Bewertung von Muscle Funktion des Extensor digitorum longus Ex vivo Und Tibialis anterior In situ In Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die mechanischen Eigenschaften der Gliedmaßenmuskulatur von Mäusen genau zu bestimmen. Dies wird durch die Messung der kontraktilen und passiven Eigenschaften des Musculus extensor digitorum longus ex evo oder durch die Messung der kontraktilen Eigenschaften des Musculus tibialis anterior in situ erreicht, wodurch letztendlich Ergebnisse erzielt werden können, die ein besseres Verständnis der physiologischen Veränderungen bei verschiedenen Muskelerkrankungen ermöglichen und ob experimentelle Eingriffe die Muskelfunktion verbessern. Diese Methode bietet eine vollständige Bewertung der kontraktilen und passiven Eigenschaften des Skelettmuskels, die zwei untrennbare Aspekte der mechanischen Funktion des Skelettmuskels sind, die für die Körperbewegung notwendig sind.

Daher ist die visuelle Demonstration der Muskeldissektion von entscheidender Bedeutung, da sie viel Geschick und Manipulation erfordert. Der Hauptvorteil der NC two-Bewertung der kontraktilen Eigenschaft der großen Muskeln gegenüber bestehenden Methoden wie der in vitro SA besteht darin, dass der Institutsansatz den normalen Blutfluss und die Sauerstoffversorgung nicht stört. Ein Hauptanliegen bei der Erforschung der Muskelphysiologie ist die Sauerstoffversorgung des Zielmuskels.

In einer in vitro SA für große Muskeln, wie z.B. den TA-Muskel, erreicht die Sauerstoffdiffusion möglicherweise nicht das Zentrum des Muskels. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Therapie von Muskelerkrankungen, da die genaue Messung der mechanischen Funktion der Skelettmuskulatur auch zur Bewertung des Fortschreitens von Muskelerkrankungen und zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit neuartiger Genzell- und pharmakologischer Interventionen verwendet werden kann. Alle hier vorgestellten tierexperimentellen Verfahren wurden vom institutionellen Ausschuss für Tierpflege genehmigt.

Hierbei handelt es sich um eine Operation ohne Überleben, um das Muskeltestsystem für die ex vivo-Experimente einzurichten. Beginnen Sie mit dem Zusammenbau des Gewebebades, indem Sie den Autogenschlauch am Gewebebad des Wassermantels befestigen. Befestigen Sie die zusammengebaute Badewanne an der Muskelhalterung und setzen Sie das Nadelventil in den Badabfluss ein.

Schließen Sie die Gasleitung und die Wasserzirkulationsleitungen an das Bad an. Lassen Sie 30 Grad Celsius heißes Wasser in der Mantelkammer zirkulieren und fünf PSI Gas durch den Sauerstoffschlauch strömen. Füllen Sie das Bad mit Ringerpuffer und äquilibrieren Sie es mit einem gleichmäßigen Gasfluss.

Schalten Sie die Instrumente ein und laden Sie die DMC-Software, um den EDL-Muskelarterarter zu sezieren, indem Sie die Maus anästhesieren und auf ein Heizkissen legen. Rasieren Sie die hintere Extremität und prüfen Sie, ob es sediert ist, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen. Positionieren Sie die Maus auf dem Präparierbrett und ziehen Sie die Beinhaut ab.

Verwenden Sie zwei Schneidernadeln, um die hintere Gliedmaße im Fuß und im Gracilis-Muskel zu befestigen. Platzieren Sie eine Heizlampe über der Maus, um die Körperkerntemperatur auf 37 Grad Celsius zu halten, und verschmelzen Sie alle freiliegenden Muskeln kontinuierlich mit einem warmen Ringerpuffer unter einem Stereomikroskop, präparieren Sie die Haut, um die distale TA-Sehne und das Streckband freizulegen, und entfernen Sie vorsichtig die Faszien, die den TA-Muskel bedecken. Das Streckband durchtrennen, um die distale TA-Sehne zu lösen.

Schneiden Sie die distale TA-Sehne ab und verwenden Sie sie, um den TA-Muskel mit einem dünnen Stück mit Ringer's Buffer getränkter Watte zu entfernen. Stoppen Sie die Blutung, die durch einen Riss des TA-Muskelgefäßsystems verursacht wird. Als nächstes binden Sie mit einer Brotseidennaht einen doppelten quadratischen Knoten, gefolgt von einem Schlaufenknoten an der distalen Muskelsehnenverbindung des EDL-Muskels.

Machen Sie dann einen Schnitt im Bizeps-Fems-Muskel, um die proximale Sehne freizulegen, und binden Sie den gleichen Satz Knoten an der proximalen Muskelsehnenverbindung. Verwende die gleiche Nahtlinie, um einen doppelten quadratischen Knoten zu machen. Zur Befestigung des Hebelarms entweder an den proximalen oder den distalen Knoten.

Um den EDL-Muskel vorsichtig von der hinteren Gliedmaße zu präparieren. Zuerst wird die proximale Sehne oberhalb der Nahtknoten durchtrennt und das Gefäßsystem unter dem Muskel durchtrennt. Schneiden Sie dann die distale Sehne unterhalb des Nahtknotens ab.

Bedecken Sie die freiliegende Hintergliedmaße mit einem Stück Ringer, getränkter Baumwolle. Befestigen Sie abschließend den Haken am Hebelarm und richten Sie die Muskeln vertikal zwischen den Elektroden aus. Befestigen Sie die distale Nahtlinie am festen Stift.

Tauchen Sie den Muskel in Ringer-Puffer und stellen Sie die Ruhespannung auf 1,0 Gramm ein. Lassen Sie den Muskel mindestens 10 Minuten lang ins Gleichgewicht kommen. Um die kontraktilen Eigenschaften des EDL-Muskels zu messen, stellen Sie die Parameter für jedes der folgenden Protokolle in der DMC-Software ein, wie hier vorgestellt.

Für das erste Protokoll stabilisieren Sie den EDL-Muskel, indem Sie ihn dreimal bei 150 Hertz stimulieren, mit einer 62. Pause zwischen den Stimulationen. Für das zweite Protokoll lassen Sie die Muskeln zwei Minuten lang entspannen und bestimmen dann die optimale Länge oder LN, indem Sie den EDL-Muskel bei verschiedenen Ruhespannungen stimulieren. Verwenden Sie den digitalen Messschieber, um die optimale Länge des Muskels zwischen dem distalen und dem proximalen Knoten zu messen.

Lassen Sie den Muskel zwei Minuten lang entspannen. Für Protokoll drei stellen Sie die Ruhespannung auf L Null ein und messen Sie die Muskelkraft bei einer einzelnen Zuckungsstimulation. Bestimmen Sie die Twitch-Spannung oder pt, die Zeit bis zur Spitzenspannung oder TPT und die halbe Relaxationszeit der pt.

Lassen Sie den Muskel zwei Minuten lang entspannen. Um das vierte Protokoll durchzuführen, stellen Sie die Ruhespannung auf LN ein und messen Sie die Hodenmuskelkraft, die bei verschiedenen Stimulationsfrequenzen erzeugt wird. Messen Sie den P NAUGH dort, wo die Muskelkraft die maximale titanische Kraft erreicht.

Messen Sie die Zeit bis zum Höhepunkt der Spannung und die halbe Entspannungszeit für die Entspannung. Beginnen Sie das fünfte Protokoll, indem Sie den Muskel fünf Minuten lang entspannen lassen, die Ruhespannung auf L Naugh einstellen und 10 Zyklen exzentrischer Kontraktionen mit zwei Minuten Pause zwischen den Zyklen anwenden. Berechnen Sie den relativen Kraftverlust des PN nach jedem Zyklus der exzentrischen Kontraktion.

Zum Schluss lösen Sie den EDL-Muskel von der Apparatur und durchtrennen die Sehnen an der Nahtstelle. Bestimmen Sie das Muskelnassgewicht und berechnen Sie die Muskelquerschnittsfläche. Um die passiven Eigenschaften des EDL-Muskels zu messen, präparieren Sie den kontralateralen EDL-Muskel und befestigen Sie ihn an der Apparatur, wie zuvor gezeigt.

In diesem Video unterziehen Sie den Muskel einem sechsstufigen Dehnungsprotokoll, bei dem der Muskel in Schritten von 10 % auf 160 % Länge belastet wird. Analysieren Sie das Stress-Strain-Profil, um die viskose Eigenschaft der EDL-Muskeldehnung zu bewerten und den Muskel bei 10%L Null zu halten und die Stressrelaxationsrate in den folgenden Zeiträumen zu messen. Beginnen Sie damit, das thermokontrollierte Tierstadium mit zirkulierendem Wasser auf 37 Grad Celsius zu erhitzen.

Schalten Sie die DMC-Software ein und laden Sie sie. Nachdem Sie den TA-Muskel an der Hintergliedmaße der anästhesierten Maus freigelegt haben, binden Sie mit einer Brotseidennaht einen doppelten quadratischen Knoten um das Patellaband. Binden Sie dann einen doppelten quadratischen Knoten, gefolgt von einem Schlaufenknoten an der Muskelsehnenübergangsstelle oder MTJ der distalen Ta-Sehne.

Verwenden Sie die gleiche Naht, um eine Schlaufe von etwa 10 Millimetern zu erstellen. Positionieren Sie das Tier in Bauchlage und legen Sie den Bizepsmuskel frei. Legen Sie den Ischiasnerv frei und binden Sie einen doppelten quadratischen Knoten um sein proximales Ende.

Schneiden Sie den Nerv oberhalb des Knotens ab und präparieren Sie vorsichtig etwa fünf Millimeter seiner Länge in Richtung Knie. Dehnen oder beschädigen Sie den Nerv nicht. Bereiten Sie den kontralateralen Ta-Muskel vor, wie zuvor in diesem Video gezeigt, und bedecken Sie eines der hinteren Gliedmaßen mit einem Stück in Ringer's Buffer getränkter Watte.

Positionieren Sie als Nächstes das Tier bäuchlings auf der Tierplattform und verwenden Sie die Patellaband-Nahtlinien um den Kniestift, um einen doppelten quadratischen Knoten zu binden, um das Knie zu sichern. Nachdem Sie die Füße auf den SIL-Schutzblock geheftet haben, befestigen Sie die Tierplattform auf dem thermokontrollierten Tisch und positionieren Sie die Wärmelampe, um die Körperkerntemperatur des Tieres auf 37 Grad Celsius zu halten. Nachdem Sie die Elektrode an der Plattform befestigt haben, befestigen Sie den Ischiasnerv an der Elektrode, schneiden Sie dann die TA-Sehne der unbedeckten Hintergliedmaße distal zum distalen Knoten ab und befestigen Sie die Nahtschlaufe am Hebelarmhaken

Decken Sie den freiliegenden Muskel der hinteren Gliedmaßen mit warmer, mit Ringerpuffer getränkter Watte ab, um kontraktile Messungen des TA-Muskels aufzuzeichnen. Verwenden Sie die Parameter und das Protokoll in der DMC-Software, die weiter oben in diesem Video für den EDL-Muskel gezeigt wurde, und verwenden Sie die Software, um die Daten zu analysieren. Nach der Messung des TA-Muskels lösen Sie die distale Nahtschlaufe der TA-Sehne vom Hebelarmhaken und messen Sie die kontraktilen Eigenschaften des kontralateralen TA-Muskels, wie gezeigt. Nach der Einschläferung des Tieres entfernen Sie die TA-Muskeln und bestimmen ihr Nassgewicht.

Zur Berechnung der Querschnittsfläche zeigt diese Tabelle die morphometrischen Eigenschaften des EDL-Muskels bei normalen Black 10- und Dystrophin-defizienten oder MDX-Mäusen im Alter von vier bis sechs Monaten. Hier ist eine repräsentative kontraktile und passive Eigenschaft des EDL-Muskels von Black 10 und MDX Mäusen dargestellt, einschließlich der Twitch Force spezifischen maximalen Titankraft Zeit bis zur Spitzenspannung und der halben Relaxationszeit der absoluten maximalen Titanenkraft. Die Zeit bis zur Spitzenspannung und halben Entspannungszeit kann auch aus der absoluten Twitch-Kraft berechnet werden.

Das Stress-Strain-Profil und die Stressrelaxationsrate werden verwendet, um die passiven Eigenschaften des EDL-Muskels zu beschreiben. Das Fehlen von Dystrophin hat einen signifikanten Einfluss auf die kontraktilen und passiven Eigenschaften des EDL-Muskels. Spezifische Twitch- und Titanic-Kräfte werden im M-D-X-E-D-L-Muskel deutlich reduziert.

Zum Beispiel ist die Zeit bis zur Spitzenspannung deutlich schneller, während die halbe Entspannungszeit im M-D-X-E-D-L-Muskel deutlich langsamer ist. Darüber hinaus deutet das Stress-Strain-Profil darauf hin, dass die Steifigkeit im M-D-X-E-D-L-Muskel deutlich erhöht ist. Der M-D-X-E-D-L-Muskel liefert auch eine deutlich höhere Widerstandskraft vor Erreichen der Spitzenbelastung, während die Nachbelastungen viel schneller abnehmen.

Des Weiteren war die Stressrelaxationsrate beim M-D-X-E-D-L-Muskel signifikant höher als beim schwarzen 10 EDL-Muskel. Sobald das Dissektionsverfahren gemeistert ist, kann die ex vivo-Analyse der kontraktilen und passiven Eigenschaft des EDL-Muskels in 40 Minuten durchgeführt werden. Und die In-situ-Bewertung der kontraktilen Eigenschaft beider TA-Muskeln kann innerhalb von 60 Minuten nach ihrer Entwicklung durchgeführt werden.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher bei der Bewertung der kontraktilen und passiven Eigenschaften der Skelettmuskulatur im Bereich der Muskelerkrankungen, um die Wirksamkeit der Behandlung nach diesem Verfahren zu bestimmen. Andere Methoden, wie z.B. die histopathologische Analyse des Skelettmuskels, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel die Wirkung der experimentellen Behandlung auf die Histopathologie der Skelettmuskulatur.