Die Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Endothelial Glykokalyx mit Atomic Force Microscopy

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die mechanischen Eigenschaften der endothelialen Glykokalyx mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops oder eines FM zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Monoschicht von Endothelzellen unter physiologischer Strömung in einem Bioreaktor kultiviert wird, um in einem zweiten Schritt die Glykokalyxschicht aufzubauen. Mikrometergroße Kügelchen werden an einem FM-Cantilever befestigt und als Sonde verwendet, um die Widerstandskraft des Zellkörpers und der Glykokalyx während der Eindringung zu messen. Als nächstes werden die Eindringkurven mit einem Zwei-Schichten-Modell angepasst, um den Glykokalyxmodul zu bestimmen, und es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass der endotheliale Glykokalyx einen Modul von 0,7 Kilopascal und eine Dicke von 380 Nanometern hat, basierend auf der Zweischichtanalyse.

Hallo, ich bin Rick Wa und Inhaber des Lehrstuhls für Biomedizinische Technik an der University of Rochester. In den letzten Jahren wurde viel über die mögliche Rolle der endothelialen Glykokalyx bei Entzündungen diskutiert, insbesondere darüber, ob sie als Schutzbarriere fungieren könnte, um unerwünschte Zelladhäsion während einer Entzündung zu verhindern. Einer der Schlüssel zur Lösung der Fragen, die dieses Problem umgeben, ist die Fähigkeit, die physikalischen Eigenschaften, nämlich die Dicke und die Steifigkeit dieser Schicht, sowohl unter normalen Bedingungen als auch während der Entzündungsreaktion zu messen.

Ich bin Graham Marsh. Ich bin Doktorand am Department of Biomedical Engineering der University of Rochester. Das große Problem bei der Charakterisierung des endothelialen Glykokalyx ist, dass er unglaublich weich ist.

Der Ansatz, den wir uns ausgedacht haben, besteht darin, eine große Perle an der Spitze des A- und A-FM-Auslegers zu befestigen, so dass die gemessenen Kräfte mit dem A-Mechanismus aufgelöst werden können, FM.To beginnen Sie mit diesem Verfahren, konstruieren Sie eine Strömungskammer wie die hier gezeigte, die in der Lage ist, Zellen unter einer Scherspannung von 1,0 Pascal zu züchten. Bereiten Sie die Strömungskammer für das Experiment vor, indem Sie zuerst die Objektträger 15 Minuten lang in Piranha-Lösung reinigen. Spülen Sie sie dreimal mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie 30 Minuten lang bei 70 Grad Celsius.

Als nächstes beschichten Sie die Objektträger mit Aminopropyltrixi, Cy Lane oder Apte durch Aufdampfen. Geben Sie einen Milliliter Apte in einen Kolben, der mit der Probe an die Vakuumkammer angeschlossen ist. Dann den Kolben verschließen und eine Stunde lang ein Vakuum von 0,7 bar ziehen.

Frischen Sie in dieser Zeit den Staubsauger dreimal auf. Schneiden Sie anschließend mit einem Silhouette SD-Schneidwerkzeug eine neue Strömungskammerdichtung aus einer 0,4 Millimeter dicken Silikonplatte aus. Der Kanal ist 6,4 Millimeter breit und 19 Millimeter lang, der Außendurchmesser ist auf 35 Millimeter gekürzt, damit er in die Anstaltskulturschale passt.

Berechnen Sie anhand dieser Dimensionen die Durchflussrate, die erforderlich ist, um mit der hier gezeigten Gleichung eine reine Spannung von einem Pascal zu erzeugen. Q steht für die Durchflussrate. Tau ist der schiere Stress.

Mu ist die Viskosität des Mediums. H ist die Kanalhöhe und W die Breite der Durchflusskammer. Der nächste Schritt besteht darin, das obere Teil der Durchflusskammer mit der Dichtung in der Zellkulturschale auszurichten und mit einem Magnetring zu sichern.

Verbinden Sie die Durchflussöffnungen in der Zellkulturschale mit drei Wellenventilen mit Leitungen zu den 30-Milliliter-Spritzen. Sterilisieren Sie dann die gesamte Baugruppe, indem Sie sie fünf Minuten lang mit Isopropylalkohol spülen. Entfernen Sie dann den Alkohol und lassen Sie ihn im Taschentuch an der Luft trocknen.

Kulturhaube 4%fötales Kälberserum in McCoy's Medium auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Nachdem Sie es fünf bis 10 Minuten trocknen gelassen haben, spülen Sie den restlichen Alkohol mit 30 Millilitern des vorgewärmten fötalen Wadenserums aus. Füllen Sie dann die Spritzen mit 20 Millilitern veek MCDB 1 31 Wachstumsmedium.

Verschließen Sie anschließend die Spritzen, um eine Kontamination zu vermeiden. Wenn Sie das System aus der sterilen Haube herausnehmen, setzen Sie die Kappe für den Auffangbehälter mit der Nadel auf, die in die Flüssigkeit greift, um das Medium zurück in den vorgeschalteten Behälter zu ziehen. Befestigen Sie abschließend 0,2-Mikron-Sterilfilter an den Lufteinlässen an den Kappen, um die nächste menschliche Nabelvene zu entnehmen.

Endothelzellen, die in einem T-25-Kolben zur Konfluenz gezüchtet werden. Die pelletierten Zellen werden bei 100.000 Zellen pro Milliliter in Medium resuspendiert und die Lösung in eine Spritze aufgezogen. Anschließend wird die Suspension durch das Dreiwegeventil in die Durchflusskammer eingespritzt.

Lassen Sie die Zellen sich zwei Stunden lang absetzen und am Glassubstrat haften. Bevor Sie mit dem Fluss beginnen, stellen Sie den Bioreaktor und die Zellen in einen Inkubator, in dem sich die Zellen zwei Stunden lang absetzen und anhaften können. Ein Schlauch, der die Reservoirs mit einer Schlauchpumpe verbindet, wird durch die Rückseite des Inkubators geführt Sobald die Zellen verklebt sind, stellen Sie die Schlauchpumpe auf die gewünschte Durchflussrate ein.

Das Medium bewegt sich zwischen den Reservoirs, wodurch eine Druckhöhe und eine Strömung durch den Bioreaktor entstehen, die eine Wandschubspannung von einem Pascal erzeugt. Lassen Sie die Zellen ein bis fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius bei kontinuierlichem Fluss inkubieren, bis die Kammer zusammenfließt. Um mit der Cantilever-Zubereitung zu beginnen, reinigen Sie eine Spitze und einen FM-Cantilever fünf Minuten lang in Salpetersäure, gefolgt von einer Spülung mit destilliertem Wasser.

Nach dem Trocknen wird der Ausleger mit apdi in einer Aufdampfkammer funktionalisiert, wie zuvor für die Objektträger gezeigt. Bereiten Sie dann eine Lösung von fünf Milligramm pro Milliliter nach Gewicht NHS Sulf O lc, Biotin in Hanks gepufferter Salzlösung vor. Tauchen Sie die Ausleger 15 Minuten lang in die Lösung.

Diese Reaktion konjugiert das CY- und das Endhydroxyoxid und präsentiert Biotinmoleküle auf der Oberfläche der Cantilever. Beginnen Sie am Vortag mit der Zubereitung einer Lösung aus biotinfreiem Medium, indem Sie 20 Milliliter vexcel-Nährmedium mit 20 % Serum mit 200 Mikrolitern strept ENC-beschichteten Kügelchen kombinieren und 12 Stunden lang unter Rotation inkubieren. Am Tag des Experiments.

Ziehen Sie die Magnetkügelchen mit einem Magneten zwei Minuten lang an den Boden des Röhrchens und übertragen Sie den Überstand mit biotinfreiem Medium in ein neues Röhrchen. Sterilisieren Sie das Medium, indem Sie es durch einen 0,22-Mikrometer-Filter leiten und in ein neues Röhrchen geben. Der nächste Schritt besteht darin, die Durchflusskammer aus der Zellkulturschale zu nehmen und die Zellen dann dreimal mit zwei Millilitern 37 Grad Celsius biotinfreiem Medium zu waschen.

Fügen Sie dann ein Mikrogramm mit einem Durchmesser von 2,4 Mikrometern hinzu, abgestreifte Aden-beschichtete Kügelchen. Geben Sie eine Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter in die Zellkulturschale und mischen Sie sie vorsichtig. Als nächstes kalibrieren Sie den A FM Tib, indem Sie ihn an einer Strippin-Perle befestigen und in eine glatte Glasoberfläche drücken.

Um dies zu erreichen, landen Sie mit der Spitze auf der Glasoberfläche neben einer Perle, ziehen Sie die Spitze zurück, positionieren Sie dann die Spitze des Auslegers über der Perle und drücken Sie sie einige Sekunden lang nach unten. Verwenden Sie abschließend den kalibrierten Cantilever, um die Proben einzudrücken. Die 2,4 Mikrometer großen Kügelchen bieten eine größere Kontaktfläche mit der Zelloberfläche, so dass die mechanischen Eigenschaften der weichen Glykokalyxschicht leichter nachgewiesen werden können.

Um diese Position zu erreichen, wird der Cantilever, der über einer Zelle in der Nähe des Zellkerns liegt, durch eine sanfte Annäherung der Spitze an die Zelle verwendet, um die Cantilever-Höhe etwa drei Mikrometer über der Zelloberfläche einzustellen. Ziehen Sie dann die Oberfläche 20 Mal mit einer Geschwindigkeit von einem Mikrometer pro Sekunde auf eine maximale Kraft von sieben ein. Nano-Newtons lassen sechs Sekunden Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Kontakten verstreichen.

Berechnen Sie die Dicke der Glykokalyxschicht mit Gleichungen, die sich auf die Hertz-Theorie beziehen. Die Kraft des Eindrucks F wird durch diese Gleichung beschrieben, wobei Delta die Eindringtiefe ist. R ist der Kugelradius und estar ist der kombinierte Modul der unter Belastung stehenden Materialien.

Um den kombinierten Elastizitätsmodul estar in zelluläre und Glykokalyxkomponenten zu trennen, behandeln Sie die Glykokalyxschicht als gleichmäßigen, dünnen weichen Film auf der Oberfläche des Zellkörpers und verwenden Sie das Zweischichtmodell von Clifford und C.In dieser Gleichung sind PQ und N konstant empirisch aus Polymeranpassungen. M ist eine Konstante aus dem Polymermodell, und Z bezieht sich auf die Dicke der dünnen Schicht oder Glykokalyxschicht durch die hier gezeigte Gleichung. Die mit dem in Nano-Newton gemessene A FM gemessene Kraft beginnt nach dem Kontakt mit der Oberfläche zuzunehmen und wird zunächst von der Komponente der Glykokalyxschicht dominiert.

Sobald die Glykokalyxschicht komprimiert ist, wird der Zellkörper zum Hauptbestandteil der Verformung. Die blaue zweischichtige Anpassungslinie wurde berechnet, indem vier freie Parameter angepasst wurden, um sie mit den rot dargestellten Eindringdaten aus der verwendeten Gleichung abzugleichen: Der Zellmodul, der Glykokalyx, der Schichtmodul und die Schichtdicke der Glykokalyxschicht können alle bestimmt werden. Die Eigenschaften von 25 Zellen wurden in das hier gezeigte Histogramm zusammengestellt.

Der durchschnittliche Glykokalyxschichtmodul wurde auf 0,7 plus oder minus 0,5 Kipa cal bestimmt, und die Glykokalyxschichtdicke wurde auf 380 plus oder minus 50 Nanometer bestimmt. Dieser Ansatz gibt uns das Werkzeug, das wir brauchten, um grundlegende Fragen über die Rolle der Glykokalyx bei der Regulierung der Zelladhäsion während einer Entzündung zu beantworten. Wir sind nun in der Lage, Fragen darüber zu beantworten, wie sich die Eigenschaften des Glykokalyx während einer Entzündung verändern.

Mit welchen Mitteln diese Veränderungen erreicht werden. Dieser Ansatz kann auf verschiedene Weise erweitert werden. Zum Beispiel könnte man damit neuartige, ausgefeiltere theoretische Beschreibungen der Eigenschaften des Glykokalyx testen.

Oder auf einer praktischeren Ebene könnte man dies nutzen, um bioinspirierte Oberflächenbeschichtungen zu testen, die implantierbare Geräte vor Immunreaktionen im Wirt schützen sollen. Vielen Dank für Ihr Interesse an unserer Arbeit.