> Wobei E GC der Modul des Glykokalyx ist, E Zelle der Modul des Zellkörpers ist, P, Q und n Konstanten sind, der empirisch aus dem Polymer passt bestimmt, und z durch die folgende Gleichung gegeben: <p class="jove_content" fo:keep-Together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Gleichung 5" fo:content-width="1.257in" fo:src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50163/50163eq5.jpg" /> Wobei t die Dicke der Schicht Glykocalix. Eine schematische Darstellung dieser Parameter wird in 3 gezeigt. Das Modell wurde gezeigt, dass eine genaue Methode zur Bestimmung des Moduls und der Dicke eines dünnen Films auf Substrat 1 steifer sein. Diese Gleichung kann verwendet werden, um die Kurven aus Einbuchtung in Zellen erhalten passen, um den Modul und die Dicke des endothelialen Glycocalyx zu bestimmen, wie in Abbildung 4 dargestellt.

<ol><li>Clifford, C., Seah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoindentation+measurement+of+young%27s+modulus+for+compliant+layers+on+stiffer+substrates+including+the+effect+of+poisson%27s+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoindentation measurement of young's modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson's ratios.</a> Nanotechnology. , (2009).</li>
<li>Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+stimulates+incorporation+of+hyaluronan+into+endothelial+cell+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).</li>
<li>Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+distribution+relative+to+neutrophil+surface+topography+assessed+by+tirfm%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm.</a> Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).</li>
<li>Lipowski, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+as+a+barrier+to+leukocyte+adhesion+and+its+mediation+by+extracellular+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases.</a> Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).</li>
<li>Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+actin+stress+fibers+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of actin stress fibers in living cells.</a> Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).</li>
<li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+surface+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv.+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The endothelial surface layer.</a> Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).</li>
<li>vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx+protects+against+myocardial+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema.</a> Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).</li>
<li>Vink, H., Duling, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Luminal+Domains+for+Macromolecules%2C+Erythrocytes%2C+and+Leukocytes+Within+Mammalian+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries.</a> Circulation Research. 79, 581-589 (1996).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir verwendeten Werte aus dem Zwei-Schichten-Modells und Hertz Theorie, um die Wechselwirkung eines Leukozyten im Blut zirkulierenden Endothelzellen mit der Wand Modell berechnet. Wir haben errechnet, daß eine auf der Mikrovillus Leukozyten mit einem Durchmesser von 50 nm unter einer 10 pN Last würde Gedankenstrich etwa 150 nm in die Glykocalix, nur einen Bruchteil der Gesamtdicke. Dies zeigt an, dass der Glykocalix, mit Eigenschaften wie in diesem Experiment gemessen, eine erhebliche Barriere für Zell-Zell-Wechselwirku...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> McCoy-Medium </td><td> Gibco </td><td> 16600-082 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Endothelial Cell Growth Medium </td><td> Vec Technologies </td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> Gepoolten menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen </td><td> Vec Technologies </td><td> PHUVEC/T-25 </td><td></td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> JT Baker </td><td> 9681-02 </td><td></td></tr><tr><td> Wasserstoffperoxid </td><td> VWR </td><td> BDH3742-1 </td><td></td></tr><tr><td> (3-Aminopropyl) triethoxysilan </td><td> Aldrich </td><td> 440.140-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Isopropylalkohol </td><td> VWR </td><td> BDH8999-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Cellgro </td><td> 25-054-C1 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Buffered Salt Solution </td><td> Gibco </td><td> 14175-095 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21335 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavadin Perlen </td><td> Dynabeads </td><td> 112.06D </td><td></td></tr><tr><td> MFP-3D AFM </td><td> Asylum Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spitzenlose Cantilevers </td><td> Nanowelt </td><td> ARROW-TL1-50 </td><td></td></tr><tr><td> Silhouette SD </td><td> Quickutz </td><td> Silhouette-SD </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber </td><td> Stockwell Elastomerics </td><td> SE50-RS </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml Spritzen </td&gt; <td> Benton Dickinson </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 18 Gauge-Nadeln </td><td> Benton Dickinson </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> Erweiterung Sets </td><td> Hospira </td><td> 4429-48 </td><td></td></tr><tr><td> 4-Wege-Ventile </td><td> Teleflex </td><td> W21372 </td><td></td></tr><tr><td> Male / Female Hafen Caps </td><td> Smiths Medical </td><td> MX491B </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen </td><td> Watson-Marlow </td><td> 401U / D </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpen Tubing </td><td> Watson-Marlow </td><td> 903.0016.016 </td><td></td></tr><tr><td> Sterilfilter </td><td> Pall Life Science </td><td> 4652 </td><td></td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der mechanischen eigenschaften des endothelial glykokalyx mit atomic force microscopy

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Unser Verständnis der Wechselwirkung von Leukozyten und der Gefäßwand während Leukozyten-Abscheidung wird durch eine unvollständige Verständnis der mechanischen Eigenschaften des endothelialen Oberflächenschicht begrenzt. Es ist bekannt, dass Adhäsionsmolekülen auf Leukozyten ungleichmäßig relativ Oberflächentopographie 3 verteilt, begrenzt, dass Topographie Klebeverbindung Formation mit anderen Oberflächen 9, und dass physiologische Anpresskräfte (≈ 5,0 bis 10,0 pN pro Mikrovillus) können die Mikrovilli als komprimieren weniger als ein Drittel ihrer Ruhelänge, Erhöhung der Zugänglichkeit von Molekülen an die Gegenfläche 3, 7. Wir betrachten das Endothel als Zwei-Schichtstruktur, der relativ starren Zellkörper, plus der Glykocalix, eine weiche Schutzschicht Zuckerdragierung auf der luminalen Oberfläche 6. Es hat sich gezeigt, dass die Glykocalix kann als eine Barriere, um die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel Oberfläche 4 zu reduzieren handeln.In diesem Bericht werden wir damit beginnen, die Verformbarkeit der endothelialen Oberflächen behandeln zu verstehen, wie die endotheliale mechanische Steifigkeit könnte Bindung beeinflussen. Endothelzellen in statischer Kultur gezüchtet nicht Ausdruck eines robusten Glykokalyx, aber Zellen unter physiologischen Strömungsverhältnisse gewachsen beginnen ungefähre dem Glykokalyx in vivo 2 beobachtet. Der Modul der Endothelzelle Körpers gemessen wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf etwa 5 bis 20 kPa 5 sein. Die Dicke und Struktur der Glykocalix wurden mittels Elektronenmikroskopie untersucht 8, und der Modulus der Glykocalix wurde approximiert durch indirekte Methoden, aber nach unserem Wissen gibt es keine veröffentlichten Berichten einer direkten Messung der Glykocalix Modulus in lebenden Zellen . In dieser Studie zeigen wir Experimente Einbuchtung mit einem neuartigen AFM-Sonde auf Zellen, die unter Bedingungen kultiviert wurden, um ihre Expression zu ma Glycocalyx zu maximierenke direkte Messungen der Elastizitätsmodul und die Dicke des endothelialen Glykocalix.

In einem typischen Experiment wurden 20 Kraft-gegen-Entfernungskurven aus einem gegebenen Bereich der Zelle erhalten wird, typischerweise in der perinukleären Region, in der Nähe, aber nicht auf, den Kern (innerhalb ~ 2 um). Die Kurven wurden zur Berücksichtigung eines Probe Drift über die Dauer der Messung ausgerichtet und dann gemittelt, um Geräusche zu entfernen Cantilever, wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Kurven wurden analysiert und passen mit den zwei Schichten-Modell, das zur Bestimmung des Mo...

Die mechanischen Eigenschaften von Endothelzellen Glykokalyx wurden durch Einrückung mit Mikrometer große Kugeln auf AFM Cantilever gemessen. Endothelzellen wurden in einem benutzerdefinierten Kammer unter physiologischen Bedingungen kultiviert, um die Strömung Glykocalix Expression zu induzieren. Daten wurden unter Verwendung eines Dünnfilm-Modell, um die Dicke und Elastizitätsmodul Glykocalix bestimmen.

Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die mechanischen Eigenschaften der endothelialen Glykokalyx mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops oder eines FM zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Monoschicht von Endothelzellen unter physiologischer Strömung in einem Bioreaktor kultiviert wird, um in einem zweiten Schritt die Glykokalyxschicht aufzubauen. Mikrometergroße Kügelchen werden an einem FM-Cantilever befestigt und als Sonde verwendet, um die Widerstandskraft des Zellkörpers und der Glykokalyx während der Eindringung zu messen. Als nächstes werden die Eindringkurven mit einem Zwei-Schichten-Modell angepasst, um den Glykokalyxmodul zu bestimmen, und es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass der endotheliale Glykokalyx einen Modul von 0,7 Kilopascal und eine Dicke von 380 Nanometern hat, basierend auf der Zweischichtanalyse.Hallo, ich bin Rick Wa und Inhaber des Lehrstuhls für Biomedizinische Technik an der University of Rochester. In den letzten Jahren wurde viel über die mögliche Rolle der endothelialen Glykokalyx bei Entzündungen diskutiert, insbesondere darüber, ob sie als Schutzbarriere fungieren könnte, um unerwünschte Zelladhäsion während einer Entzündung zu verhindern. Einer der Schlüssel zur Lösung der Fragen, die dieses Problem umgeben, ist die Fähigkeit, die physikalischen Eigenschaften, nämlich die Dicke und die Steifigkeit dieser Schicht, sowohl unter normalen Bedingungen als auch während der Entzündungsreaktion zu messen.Ich bin Graham Marsh. Ich bin Doktorand am Department of Biomedical Engineering der University of Rochester. Das große Problem bei der Charakterisierung des endothelialen Glykokalyx ist, dass er unglaublich weich ist.Der Ansatz, den wir uns ausgedacht haben, besteht darin, eine große Perle an der Spitze des A- und A-FM-Auslegers zu befestigen, so dass die gemessenen Kräfte mit dem A-Mechanismus aufgelöst werden können, FM.To beginnen Sie mit diesem Verfahren, konstruieren Sie eine Strömungskammer wie die hier gezeigte, die in der Lage ist, Zellen unter einer Scherspannung von 1,0 Pascal zu züchten. Bereiten Sie die Strömungskammer für das Experiment vor, indem Sie zuerst die Objektträger 15 Minuten lang in Piranha-Lösung reinigen. Spülen Sie sie dreimal mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie 30 Minuten lang bei 70 Grad Celsius.Als nächstes beschichten Sie die Objektträger mit Aminopropyltrixi, Cy Lane oder Apte durch Aufdampfen. Geben Sie einen Milliliter Apte in einen Kolben, der mit der Probe an die Vakuumkammer angeschlossen ist. Dann den Kolben verschließen und eine Stunde lang ein Vakuum von 0,7 bar ziehen.Frischen Sie in dieser Zeit den Staubsauger dreimal auf. Schneiden Sie anschließend mit einem Silhouette SD-Schneidwerkzeug eine neue Strömungskammerdichtung aus einer 0,4 Millimeter dicken Silikonplatte aus. Der Kanal ist 6,4 Millimeter breit und 19 Millimeter lang, der Außendurchmesser ist auf 35 Millimeter gekürzt, damit er in die Anstaltskulturschale passt.Berechnen Sie anhand dieser Dimensionen die Durchflussrate, die erforderlich ist, um mit der hier gezeigten Gleichung eine reine Spannung von einem Pascal zu erzeugen. Q steht für die Durchflussrate. Tau ist der schiere Stress.Mu ist die Viskosität des Mediums. H ist die Kanalhöhe und W die Breite der Durchflusskammer. Der nächste Schritt besteht darin, das obere Teil der Durchflusskammer mit der Dichtung in der Zellkulturschale auszurichten und mit einem Magnetring zu sichern.Verbinden Sie die Durchflussöffnungen in der Zellkulturschale mit drei Wellenventilen mit Leitungen zu den 30-Milliliter-Spritzen. Sterilisieren Sie dann die gesamte Baugruppe, indem Sie sie fünf Minuten lang mit Isopropylalkohol spülen. Entfernen Sie dann den Alkohol und lassen Sie ihn im Taschentuch an der Luft trocknen.Kulturhaube 4%fötales Kälberserum in McCoy's Medium auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Nachdem Sie es fünf bis 10 Minuten trocknen gelassen haben, spülen Sie den restlichen Alkohol mit 30 Millilitern des vorgewärmten fötalen Wadenserums aus. Füllen Sie dann die Spritzen mit 20 Millilitern veek MCDB 1 31 Wachstumsmedium.Verschließen Sie anschließend die Spritzen, um eine Kontamination zu vermeiden. Wenn Sie das System aus der sterilen Haube herausnehmen, setzen Sie die Kappe für den Auffangbehälter mit der Nadel auf, die in die Flüssigkeit greift, um das Medium zurück in den vorgeschalteten Behälter zu ziehen. Befestigen Sie abschließend 0,2-Mikron-Sterilfilter an den Lufteinlässen an den Kappen, um die nächste menschliche Nabelvene zu entnehmen.Endothelzellen, die in einem T-25-Kolben zur Konfluenz gezüchtet werden. Die pelletierten Zellen werden bei 100.000 Zellen pro Milliliter in Medium resuspendiert und die Lösung in eine Spritze aufgezogen. Anschließend wird die Suspension durch das Dreiwegeventil in die Durchflusskammer eingespritzt.Lassen Sie die Zellen sich zwei Stunden lang absetzen und am Glassubstrat haften. Bevor Sie mit dem Fluss beginnen, stellen Sie den Bioreaktor und die Zellen in einen Inkubator, in dem sich die Zellen zwei Stunden lang absetzen und anhaften können. Ein Schlauch, der die Reservoirs mit einer Schlauchpumpe verbindet, wird durch die Rückseite des Inkubators geführt Sobald die Zellen verklebt sind, stellen Sie die Schlauchpumpe auf die gewünschte Durchflussrate ein.Das Medium bewegt sich zwischen den Reservoirs, wodurch eine Druckhöhe und eine Strömung durch den Bioreaktor entstehen, die eine Wandschubspannung von einem Pascal erzeugt. Lassen Sie die Zellen ein bis fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius bei kontinuierlichem Fluss inkubieren, bis die Kammer zusammenfließt. Um mit der Cantilever-Zubereitung zu beginnen, reinigen Sie eine Spitze und einen FM-Cantilever fünf Minuten lang in Salpetersäure, gefolgt von einer Spülung mit destilliertem Wasser.Nach dem Trocknen wird der Ausleger mit apdi in einer Aufdampfkammer funktionalisiert, wie zuvor für die Objektträger gezeigt. Bereiten Sie dann eine Lösung von fünf Milligramm pro Milliliter nach Gewicht NHS Sulf O lc, Biotin in Hanks gepufferter Salzlösung vor. Tauchen Sie die Ausleger 15 Minuten lang in die Lösung.Diese Reaktion konjugiert das CY- und das Endhydroxyoxid und präsentiert Biotinmoleküle auf der Oberfläche der Cantilever. Beginnen Sie am Vortag mit der Zubereitung einer Lösung aus biotinfreiem Medium, indem Sie 20 Milliliter vexcel-Nährmedium mit 20 % Serum mit 200 Mikrolitern strept ENC-beschichteten Kügelchen kombinieren und 12 Stunden lang unter Rotation inkubieren. Am Tag des Experiments.Ziehen Sie die Magnetkügelchen mit einem Magneten zwei Minuten lang an den Boden des Röhrchens und übertragen Sie den Überstand mit biotinfreiem Medium in ein neues Röhrchen. Sterilisieren Sie das Medium, indem Sie es durch einen 0,22-Mikrometer-Filter leiten und in ein neues Röhrchen geben. Der nächste Schritt besteht darin, die Durchflusskammer aus der Zellkulturschale zu nehmen und die Zellen dann dreimal mit zwei Millilitern 37 Grad Celsius biotinfreiem Medium zu waschen.Fügen Sie dann ein Mikrogramm mit einem Durchmesser von 2,4 Mikrometern hinzu, abgestreifte Aden-beschichtete Kügelchen. Geben Sie eine Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in die Zellkulturschale und mischen Sie sie vorsichtig. Als nächstes kalibrieren Sie den A FM Tib, indem Sie ihn an einer Strippin-Perle befestigen und in eine glatte Glasoberfläche drücken.Um dies zu erreichen, landen Sie mit der Spitze auf der Glasoberfläche neben einer Perle, ziehen Sie die Spitze zurück, positionieren Sie dann die Spitze des Auslegers über der Perle und drücken Sie sie einige Sekunden lang nach unten. Verwenden Sie abschließend den kalibrierten Cantilever, um die Proben einzudrücken. Die 2,4 Mikrometer großen Kügelchen bieten eine größere Kontaktfläche mit der Zelloberfläche, so dass die mechanischen Eigenschaften der weichen Glykokalyxschicht leichter nachgewiesen werden können.Um diese Position zu erreichen, wird der Cantilever, der über einer Zelle in der Nähe des Zellkerns liegt, durch eine sanfte Annäherung der Spitze an die Zelle verwendet, um die Cantilever-Höhe etwa drei Mikrometer über der Zelloberfläche einzustellen. Ziehen Sie dann die Oberfläche 20 Mal mit einer Geschwindigkeit von einem Mikrometer pro Sekunde auf eine maximale Kraft von sieben ein. Nano-Newtons lassen sechs Sekunden Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Kontakten verstreichen.Berechnen Sie die Dicke der Glykokalyxschicht mit Gleichungen, die sich auf die Hertz-Theorie beziehen. Die Kraft des Eindrucks F wird durch diese Gleichung beschrieben, wobei Delta die Eindringtiefe ist. R ist der Kugelradius und estar ist der kombinierte Modul der unter Belastung stehenden Materialien.Um den kombinierten Elastizitätsmodul estar in zelluläre und Glykokalyxkomponenten zu trennen, behandeln Sie die Glykokalyxschicht als gleichmäßigen, dünnen weichen Film auf der Oberfläche des Zellkörpers und verwenden Sie das Zweischichtmodell von Clifford und C.In dieser Gleichung sind PQ und N konstant empirisch aus Polymeranpassungen. M ist eine Konstante aus dem Polymermodell, und Z bezieht sich auf die Dicke der dünnen Schicht oder Glykokalyxschicht durch die hier gezeigte Gleichung. Die mit dem in Nano-Newton gemessene A FM gemessene Kraft beginnt nach dem Kontakt mit der Oberfläche zuzunehmen und wird zunächst von der Komponente der Glykokalyxschicht dominiert.Sobald die Glykokalyxschicht komprimiert ist, wird der Zellkörper zum Hauptbestandteil der Verformung. Die blaue zweischichtige Anpassungslinie wurde berechnet, indem vier freie Parameter angepasst wurden, um sie mit den rot dargestellten Eindringdaten aus der verwendeten Gleichung abzugleichen: Der Zellmodul, der Glykokalyx, der Schichtmodul und die Schichtdicke der Glykokalyxschicht können alle bestimmt werden. Die Eigenschaften von 25 Zellen wurden in das hier gezeigte Histogramm zusammengestellt.Der durchschnittliche Glykokalyxschichtmodul wurde auf 0,7 plus oder minus 0,5 Kipa cal bestimmt, und die Glykokalyxschichtdicke wurde auf 380 plus oder minus 50 Nanometer bestimmt. Dieser Ansatz gibt uns das Werkzeug, das wir brauchten, um grundlegende Fragen über die Rolle der Glykokalyx bei der Regulierung der Zelladhäsion während einer Entzündung zu beantworten. Wir sind nun in der Lage, Fragen darüber zu beantworten, wie sich die Eigenschaften des Glykokalyx während einer Entzündung verändern.Mit welchen Mitteln diese Veränderungen erreicht werden. Dieser Ansatz kann auf verschiedene Weise erweitert werden. Zum Beispiel könnte man damit neuartige, ausgefeiltere theoretische Beschreibungen der Eigenschaften des Glykokalyx testen.Oder auf einer praktischeren Ebene könnte man dies nutzen, um bioinspirierte Oberflächenbeschichtungen zu testen, die implantierbare Geräte vor Immunreaktionen im Wirt schützen sollen. Vielen Dank für Ihr Interesse an unserer Arbeit.

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