Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Lymphozyten und dendritische Zellen aus Neuronenzahler-Pflastern zu isolieren und immunzu färben, wobei zwei parallele experimentelle Ansätze verwendet werden. Erstens, schneiden Sie frische Zahlerpflaster aus der Maus und dem Dünndarm heraus. Dissoziieren Sie dann die Pflaster des Zahlers physisch, ernten Sie das Gewebe und leiten Sie es durch einen Netzfilter, um eine Einzelzellsuspension für die Durchflusszytometrie-Analyse zu erzeugen.

Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und verteilen Sie die Aliquote in einer runden Bodenplatte mit 96 Vertiefungen. Als nächstes markieren Sie die Zellen mit Antikörpern gegen zelltypspezifische Oberflächenmarker. Fahren Sie sofort mit der durchflusszytometrischen Analyse fort, um die spezifischen Zelltypen aufzuzählen Isolieren Sie parallel die Pflaster des Kostenträgers und frieren Sie Gewebeproben ein.

In OCT-Blöcken, Kryo-Schnitten, werden die Proben mit Antikörpern gegen zelltypspezifische Oberflächenmarker markiert und dann durch konfokale Scanning-Lasermikroskopie zusammen sichtbar gemacht. Diese Methoden werden B-Zellen, T-Zellen und dendritische Zellen in spezifischen Kompartimenten innerhalb des Patch-Gewebes des Zahlers quantifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Patch-Gewebe von PI extrem zerbrechlich ist und leicht beschädigt werden kann.

Während der Handhabung. Legen Sie den frisch isolierten Dünndarm auf ein Bett aus feuchten Papiertüchern oder Kim-Tüchern. Befeuchten Sie dann den Dünndarm vorsichtig mit Kochsalzlösung, um eine Austrocknung des Gewebes zu verhindern.

Identifizieren Sie nun visuell die einzelnen Zahlerpflaster, die sich auf der anti-mesenterialen Seite des Darms befinden. In der Regel verfügt eine einzelne Maus über fünf bis 10 sichtbare Payer-Patches, die gleichmäßig vom Zwölffingerdarm bis zum Ileum verteilt sind. Bei Verwendung einer gebogenen chirurgischen Schere werden in der Regel die Pflaster des einzelnen Kostenträgers entfernt.

Legen Sie sie in die Balance-Sortierlösung des kalten Strangs und halten Sie das Gewebe auf vier Grad Celsius, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Übertragen Sie dann die Pflaster des Zahlers in fünf Milliliter Milzdissoziationsmedium und schütteln Sie sie 15 bis 20 Minuten lang bei 250 U/min bei 37 Grad Celsius. Um dann eine Einzelzellsuspension zu erzeugen, geben Sie die Probe auf ein steriles 70-Mikron-Zellsieb aus Nylon und mahlen Sie das Gewebe mit der Basis eines Kolbens aus einer Ein-cm³-Spritze gewaltsam in das Netz, um verbleibende Zellaggregate zu entfernen.

Die Zellsuspension wird durch eine zweite 70-Mikron-Zelle umgefüllt, das Sieb eingesiebt und die Zellen in einem konischen 15- oder 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Geben Sie 10 bis die fünf Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Pelletzelle mit runder Bodenplatte, indem Sie fünf Minuten lang 1000-mal zentrifugieren. G.Dekantieren Sie dann den Überstand, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen.

Nun werden die Zellen wieder in FC-Blockpuffer suspendiert und 15 Minuten auf Eis inkubiert. Als nächstes fügen Sie Fluor-konjugierte Antikörper in der gewünschten Verdünnung direkt zu Zellsuspensionen hinzu und inkubieren auf Eiswaschzellen mit 100 Mikrolitern Flow-Puffer. Dann resuspendieren Sie die Zellen in 400 Mikrolitern Fixierungspuffer, um die Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren und die Pflaster der Kostenträger für die Kryosektion zu isolieren.

Schneiden Sie 0,5 Zentimeter lange Quersegmente des Dünndarms ab, die ein einzelnes Zahlerpflaster enthalten. Übertragen Sie das Gewebe in eine Petrischale, die PBS enthält. Platzieren Sie dann die Darmgewebesegmente vertikal in Basisformen, die OCT enthalten.

Tauchen Sie die Formen in flüssigen Stickstoff und lassen Sie das Gewebe vollständig gefrieren. Entfernen Sie die gefrorenen Basisformen mit einer Pinzette aus dem flüssigen Stickstoff. Lassen Sie die Form gerade lange genug auf Raumtemperatur erwärmen, damit die Ränder des OCT-Blocks weich werden.

Dann den gefrorenen OCT-Block aus der Form nehmen. Drehen Sie die Form um und drücken Sie vorsichtig auf die Rückseite, um den Block auf ein sauberes, vier mal vier Zentimeter großes Stück Aluminiumfolie auszuwerfen. Wickeln Sie das Gewebe sofort in die Folie ein und legen Sie es in einen beschrifteten Probenbeutel, der in flüssigem Stickstoff oder auf Trockeneis gelagert wird, mit einem Kryo-Mikrotom LI, einem CM 3, 0, 5 0 s, oder einem gleichwertigen Mikrotom

Stellen Sie die Kammertemperatur am Kryostaten auf minus 21 Grad Celsius ein. Schneiden Sie idealerweise Abschnitte mit einer Dicke von 12 bis 14 Mikrometern. Sammeln Sie die Schnitte auf Supercross plus Glasmikroskop-Objektträgern.

Untersuchen Sie die Proben visuell mit einem Standard-Lichtmikroskop mit geringer Leistung. Tauchen Sie die Objektträger zwei Minuten lang in Aceton. Seien Sie sich bewusst, dass eine längere Inkubation dazu führen kann, dass sich Gewebe vom Objektträger löst

Waschen Sie die Proben dreimal mit PBST. Umkreisen Sie dann die Abschnitte mit einem hydrophoben Bildstift. Inkubieren Sie nun die Proben in Blockpuffer und überlagern Sie die Gewebeschnitte mit Primärantikörperlösung.

Trocknen Sie den Bereich um die Schnitte mit Kim-Tüchern oder anderen saugfähigen Tüchern, ohne die eigentlichen Gewebeabschnitte zu berühren. Geben Sie mit einer Pipette oder einer Pipette vorsichtig einen Tropfen verlängertes Goldeinbettmittel direkt auf den Schnitt. Bringen Sie einen Glasdeckglas an, vermeiden Sie Luftblasen und tupfen Sie überschüssige Halterungen.

Die mittlere Faxanalyse von monodispergierten Suspensionen von Patch-Zellen mit Gesamtkostenträgern zeigt eine klare Unterscheidung zwischen guten und schlechten Zellpräparaten bei guten Zellpräparaten. Mit einer Lebensfähigkeit von über 80 % weist die überwiegende Mehrheit der Zellen eine hohe Vorwärtsstreuung auf, was auf ein hohes Zellvolumen und eine geringe Seitenstreuung hinweist, die mit einer niedrigen Zellgranularität einhergeht. In diesem Experiment wurde bewusst eine schlechte Zellvorbereitung vorbereitet, um zu zeigen, dass in einer schlechten Population die Mehrheit der Zellen einen niedrigen FSC und einen hohen SSC aufweist und außerhalb des angegebenen Gangs R liegt.

Diese Zellen durchlaufen wahrscheinlich eine Apoptose und/oder Nekrose. Hier ein Cocktail aus bis zu vier verschiedenen Fluors. Vier konjugierte monoklonale Antikörper zur Unterscheidung zwischen einer Vielzahl von Zelltypen.

In den Kostenträger-Patch-Einzelzellsuspensionen wurden Einzelzellsuspensionen verwendet, die mit einem Cluster von Differenzierungsmarkern markiert wurden. CD 19 und B zwei 20 zeigen, dass B-Zellen etwa 60 % der Gated Payers ausmachen. Patch-Zellpopulations-spezifische T-Zell-Untergruppen können leicht durch doppelte Markierung mit Antikörpern gegen CD drei und CD vier oder CD drei und CD acht, CD vier positive und CD acht positive T-Zellen ausmachen etwa 23 % bzw. 9 % der gesamten Payer-Patch-Zellen aus.

Die Teilmengen von DC, sie wären CD 11 C positiv und CD 1 0 3 positiv, können ebenfalls mit dieser Methode aufgezählt werden. CD 11 C-positive DCs machen etwa 8 % der gesamten Gated Population aus, was ungefähr 10.000 DCS pro Zahler-Patch entspricht. In der Population der CD 11 C-positiven Zellen waren etwa 4,7% doppelt positiv für B zwei 20 positiv.

Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn die von den Zahlern geflickten Zellen von C 57 schwarzen sechs Mäusen entnommen werden. Schlechte Zellpräparate können zu höchst irreführenden Ergebnissen führen, vor allem, weil tote oder sterbende Zellen dazu neigen, Antikörper unspezifisch zu binden. Typischerweise führen diese zu einer Überrepräsentation von B 2 2 0 positiven und CD drei positiven doppelt positiven Zellen sowie B zwei 20 positiven B-Zellen und CD vier positiven T-Zellen doppelt positiven Zellen.

Die Kryoschnitte der Mauszahlerpflaster sind sowohl für histopathologische Analysen als auch für die Immunmarkierung geeignet. Während die Aussagekraft von In-Schnitten eine höhere Auflösung auf zellulärer Ebene bietet, wenn sie mit h und e gefärbt werden, lassen sich die hellen und dunklen Zonen der Keimzentren des Payers-Patches in Kryoschnitten leichter abgrenzen. In diesem typischen Payers Patch Kryo-Abschnitt, anti CD drei Antikörper, markieren die T-Zellen anti CD 11 C Antikörper

Heben Sie dendritische Zellen und Anti-B zwei 20 Antikörper hervor. Markieren Sie die B-Zellen nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf diesem Gebiet, um zu verstehen, wie bestimmte Zelltypen wie dendritische Zellen in darmassoziierten lymphatischen Geweben auf Darmantigene und mikrobielle Krankheitserreger reagieren.

Diese Informationen haben das Design und die Entwicklung von Schleimhautimpfstoffen beeinflusst.