Name: Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Immunfärbung von Lymphozyten und dendritischen Zellen aus murinen Peyer-Plaques mittels Durchflusszytometrie und Kryosektion. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse immunologischer Zellpopulationen im Darm.

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Wir danken Renjie Song (Wadsworth Zentrum Durchflusszytometrie Core) für die Unterstützung bei Zellanalyse und Helen Johnson (Wadsworth Zentrum Tier Histopathologie Core) für die Herstellung von Paraffinschnitten. Wir danken Dr. Richard A. Cole (Wadsworth Zentrum Light Microscopy Core) für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und Bild-Sammlung. Wir möchten Andy Bentley (Wadsworth Center Foto und Illustration) für die Unterstützung mit Animationen zu bestätigen. MDJ wird von der Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship unterstützt. SA wird von einem Wadsworth Center-Health Research Inc. intramuralen Postdoc-Stipendium unterstützt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse HD061916 und GM082978 unterstützt.

Die Tiere wurden unter konventionellen, specific pathogen-freien Bedingungen untergebracht und wurden in voller Übereinstimmung mit Institutional Tier des Wadsworth Center Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien behandelt. Ein. Schlundsonde <ol><li> (Optional) Gavage Mausstamm der Wahl mit Antigen oder Mikroben von Interesse mit einem 22 G x1.5-in. blunt-end Fütterung Nadel (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Liefermengen nicht überschreiten sollte 400 ul pro Maus. </li></ol> 2. Isolierung von PP Cells für die Durchflusszytometrie <ol><li> Einschläfern Mäuse durch CO 2 Ersticken nach institutionellen Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss (IACUC) Richtlinien. </li><li> Reinigen Sie die Bauch mit 70% Ethanol oder betadine vor der Operation. Durchführen einer Standard-Laparotomie, die einen einzelnen (1 cm) unter Verwendung chirurgischer Qualität Einschnitt Scheren entlang der Mittellinie Anfang etwa 1,5 cm von der Basis der dem Brustkorb verbunden ist. Setzen Sie das proitoneal Hohlraum und Identifizierung der Blinddarm. Snip das Terminal Dünndarm bei der Ileum-cecal Kreuzung und entfernen Sie vorsichtig den Darm in seiner Gesamtheit. Darauf, nicht das Darmgewebe überstreckt, während es aus der Bauchhöhle entfernt wird. </li><li> Legen Sie den Dünndarm auf einem Bett aus feuchtem Küchenpapier oder Kimwipes. Befeuchten Sie den Dünndarm vorsichtig mit Kochsalzlösung, um Gewebe Austrocknung zu verhindern. Visuell identifizieren einzelnen PPs auf die anti-mesenterialen Seite des Darms (Abbildung 1). Typischerweise hat ein einziges Maus 5 zu 10 sichtbaren PPs die gleichmäßig aus dem Duodenum (proximal) an Ileum (distalen) verteilt. Im Durchschnitt werden vier Mäuse Ausbeute 23 PPs. </li><li> Mit gebogenen chirurgischen Schere vorsichtig Verbrauchsteuern einzelnen PPs und legen Sie sie in Balanced Salt kalten Hanks Solution (HBSS). Hinweis, sollte die Schere curve-Seite platziert werden bis knapp oberhalb der PP und dann sanft auf das Gewebe aufgebracht. Excise nur die PP (nicht umlieng Gewebe) und Transfer zum kaltem HBSS. Hinweis: Alle Inkubationen und Zentrifugationsschritte ab diesem Zeitpunkt in Abschnitt 2 bei 4 erfolgen ° C, um die Zellviabilität zu bewahren. </li><li> Übertragen PPs in 5 ml Spleen Dissoziation Medium und Inkubation für 15-20 min bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bei 250 Umdrehungen pro Minute. Längere Inkubationszeit wird sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> Um eine einzelne Zellsuspension, erfolgt PPs auf einem sterilen (autoklaviert) 70 um Nylonnetz Zellsieb erzeugen und zwangsweise mahlen das Gewebe in das Netz mit Hilfe der Basis eines Kolbens aus einem 1 ml-Spritze. Alternativ Sandwich PPs zwischen zwei frosted sterile Objektträger aus Glas (autoklaviert in Umschläge) und schonend zu mahlen Geweben mit einer hin-und herbewegt. Verwenden Sie eine sterile Pipette, um die Zellsuspension in ein 5 ml-Falcon-Röhrchen übertragen. </li><li> Hinzufügen EDTA bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu der Zellsuspension. Inkubieren auf einer Wippe5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Dekantieren Zellsuspension durch einen zweiten 70 um Zellsieb zu entfernen alle verbleibenden zellulären Aggregaten oder Gewebereste. Sammeln Sie Zellen in einer 15 oder 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Betreff Zellen sanfte Zentrifugation (5 min bei 500 xg). Dekantieren Überstand und resuspendieren Zellen in Strömungsrichtung Puffer, der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1% fötalem Kälberserum (FCS) ist. </li><li> Um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen, zu verdünnen Zellen 01.10 in Trypanblau und Sichtprüfung Zellen mit einem Lichtmikroskop und ein Hämozytometer. Alternativ kann ein Gräfin Zellenzähler (Invitrogen) oder ein ähnliches Instrument verwendet, um automatisch aufzuzählen Zellzahlen und Lebensfähigkeit werden. Beginnend mit 20-25 PPs, sollte dieses Protokoll Ausbeute&gt; 2,5 x 10 6 Zellen insgesamt. Dies entspricht ~ 0,8-1,2 x 10 6 Zellen pro Maus. </li></ol> Antibody Labeling der Zellen für die Durchflusszytometrie &lt;ol start = &quot;11&quot;&gt; <li> Verzichten Zellen (10 5 pro Vertiefung) in die Vertiefungen einer 96-well Rundboden Platten. </li><li> Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg) und dekantieren durch vorsichtiges Umdrehen der Platte. </li><li> Die Zellen in Fc Blockpuffer und inkubieren auf Eis für 15 min. Zwar gibt es eine Anzahl von kommerziell erhältlichen Fc Blockpuffer (zB Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32, BD Biosciences) sind, verwenden wir einfach verbrauchte Medium aus einer Ratten-B-Zell-Hybridom (ATCC 2.4.G2), die einen monoklonalen IgG 1 absondert gegen murine Fcy-Rezeptoren für diesen Schritt. </li><li> Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg) wie oben, und dekantieren Überstand durch vorsichtiges Umdrehen der Platte. </li><li> Hinzufügen fluorophorkonjugierten Antikörper direkt an Zellsuspensionen an gewünschten Verdünnung und Inkubation auf Eis für 30 min unter ständigem Schaukelstuhl. </li><li> Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg), und dekantierenÜberstand durch vorsichtiges Umdrehen der Platte. </li><li> Waschen der Zellen mit 100 ul Flusspuffer. </li><li> Zentrifuge Platte bei 1.000 xg für 5 min und dekantieren durch vorsichtiges Umdrehen der Platte. </li><li> Die Zellen 400 ul Fixation Puffer, der von 300 ul der Strömung Puffer und 100 ul 1% Paraformaldehyd in PHEM Puffer (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl 2 bei pH 6) besteht. </li><li> Gegenstand Zellen Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSCalibur oder gleichwertig. Analyse der Ergebnisse mit Cell Quest Pro Software Version 5.2. </li></ol> 3. Herstellung von PP Kryoschnitte <ol><li> Im Vorfeld des Gewebes Sammlung hinzuzufügen Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung zu 7x7x5 mm Kunststoff-Basis Formen. Bereiten auch einen Pool von flüssigem Stickstoff (&gt; 750 ml) in einem Dewar oder Eiskübel. </li><li> Euthanize Maus und führen eine laparotamy, wie oben beschrieben. Entfernen Darm und auf feuchten Papiertüchern. </li><li> Aufisolieren PPs für cyrosectioning, schneiden 0,5 cm quer Segmenten des Dünndarms mit einer einzigen PP und Transfer Gewebe bis zu einer Petrischale mit PBS. Vorsichtig spülen Lumen dieser Segmente mit PBS, um unerwünschte fäkale Verschmutzungen zu entfernen. </li><li> Zeigen Darmgewebe Segmente vertikal innerhalb Bodenformen enthalten Oktober Tauchen der Formen in flüssigem Stickstoff und erlauben Gewebe vollständig zu erstarren (1-2 min). Die Farbe des OCT wird von klar bis weiß wechseln, wenn das Gewebe vollständig gefroren ist. Für eine allmähliche Abkühlung (z. B. zu reduzieren Rissbildung des OCT), Hinweis tauchen Form in einem Bad von Isopentan mit flüssigem Stickstoff Dämpfe gekühlt:. Tragen Sie geeignete Schutzbrille bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Entfernen gefroren Bodenform aus dem flüssigen Stickstoff mit einer Pinzette und erlauben die Form bei Raumtemperatur gerade lang genug ist (~ 10-15 sec) erwärmen, damit sich die Ränder der OCT-Block zu erweichen. Um dann den gefrorenen Block Oktober ausdie Form, Invertzucker der Form und drücken Sie sanft auf den Rücken, um den Block auf ein sauberes 4 x 4 cm Stück Aluminiumfolie auszuwerfen. Unmittelbar wickeln Sie das Gewebe in der Folie und in einer markierten Probe Tasche in flüssigem Stickstoff oder mit Trockeneis gelagert. Alternativ zu übertragen Gewebe in einem Gefrierschrank (&lt;-20 ° C). Verwenden Sie das Gewebe innerhalb einer Woche, sonst werden die Blöcke spröde mit dem Alter. </li></ol> Kryoschneiden <ol start="6"><li> Kryoschnitt das Gewebe mit Hilfe eines Leica CM3050S cryomicrotome oder gleichwertig. Die Kammer Temperatur auf der Kryostat sollte bis -21 ° C eingestellt werden </li><li> Bemühen Sie sich um Abschnitte, die 12-14 um dick sind. </li><li> Sammeln Sie Schnitte auf Fisher SuperFrost Plus (oder gleichwertig) Objektträger aus Glas und Sichtprüfung mit einem Standard-Lichtmikroskop geringer Stärke. Wenn mehrere Abschnitte auf einer Folie gesammelt werden, sicherzustellen, dass sie gemeinsam für nachgeschaltete Färbung Anwendungen geclustert. </li><li> Shop trutscht er bei Raumtemperatur in einer Diashow box und im Idealfall nutzen sie innerhalb von ein paar Tagen. </li></ol> Antibody Labeling der Kryoschnitte und konfokale Mikroskopie Analyse <ol start="10"><li> Objektträger in Aceton (oder Methanol) in Gewebefärbung jar oder Racks für 2 min. Längerer Inkubation kann Gewebe vom Schlitten zu lösen. </li><li> Übertragen Folien neue Küvette überführen und 3 x waschen mit PBS-T (1X PBS mit 0,05% Tween-20) für 3 min je. </li><li> Umkreisen Sie die Abschnitte mit einem ImmEdge hydrophoben Stift. Dadurch wird sichergestellt, daß Reagenzien und Antikörper zu diesem Bereich werden während Inkubationen beschränkt bleiben. </li><li> Die Objektträger in Blockpuffer (2% Ziegenserum in PBS) für 30 min bei 37 ° C in einer feuchten Kammer, vor Licht geschützt. </li><li> Die Objektträger mit Fc-Block-Puffer (siehe oben) für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Dip Slides in PBS-T und trocken Gegend um Abschnitte mit Kimwipes oder andere saugfähige Gewebe.Achten Sie darauf, die tatsächlichen Gewebeschnitten berühren. </li><li> Overlay Gewebeschnitte mit primärer Antikörperlösung, Inkubation 30 min bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer. Primärantikörper wird typischerweise in Blockpuffer zu einer Endkonzentration von 20 ug / ml verdünnt. Die Verwendung von direkt-markierten primären Antikörper ist wünschenswert, da so viele wie drei Antikörper auch direkt bei diesem Schritt kombiniert werden. Direkt-markierten Antikörpern auch die Notwendigkeit für zusätzliche Antikörperinkubation Schritte. </li><li> Waschen Sie die Slides 3 mal (5 min jeweils) durch Eintauchen in PBS. </li><li> Falls erforderlich, inkubieren mit relevanten Sekundärantikörper für 30 min bei 37 ° C in einer feuchten Kammer. </li><li> Waschen Sie die Slides 3 mal (5 min jeweils) durch Eintauchen in PBS. </li><li> Die Objektträger 4 min in 1% Paraformaldehyd in PHEM Puffer, wie oben beschrieben. </li><li> Objektträger mit PBS für 1 min. </li><li> Dry Umgebung Abschnitte mit Kimwipes oder andere absorbierenent Gewebe. Achten Sie darauf, die tatsächlichen Gewebeschnitten berühren. Mit einer Pipette oder Pipette vorsichtig einen Tropfen verlängern Gold-Eindeckmedium direkt auf den Abschnitt. Tragen Sie eine Deckglas auf dem Eindeckmedium kümmern, um Blasen zu vermeiden. Verwenden Löschpapier, um überschüssiges Eindeckmedium absorbieren. </li><li> Seal Deckgläsern auf Objektträger mit kommerziellen Nagellack und an der Luft trocknen. </li><li> Anzeigen Dias mit einem Leica TCS SP5 oder gleichwertig konfokalen Mikroskop. </li></ol>

<ol><li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA%27s+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li>
<li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li>
<li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li>
<li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GALT%3A+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li>
<li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+distinct+Peyer%27s+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+%28MIP%29-3alpha%2C+MIP-3beta%2C+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li>
<li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li>
<li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peyer%27s+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li>
<li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer%27s+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li>
<li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li>
<li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li>
<li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer%27s+patch%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li>
<li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer%27s+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225(2011).</li>
<li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040(2012).</li>
<li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer%27s+patches+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Artikel, wir haben parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische und Funktionsanalyse und Kryoschnitten zur Immunfärbung vorgesehen. Beide Methoden sind sehr gut reproduzierbar und ohne weiteres zugänglich, vorausgesetzt ein Durchflußzytometer und Kryostat zur Verfügung. Erstmals Ermittler es sei darauf hingewiesen, dass, wenn im Vergleich zur Milz, insgesamt Zellausbeuten von PPs relativ mager sind. Dennoch, das Protokoll skizzieren wir in der Regel Renditen...

Peyer-Plaques (PP) sind makroskopische Aggregate der organisierten lymphatischen Follikel in der kleinen Darm von Menschen und Mäusen (Abbildung 1) und bilden die primären Standorten, an denen mukosalen Immunantworten gegen diätetische Antigene, symbiotischer Bakterien, mikrobielle Pathogene und orale Impfstoffe ausgelöst werden 1-4. Im Gegensatz zu anderen peripheren lymphatischen Gewebe wie den Mesenteriallymphknoten fehlt PPs afferenten Lymphgefäße. Als solche adaptive Immunantworten in PPs werden in Reaktion auf Antigene aus dem Darmlumen abgeleitet angetrieben. Die Abtastung wird die luminale Antigene durch den Follikel-assoziierten Epithel (FAE), die sowohl aus Enterozyten und Antigen-Sampling-Zellen als Zellen bekannt M besteht bewerkstelligt. Unterhalb des FAE im subepithelialen Kuppel (SED) Region liegt ein Netz von dendritischen Zellen (DCs) mit Makrophagen, B-Zellen und CD4 + T-Zellen 5-9 vermischt. Im Kern jedes PP lymphatischen follicle sind follikulären dendritischen Zellen (FDC) und einem B-Zell-reiche zentrales Keimzentrum, durch T-Zell-reichen Zonen interfollikulären flankiert. Antigen Abtasten durch PPs führt zur Entwicklung von IgA + B-Zellen und CD4 + Plasmablasten Effektorzellen und Gedächtniszellen dass Saatgut der umgebende Lamina propria und bereitzustellen Immunität gegenüber einem breiten Spektrum an mukosalen Eindringlinge. Sezieren die komplexen immunologischen Ereignissen mit Antigen Probenahme, Aufbereitung und Präsentation in PPs verbunden ist eine gewaltige Aufgabe, wenn man bedenkt, dass PP-Zellen nur einen winzigen Bruchteil der gesamten lymphatischen Zellen in der Darmschleimhaut bilden. Um in der in-vitro-Charakterisierung der Zellen in diesem Umfeld zu erleichtern, bieten wir ein Protokoll für die Vorbereitung insgesamt Maus PP-Zellen für die durchflusszytometrische und funktionelle Analyse, sowie ein Protokoll für die Vorbereitung PP Kryoschnitten für Immunfluoreszenz und Immunhistologie. Unser Protokoll für die Isolierung, Charakterisierung und Immunfärbung von mouse PP-Zellen ist an sich nicht neu, wie die Tatsache, dass es zahlreiche Hinweise aus mehr als 25 Jahren, dass diese Techniken zu nennen 5,6,9-11 belegt. Vielmehr bietet unser Protokoll eine optimierte (und visuelle)-Methode für Ermittler sammeln PPs für die erste Zeit. Die Techniken, die wir beschreiben, sind leicht zu beherrschen und leicht nachgeben große Anzahl von Zellen mit&gt; 90% der Lebensfähigkeit der Zellen. Die Kryoschneiden-Protokoll liefert reproduzierbare Schnittserien ideal für Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung eignet. Darüber hinaus ergänzt unser Protokoll zwei anderen kürzlich JoVE Artikel. Das erste, von Fukuda et al, beschreibt die Verwendung von ligierten ilealen Schleife Assays um die Aufnahme von pathogenen Bakterien, die durch M PP Zellen 12 zu beurteilen. Die andere, von Geem und Kollegen, beschreibt die Isolierung und Charakterisierung von DCs und Makrophagen aus der Maus Darmschleimhaut, sondern schließt ausdrücklich PPs aus ihrer Analyse 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Firma </td><td> Cat. # </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Oktober Compound </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 mm Bodenform </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge Pen </td><td> Vector Labs </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost Plus Objektträger </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> Edge-Rite Klinge </td><td> Thermo Scientific </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Maus CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Mouse CD19-PerCP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks balanced salt solution (HBSS) ohne Phenolrot </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um Zellsieb </td><td> BD Falcon </td><td&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Spleen Dissoziation Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> Ziegenserum </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> FC-Baustein </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes von Zelllinie 2.4.G2 erhalten </td></tr><tr><td> Curved Scissor </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> Kryostat </td><td> Leica </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gräfin Cell Counter </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematoxylin </td&gt; <td> Richard Allan </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin </td><td> Richard Allan </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> Formalin </td><td> Starplex Scientific </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung in dieser Studie verwendet. </td></tr></tbody></table>

isolierung und immunfärbung lymphozyten und dendritische zellen aus murine peyer-plaques

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer-Plaques (PP) sind integraler Bestandteil der Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT) und spielen eine zentrale Rolle in der intestinalen Immunüberwachung und Homöostase. Teilchenförmigen Antigene und Mikroben im Darmlumen werden kontinuierlich von PP M Zellen im Follikel-assoziierten Epithel (FAE) abgetastet und transportiert zu einer darunterliegenden Netz von dendritischen Zellen (DCs), Makrophagen und Lymphozyten. In diesem Artikel beschreiben wir, Protokolle, in denen murine PPs sind (i) dissoziiert in einzelne Zellsuspensionen und einer Durchflusszytometrie und (ii) für Kryoschneiden und Immunfärbung vorbereitet. Für Durchflusszytometrie, sind PPs mechanisch dissoziiert und dann durch 70 um Membranen zu Einzelzellsuspensionen frei von Epithelzellen und Großabfallfördereinrichtung erzeugen. Beginnend mit 20-25 PPs (von vier Mäusen), ergibt dies eine schnelle und reproduzierbare Methode eine Bevölkerung von&gt; 2,5 x 10 6 Zellen mit&gt; 90% der Lebensfähigkeit der Zellen. Für Kryoschneiden, frischely isolierten PPs werden in Optimal Cutting Temperature (OCT)-Medium, Snap-in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend geschnitten mit einem cryomicrotome eingetaucht. Gewebeschnitte (5-12 um) sind luftgetrocknet, fixiert mit Aceton oder Methanol, und dann zu Immunmarkierung unterziehen.

Die durchflusszytometrische Analyse von monodispersen Suspensionen von insgesamt PP Zellen zeigt eine klare Unterscheidung zwischen guten und schlechten Zellpräparaten. In guten Zellpräparationen mit über 80% Lebensfähigkeit zeigen die überwiegende Mehrzahl der Zellen mit hoher Vorwärtsstreuung (FSC), ein Indikator für eine hohe Zellvolumen und Low-Side-Scatter (SSC), ein Indikator für niedrige Zelle Granularität (Abbildung 2A). Bei diesem Experiment haben wir auch absichtlich eine &quot;schlechte Zellp...

Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lymphozyten und dendritische Zellen aus Neuronenzahler-Pflastern zu isolieren und immunzu färben, wobei zwei parallele experimentelle Ansätze verwendet werden. Erstens, schneiden Sie frische Zahlerpflaster aus der Maus und dem Dünndarm heraus. Dissoziieren Sie dann die Pflaster des Zahlers physisch, ernten Sie das Gewebe und leiten Sie es durch einen Netzfilter, um eine Einzelzellsuspension für die Durchflusszytometrie-Analyse zu erzeugen.Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und verteilen Sie die Aliquote in einer runden Bodenplatte mit 96 Vertiefungen. Als nächstes markieren Sie die Zellen mit Antikörpern gegen zelltypspezifische Oberflächenmarker. Fahren Sie sofort mit der durchflusszytometrischen Analyse fort, um die spezifischen Zelltypen aufzuzählen Isolieren Sie parallel die Pflaster des Kostenträgers und frieren Sie Gewebeproben ein.In OCT-Blöcken, Kryo-Schnitten, werden die Proben mit Antikörpern gegen zelltypspezifische Oberflächenmarker markiert und dann durch konfokale Scanning-Lasermikroskopie zusammen sichtbar gemacht. Diese Methoden werden B-Zellen, T-Zellen und dendritische Zellen in spezifischen Kompartimenten innerhalb des Patch-Gewebes des Zahlers quantifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Patch-Gewebe von PI extrem zerbrechlich ist und leicht beschädigt werden kann.Während der Handhabung. Legen Sie den frisch isolierten Dünndarm auf ein Bett aus feuchten Papiertüchern oder Kim-Tüchern. Befeuchten Sie dann den Dünndarm vorsichtig mit Kochsalzlösung, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern.Identifizieren Sie nun visuell die einzelnen Zahlerpflaster, die sich auf der anti-mesenterialen Seite des Darms befinden. In der Regel verfügt eine einzelne Maus über fünf bis 10 sichtbare Payer-Patches, die gleichmäßig vom Zwölffingerdarm bis zum Ileum verteilt sind. Bei Verwendung einer gebogenen chirurgischen Schere werden in der Regel die Pflaster des einzelnen Kostenträgers entfernt.Legen Sie sie in die Balance-Sortierlösung des kalten Strangs und halten Sie das Gewebe auf vier Grad Celsius, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Übertragen Sie dann die Pflaster des Zahlers in fünf Milliliter Milzdissoziationsmedium und schütteln Sie sie 15 bis 20 Minuten lang bei 250 U/min bei 37 Grad Celsius. Um dann eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, geben Sie die Probe auf ein steriles 70-Mikron-Zellsieb aus Nylon und mahlen Sie das Gewebe mit der Basis eines Kolbens aus einer Ein-cm³-Spritze gewaltsam in das Netz, um verbleibende Zellaggregate zu entfernen.Die Zellsuspension wird durch eine zweite 70-Mikron-Zelle umgefüllt, das Sieb eingesiebt und die Zellen in einem konischen 15- oder 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Geben Sie 10 bis die fünf Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Pelletzelle mit runder Bodenplatte, indem Sie fünf Minuten lang 1000-mal zentrifugieren. G.Dekantieren Sie dann den Überstand, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen.Nun werden die Zellen wieder in FC-Blockpuffer suspendiert und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Als nächstes fügen Sie Fluor-konjugierte Antikörper in der gewünschten Verdünnung direkt zu Zellsuspensionen hinzu und inkubieren auf Eiswaschzellen mit 100 Mikrolitern Flow-Puffer. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 400 Mikrolitern Fixierungspuffer, um die Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren und die Pflaster der Kostenträger für die Kryosektion zu isolieren.Schneiden Sie 0,5 Zentimeter lange Quersegmente des Dünndarms ab, die ein einzelnes Zahlerpflaster enthalten. Übertragen Sie das Gewebe in eine Petrischale, die PBS enthält. Platzieren Sie dann die Darmgewebesegmente vertikal in Basisformen, die OCT enthalten.Tauchen Sie die Formen in flüssigen Stickstoff und lassen Sie das Gewebe vollständig gefrieren. Entfernen Sie die gefrorenen Basisformen mit einer Pinzette aus dem flüssigen Stickstoff. Lassen Sie die Form gerade lange genug auf Raumtemperatur erwärmen, damit die Ränder des OCT-Blocks weich werden.Dann den gefrorenen OCT-Block aus der Form nehmen. Drehen Sie die Form um und drücken Sie vorsichtig auf die Rückseite, um den Block auf ein sauberes, vier mal vier Zentimeter großes Stück Aluminiumfolie auszuwerfen. Wickeln Sie das Gewebe sofort in die Folie ein und legen Sie es in einen beschrifteten Probenbeutel, der in flüssigem Stickstoff oder auf Trockeneis gelagert wird, mit einem Kryo-Mikrotom LI, einem CM 3, 0, 5 0 s, oder einem gleichwertigen Mikrotom.Stellen Sie die Kammertemperatur am Kryostaten auf minus 21 Grad Celsius ein. Schneiden Sie idealerweise Abschnitte mit einer Dicke von 12 bis 14 Mikrometern. Sammeln Sie die Schnitte auf Supercross plus Glasmikroskop-Objektträgern.Untersuchen Sie die Proben visuell mit einem Standard-Lichtmikroskop mit geringer Leistung. Tauchen Sie die Objektträger zwei Minuten lang in Aceton. Seien Sie sich bewusst, dass eine längere Inkubation dazu führen kann, dass sich Gewebe vom Objektträger löst.Waschen Sie die Proben dreimal mit PBST. Umkreisen Sie dann die Abschnitte mit einem hydrophoben Bildstift. Inkubieren Sie nun die Proben in Blockpuffer und überlagern Sie die Gewebeschnitte mit Primärantikörperlösung.Trocknen Sie den Bereich um die Schnitte mit Kim-Tüchern oder anderen saugfähigen Tüchern, ohne die eigentlichen Gewebeabschnitte zu berühren. Geben Sie mit einer Pipette oder einer Pipette vorsichtig einen Tropfen verlängertes Goldeinbettmittel direkt auf den Schnitt. Bringen Sie einen Glasdeckglas an, vermeiden Sie Luftblasen und tupfen Sie überschüssige Halterungen.Die mittlere Faxanalyse von monodispergierten Suspensionen von Patch-Zellen mit Gesamtkostenträgern zeigt eine klare Unterscheidung zwischen guten und schlechten Zellpräparaten bei guten Zellpräparaten. Mit einer Lebensfähigkeit von über 80 % weist die überwiegende Mehrheit der Zellen eine hohe Vorwärtsstreuung auf, was auf ein hohes Zellvolumen und eine geringe Seitenstreuung hinweist, die mit einer niedrigen Zellgranularität einhergeht. In diesem Experiment wurde bewusst eine schlechte Zellvorbereitung vorbereitet, um zu zeigen, dass in einer schlechten Population die Mehrheit der Zellen einen niedrigen FSC und einen hohen SSC aufweist und außerhalb des angegebenen Gangs R liegt.Diese Zellen durchlaufen wahrscheinlich eine Apoptose und/oder Nekrose. Hier ein Cocktail aus bis zu vier verschiedenen Fluors. Vier konjugierte monoklonale Antikörper zur Unterscheidung zwischen einer Vielzahl von Zelltypen.In den Kostenträger-Patch-Einzelzellsuspensionen wurden Einzelzellsuspensionen verwendet, die mit einem Cluster von Differenzierungsmarkern markiert wurden. CD 19 und B zwei 20 zeigen, dass B-Zellen etwa 60 % der Gated Payers ausmachen. Patch-Zellpopulations-spezifische T-Zell-Untergruppen können leicht durch doppelte Markierung mit Antikörpern gegen CD drei und CD vier oder CD drei und CD acht, CD vier positive und CD acht positive T-Zellen ausmachen etwa 23 % bzw. 9 % der gesamten Payer-Patch-Zellen aus.Die Teilmengen von DC, sie wären CD 11 C positiv und CD 1 0 3 positiv, können ebenfalls mit dieser Methode aufgezählt werden. CD 11 C-positive DCs machen etwa 8 % der gesamten Gated Population aus, was ungefähr 10.000 DCS pro Zahler-Patch entspricht. In der Population der CD 11 C-positiven Zellen waren etwa 4,7% doppelt positiv für B zwei 20 positiv.Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn die von den Zahlern geflickten Zellen von C 57 schwarzen sechs Mäusen entnommen werden. Schlechte Zellpräparate können zu höchst irreführenden Ergebnissen führen, vor allem, weil tote oder sterbende Zellen dazu neigen, Antikörper unspezifisch zu binden. Typischerweise führen diese zu einer Überrepräsentation von B 2 2 0 positiven und CD drei positiven doppelt positiven Zellen sowie B zwei 20 positiven B-Zellen und CD vier positiven T-Zellen doppelt positiven Zellen.Die Kryoschnitte der Mauszahlerpflaster sind sowohl für histopathologische Analysen als auch für die Immunmarkierung geeignet. Während die Aussagekraft von In-Schnitten eine höhere Auflösung auf zellulärer Ebene bietet, wenn sie mit h und e gefärbt werden, lassen sich die hellen und dunklen Zonen der Keimzentren des Payers-Patches in Kryoschnitten leichter abgrenzen. In diesem typischen Payers Patch Kryo-Abschnitt, anti CD drei Antikörper, markieren die T-Zellen anti CD 11 C Antikörper.Heben Sie dendritische Zellen und Anti-B zwei 20 Antikörper hervor. Markieren Sie die B-Zellen nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf diesem Gebiet, um zu verstehen, wie bestimmte Zelltypen wie dendritische Zellen in darmassoziierten lymphatischen Geweben auf Darmantigene und mikrobielle Krankheitserreger reagieren.Diese Informationen haben das Design und die Entwicklung von Schleimhautimpfstoffen beeinflusst.

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Research

Forschung

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Lernen Sie die Isolierung und Immunfärbung von Lymphozyten und dendritischen Zellen aus murinen Peyer-Plaques mittels Durchflusszytometrie und Kryosektion. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse immunologischer Zellpopulationen im Darm.

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

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