Name: Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in Aplysia californica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Lernen Sie die extrazelluläre Identifizierung von Motorneuronen in Aplysia californica für Neurophysiologie und Motorik. Diese Methode ermöglicht die Überwachung neuronaler Aktivität während Fütterungsmustern.

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Diese Arbeit wurde von NIH NS047073 und NSF DMS1010434 unterstützt.

<ol><li>McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+relationships+of+the+cerebral+giant+cells+with+motoneurones+in+the+feeding+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).</li>
<li>Benjamin, P. R., Rose, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+generation+of+bursting+in+the+feeding+system+of+the+snail%2C+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).</li>
<li>Peters, M., Altrup, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+organization+in+pharynx+of+Helix+pomatia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor organization in pharynx of Helix pomatia.</a> J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).</li>
<li>Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+motoneurons+in+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%3A+immunocytochemical%2C+morphological%2C+and+physiological+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations.</a> J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).</li>
<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+diverse+neuropeptide+cotransmitters+by+identified+motor+neurons+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+multiple+identified+motor+neurons+recorded+intracellularly+during+evoked+feedinglike+motor+programs+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia.</a> J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).</li>
<li>McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Preparation+for+Eliciting+and+Recording+Feeding+Motor+Programs+with+Physiological+Movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica.</a> J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).</li>
<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+fabrication+and+implantation+in+Aplysia+californica+for+multi-channel+neural+and+muscular+recordings+in+intact%2C+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals.</a> J Vis. Exp. (40), e1791(2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+or+loose+coupling+between+components+of+the+feeding+neuromusculature+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).</li>
<li>Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+pattern-initiation+and+motor+functions+in+the+B31+and+B32+neurons+of+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+activity+in+motor+neurons+that+produce+radula+movements+distinguishes+ingestion+from+rejection+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).</li>
<li>Iles, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+synaptic+activation+of+the+fast+coxal+depressor+motoneurone+of+the+cockroach.+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana.</a> J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).</li>
<li>Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).</li>
<li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+patterns+of+the+B31%2FB32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single-unit+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).</li>
<li>Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contingent-dependent+enhancement+of+rhythmic+motor+patterns%3A+an+in+vitro+analog+of+operant+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning.</a> J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Behavioral+biology+of+Aplysia%22">Behavioral biology of Aplysia</a>. , Freeman. San Francisco. (1979).</li>
<li>Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+organization+of+the+buccal+system+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica.</a> J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outputs+of+radula+mechanoafferent+neurons+in+Aplysia+are+modulated+by+motor+neurons%2C+interneurons%2C+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).</li>
<li>Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+an+identified+histaminergic+neuron%2C+and+its+possible+role+in+arousal+of+feeding+behavior+in+semi-intact+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).</li>
<li>Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+cerebral-to-buccal+interneurons+implicated+in+the+control+of+motor+programs+associated+with+feeding+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+variants+of+a+motor+act+in+a+modular+and+hierarchical+motor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network.</a> Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).</li>
<li>Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+neurostimulation+using+pulse+code+modulation+%28PCM%29+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips.</a> J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+internal+state+are+expressed+in+coherent+shifts+of+neuromuscular+activity+in+Aplysia+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior.</a> J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).</li>
<li>Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).</li>
<li>Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFejtl%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays</a>. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Bei Tieren mit großen identifizierten Neuronen, wie Weichtiere (z. B. Lymnaea, Helix und Aplysia), Analyse von Fuhrparks erfolgt typischerweise mittels intrazellulärer Aufnahme 1,2,3,4. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zum eindeutigen Identifizieren der Motoneuronen für einen Fuhrpark mit einer extrazellulären Technik. Wir verwendeten die Kraftmessungen als Illustration dieses Prozesses. Man könnte auch EMG, um Muskeln Innervationen messen. Kurz gesagt, dies zu tun, muss das...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671 </td><td> Biologische, Certified </td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217 </td><td> Certified ACS </td></tr><tr><td> Magnesiumchloridhexahydrat </td><td> Acros Organics </td><td> 19753 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfatheptahydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> M63 </td><td> Certified ACS </td></tr><tr><td> Calciumchloriddihydrat </td><td> Fisher Scientifc </td><td> C79 </td><td> Certified ACS </td></tr><tr><td> Glucose (Traubenzucker) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> BioXtra </td></tr><tr><td> MOPS Buffer </td><td> Acros Organics </td><td> 17263 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Carbachol </td><td> Acros Organics </td><td> 10824 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255 </td><td> Bescheinigt </td></tr><tr><td> Salzsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> SA49 </td><td> Bescheinigt </td></tr><tr><td> Mit einem Lauf Kapillargläser </td><td> AM-Systems </td><td> 6150 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming-Brown Feinpipettenziehvorrichtung Modell P-80/PC </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> Filament verwendet: FT345B </td></tr><tr><td> Enamel Edelstahlseil </td><td> California Fine Wire </td><td></td><td> 0.001D, Beschichtung h </td></tr><tr><td> Haushalt Silikon II Kleber </td><td> GE </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Duro Quick-Gel Superkleber </td&gt; <td> Henkel Corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AM Systems Modell 1700 Verstärker </td><td> AM-Systems </td><td></td><td> Filtereinstellungen: 10-500 Hz für die I2 Nerv / Muskel; 300-500 Hz für alle anderen Nerven </td></tr><tr><td> PulseMaster Multi-Channel Stimulator </td><td> World Precision Instruments </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> Stimulus Isolator </td><td> World Precision Instruments </td><td> A360 </td><td></td></tr><tr><td> AxoGraph X </td><td> AxoGraph Scientific </td><td></td><td> Software für Aufnahmen </td></tr><tr><td> Gold Connector Pins </td><td> Bulgin </td><td> SA3148 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Gold Connector Sockets </td><td> Bulgin </td><td> SA3149 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Siliconelastomer </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 x 15 mm Kristallisieren Dish </td><td> Pyrex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hochvakuumfett </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pipettenspitzen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-375D </td><td></td></tr><tr><td> Minutien Pins </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Modelliermassen </td><td> Sargent Art </td><td> 22-4400 </td><td></td></tr><tr><td> Whisper Air Pump </td><td> Tetra </td><td> 77849 </td><td></td></tr><tr><td> Aquarium Tubing </td><td> Eheim </td><td> 7783 </td><td> 12/16 mm </td></tr><tr><td> Elite Ausströmer </td><td> Hagen </td><td> A962 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Federschere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 feinen Pinzette </td><td> Feine Science-Tools </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr></tbody></table>

extrazellulär identifizieren motor neurons für einen muscle motor pool in<em&gt; aplysia californica</em

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Bei Tieren mit großen identifizierten Neuronen (zB Weichtiere), Analyse von Fuhrparks erfolgt über intrazelluläre Techniken 1,2,3,4. Vor kurzem haben wir eine Technik, um extrazellulär stimulieren und aufzeichnen einzelnen Neuronen in Aplysia californica 5. Wir beschreiben nun ein Protokoll für die Verwendung dieser Technik zur eindeutigen Identifizierung und Charakterisierung Motoneuronen in einem Fuhrpark. Diese Technik hat extrazellulären Vorteile. Erstens extrazellulären Elektroden stimulieren kann und aufzuzeichnen Neuronen durch die Hülle 5, so dass es nicht entfernt werden müssen. So wird Neuronen gesünder in der extrazellulären Experimenten als im intrazellulären diejenigen. Zweitens, wenn Ganglien gedreht werden durch geeignete Pinning der Hülle können extrazelluläre Elektroden zuzugreifen Neuronen auf beiden Seiten des Ganglion, das es einfacher und effizienter zu mehreren Neuronen in der gleichen Präparation zu identifizieren. Drittens extrazellulärenlar Elektroden brauchen nicht in Zellen eindringen, und somit leicht hin und her bewegt werden zwischen Neuronen, was zu weniger Schäden an ihnen. Dies ist besonders nützlich, wenn man mehrere Neuronen während wiederholenden Bewegungsmuster, die nur für Minuten andauern kann aufzuzeichnen versucht. Viertens extrazellulären Elektroden sind flexibler als intrazelluläre Wieder während Muskelbewegungen. Intrazelluläre Elektroden können herausziehen und beschädigen Neuronen während Muskelkontraktionen. Da im Gegensatz dazu extrazellulären Elektroden sanft auf der Hülle oberhalb Neuronen gedrückt werden, sie in der Regel oberhalb derselben Neuron bleiben während Muskelkontraktionen, und können daher in mehreren intakten Zubereitungen verwendet werden. Zur eindeutigen Identifizierung Motoneuronen für einen Motor Pool (insbesondere die I1/I3 Muskel in Aplysia) mit extrazellulären Elektroden, kann man Funktionen, die keine intrazelluläre Messungen Kriterien: soma Größe und Lage, axonale Projektion und Muskelinnervation 4, 6,7. Für den bestimmten Motor Pool verwendet, um die Technik zu veranschaulichen, wiesen wir von bukkal Nerven 2 und 3, die Axon-Vorsprünge zu messen, und die gemessene Kontraktionskräfte des I1/I3 Muskel um das Muster der Muskelinnervation für die einzelnen Motoneuronen zu bestimmen. Wir zeigen den kompletten Prozess der ersten Identifizierung von Motoneuronen mit Muskelinnervation, dann Charakterisierung ihrer Zeit während Bewegungsmuster, die Schaffung eines vereinfachten diagnostisches Verfahren zur schnellen Identifizierung. Die vereinfachte und schnelle diagnostische Verfahren überlegen ist für mehr intakt Zubereitungen, z. B. in der suspendierten bukkalen Masseaufbereitung 8 oder 9 in vivo. Dieses Verfahren kann auch in anderen Motor-Pools aufgebracht werden, 10,11,12 Aplysia oder in anderen tierischen Systemen 2,3,13,14.

Abbildungen 4 und 5 zeigen typische Ergebnisse verwendet, um zwei I1/I3 Motoneuronen zu identifizieren. Abbildung 4 zeigt die soma-Aufnahmen eines großen Motoneuronen, B3, während egestive-like und ingestive-ähnliche Muster (4C, 4D). Die Eins-zu-eins entsprechende Spikes auf der soma-Kanal und der ipsilateralen BN2 Kanal (4E) zeigen, dass die Spezifität der B3 soma Aufnahme während Mustern wurde beibehalten. B3 feuert während der Mitte ...

Bei Tieren mit großen identifizierten Neuronen (<em&gt; ZB</em&gt; Weichtiere), wird die Analyse des Fuhrparks erfolgt über intrazelluläre Techniken<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;. Vor kurzem haben wir eine Technik, um extrazellulär stimulieren und aufzeichnen einzelnen Neuronen in<em&gt; Aplysia californica</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Wir beschreiben nun ein Protokoll für die Verwendung dieser Technik zur eindeutigen Identifizierung und Charakterisierung Motoneuronen in einem Fuhrpark.

Extrazellulär identifizieren Motor Neurons für einen Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einzelne Motoneurone für einen Motoneuronenpool extrazellulär zu identifizieren und sie während motorischer Muster zu überwachen und zu steuern. Dies wird erreicht, indem zunächst die präparierte Buccalmasse von Plegia mit an wichtige Nerven angebrachten Hookelektroden in eine spezielle Ableitungsschale platziert wird und anschließend die Buccalganglien sowie das zerebrale Ganglion für die extrazelluläre Stimulation und Ableitung vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, Saugelektroden an die wichtigen Nerven und Muskeln der Buccalmasse anzubringen, Krafttransducer am Zielmuskel zu befestigen und extrazelluläre Glaselektroden auf die Hülle der Buccalganglien zu platzieren.Als Nächstes lokalisieren Sie die Zielmotoneurone mit extrazellulären Glaselektroden. Der letzte Schritt besteht darin, die Zielmotoneurone extrazellulär zu stimulieren und aufzuzeichnen, während gleichzeitig die Muskelkontraktionskräfte gemessen werden. Letztendlich dient die extrazelluläre Stimulations- und Ableitungstechnik dazu, die Identifizierung einzelner Motoneurone und ihrer neuralen Aktivität während verschiedener, fütterungsähnlicher motorischer Muster zu zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der intrazellulären Identifizierung von Neuronen besteht darin, dass extrazelluläre Glaselektroden mehrere Motoneurone in derselben Präparation während Muskelbewegungen identifizieren und überwachen können. Bei der Demonstration des Verfahrens wird Jeff McManus, ein weiterer Doktorand aus meinem Labor, helfen. Bereiten Sie in diesem Verfahren zunächst die Saugsonden vor, indem Sie ein Stück Polyethylenrohr von etwa 10 Zentimeter Länge abschneiden. Halten Sie das Rohr an beiden Enden fest und führen Sie es sehr nahe an die Flamme des Bunsenbrenners heran, während Sie es drehen, bis es weich wird.Dehnen Sie das Röhrchen anschließend vorsichtig, während Sie es von der Flamme wegbewegen. Der mittlere Teil des Röhrchens wird sich verlängern und verengen, sobald es gezogen wird; danach schneiden Sie das Röhrchen der Länge nach in zwei Hälften, um zwei Sektionselektroden zu erhalten. Diese Saug-Elektroden werden üblicherweise an den durchtrennten Enden von Nerven oder Muskeln angebracht, gelegentlich jedoch auch vorübergehend „auf der Durchreise“ (on passant) verwendet.Nachdem die Hakenelektroden unter dem Mikroskop angebracht wurden, schneiden Sie den bukkalen Nerv eins und den ösophagealen Nerv beidseitig an der Ansatzstelle zum bukkalen Muskel durch. Ziehen Sie danach das zerebrale Ganglion nach vorne, um es aus dem Weg des Muskels I zwei zu bewegen. Schneiden Sie anschließend in den Muskel I zwei über dem ular-Sack hinein.Verlängern Sie den Schnitt seitlich und anterior und ziehen Sie die Muskelklappe des I zwei-Muskels nach vorne, um den ular-Nerv freizulegen. Durchtrennen Sie die beiden RN-Äste und stellen Sie sicher, dass die Äste lang genug für die Befestigung der Saugelektrode sind. Setzen Sie den I zwei-Schnitt in einem weiten Kreis um die bukkalen Ganglien herum fort.Darauf achten, die BN-Zweier oder die BN-Dreier nicht zu durchtrennen, bis die Buccalganglien und der daran befestigte Teil des I-zwei-Muskels vollständig vom Buccalmassiv getrennt werden können. Danach die bilateralen BN-Dreier am Ansatzpunkt am Buccalmassiv hinter der Hakenelektrodenbefestigung durchschneiden. Anschließend eine dünne Schicht Vakuumfett in die Nut der Ableitungsschale auftragen, die die hintere Kammer mit der mittleren Plattform verbindet.Tragen Sie anschließend eine dünne Schicht Schnellgel-Kleber auf den Glasboden der vorderen Kammer auf, an der die Buccalmasse platziert wird. Überführen Sie das zerebrale Ganglion, die Buccalganglien und die Buccalmasse vorsichtig in die Ableitungsschale. Achten Sie darauf, dass keiner der Hookelektroden straff gezogen wird, da dies die Nerven beschädigen könnte.Platzieren Sie anschließend vorsichtig die Buccalmasse auf dem Kleber in der vorderen Kammer der Ableitungsschale. Stellen Sie sicher, dass ihre ventrale Fläche am Boden der Schale befestigt ist, und vermeiden Sie, dass die Ganglien und Elektroden den Kleber berühren. Danach fügen Sie Plegia-Salzlösung zur Schale hinzu, um die Aushärtung des Klebers einzuleiten.Danach unter dem Mikroskop die Hülle des Cerebralganglions mit einer Pinzette erfassen und in die hintere Kammer ziehen, wobei sichergestellt werden muss, dass die CBCs durch die Kerbe verlaufen. Danach die Nerven des Cerebralganglions mit Ausnahme der CBCs fixieren, um eine Beschädigung der intakten CBCs zu vermeiden.Tragen Sie mehr Vakuumfett auf die CBCs auf, sodass die Oberfläche des Vakuumfetts leicht höher als die Schutzwand ist und keine Leckage zwischen den Kammern auftritt. Füllen Sie dann beide Kammern der Petrischale mit weiterem Plegiasalzlösung, sodass die Ganglien vollständig untergetaucht sind. Um die Buccalganglien zu stabilisieren, befestigen Sie zunächst die Enden der BN-Dreier auf der Zigarrenbasis der mittleren Plattform mit Nadeln.Da die BN-Dreier mit Haken-Elektroden aufgezeichnet werden, sollten die Nadeln weiter distal als die Befestigungspunkte der Haken-Elektroden platziert werden; danach werden die Enden der BN-Einsen und die Enden fixiert. Verwenden Sie anschließend zwei Nadeln, die um 90 Grad als Haken gebogen wurden, um die CBCs zu dehnen und zu verankern, sodass die CBCs nicht beschädigt werden. Danach werden die RN-Zweige zwischen der hinteren Kammer und den bukkalen Ganglien festgesteckt.Der I-zwei-Muskel befindet sich dann oberhalb der bukkalen Ganglien. Um den I-zwei-Nerven freizulegen, fassen Sie den I-zwei-Muskel mit einer Pinzette an und ziehen ihn über die bukkalen Ganglien. Heften Sie zwei Ecken des I-zwei-Muskels fest, um den I-zwei-Nerven zu schützen. Danach durchtrennen Sie den I-zwei-Nerven distal zu der Stelle, an der seine beiden Äste den I-zwei-Muskel versorgen, und entfernen den restlichen Teil des I-zwei-Muskels. Klappen Sie den I-zwei-Nerven zurück und heften Sie ihn zwischen den beiden RN-Ästen fest. Anschließend passen Sie die Position der Nadeln an, um die Spannung zu erhöhen, falls ein Nerv zu locker ist, oder um die Spannung zu verringern, falls ein Nerv zu straff gespannt ist.Um die Buccalganglien weiter zu stabilisieren, fügen Sie weitere Nadeln in die Hülle zwischen den Nerven ein. Da die Buccalganglien mit der Bauchseite nach oben liegen, drehen Sie die Buccalganglien. Falls die Neurone von Interesse auf der rostralen Seite liegen.Um eines der beiden bukkalen Ganglien zu drehen, verwenden Sie feine Pinzette, um etwas überschüssige Hülle des CBC nahe den bukkalen Ganglien zu erfassen. Befestigen Sie dann die überschüssige Hülle des CBC zwischen dem CBC und dem BM drei und fügen Sie eine zusätzliche Nadel an der Hülle des bukkalen Ganglions auf der Seite nahe der vorderen Kammer hinzu, um die Bewegung des bukkalen Ganglions zu minimieren. Um die Hülle zu trimmen, die die bukkalen Ganglien bedeckt.Verwenden Sie feine Pinzette, um die Hülle an der Seite nahe der hinteren Kammer zu greifen. Schneiden Sie dann mit einer feinen Schere den überschüssigen Hüllenteil ab, ohne die Zellkörper freizulegen. Um Schäden zu minimieren, entfernen Sie nur die minimale Menge an Hülle, die notwendig ist, um die Zellkörper sichtbar zu machen.Nachdem die Hülle der bukkalen Ganglien abgetrennt wurde, ziehen Sie den iTune-Nerv und die RNs über die bukkalen Ganglien und fixieren Sie sie zwischen den bukkalen Ganglien und der vorderen Kammer. Um die bukkalen Ganglien weiter zu drehen und die Elektrode mit Aple-Salzlösung zu füllen, befestigen Sie das freie Ende eines 15 bis 20 cm langen Polyethylenrohrs, das an der Spritze angebracht ist, an der Spitze der Glaselektrode. Ziehen Sie anschließend den Kolben der Spritze zurück, um die Elektrode mit Plegia-Salzlösung zu füllen.Platzieren Sie die gefüllte extrazelluläre Glaselektrode in der Nut des Halterungsarmes am Manipulator. Bringen Sie dann mit Hilfe des Manipulators die Elektrodenspitze in das Plegia-Salzbad, das die bukkalen Ganglien enthält. Anschließend führen Sie einen Silber-Silberchlorid-Draht in die Elektrode ein, um den Aufzeichnungsdraht zu bedienen, und verbinden diesen mit einem BNC-Kabel, das mit dem Verstärker verbunden ist.Dann befestigen Sie einen weiteren Draht am BNC-Kabel, der als Referenzdraht dient, wobei das andere Ende des Drahts in die Plegia-Salzlösung gebracht wird. In diesem Schritt kürzen Sie das schmale Ende der Saugelektrodenspitze so, dass ihr Durchmesser dem des Nervs entspricht. Der Innendurchmesser der Elektrodenspitze sollte dem Durchmesser des Nervs ähnlich sein oder geringfügig kleiner, um einen festen Sitz durch Saugwirkung sicherzustellen.Da der iTune-Nerv und das RN sehr nah beieinander liegen, platzieren Sie ihre Elektroden im selben Manipulator, um Platz zu sparen. Drehen Sie die beiden Elektroden und stellen Sie sicher, dass ihre Spitzen nahe beieinander liegen. Wählen Sie dann eine davon für die Aufnahme am iTune-Nerv und die andere für die Aufnahme am RN.Platzieren Sie die Elektrodenspitze in der Plegia-Salzlösung. Befestigen Sie das freie Ende des Polyethylenrohrs an der Spritze an der Saug-Elektrode. Füllen Sie dann mithilfe der Spritze die Elektrode mit apler Salzlösung auf.Bewegen Sie anschließend die Elektrodenspitze nahe an das Ende des Nervus I zwei heran und saugen Sie mithilfe der Spritze den Nerv in die Elektrode ein. Die Länge des Nervs innerhalb der Elektrode sollte etwa 0,5 bis ein Millimeter betragen. Um eine dichte Abdichtung sicherzustellen, wiederholen Sie das Absaugen an der Elektrode, die an das rn angeschlossen wird, um die Kraftaufnehmer am Muskel zu befestigen.Biegen Sie die gebogene Nadel jeder Naht und binden Sie die Naht am Kraftaufnehmer fest. Greifen Sie vorsichtig mit einer Pinzette eine kleine Menge Muskelgewebe an, heben Sie es leicht an und führen Sie die Nadel bis zum Biegepunkt durch den hinteren Teil des Muskels I eins I drei. Befestigen Sie nun einen weiteren Kraftaufnehmer am vorderen Teil des Muskels an den Backen.Heben Sie anschließend die Kraftaufnehmer an, bis die Nähte straff gezogen sind, dehnen Sie sie jedoch nicht übermäßig, um dies zu überprüfen. Beobachten Sie die Messung am Kraftaufnehmer, wenn die Naht noch etwas Spiel aufweist. Danach heben Sie den Aufnehmer an, bis die Messung leicht über diesem Ausgangswert liegt.Um ein Zielneuron zu lokalisieren, verwenden Sie den Manipulator, um die Spitze der extrazellulären Glaselektrode vorsichtig auf die Hülle über dem Zentrum des Neuronensomas niederzudrücken, da dies die optimale Position für Stimulation und Aufzeichnung der Zellselektivität ist. Diese Abbildung zeigt die extrazelluläre Stimulation von B drei sowie die Ableitung vom B-drei-Soma und den entsprechenden Nerven- und Muskelregionen von oben nach unten. Die Kanäle entsprechen den Ableitungen vom B-drei-Soma, dem kontralateralen BN zwei, dem ipsilateralen BN zwei, dem ipsilateralen BN drei, der Kontraktionskraft des vorderen Bereichs des I-eins-I-drei-Muskels und der Kontraktionskraft des hinteren Bereichs des I-eins-I-drei-Muskels.Die blaue Box hebt die Dauer der Kräfte in den anterioren und posterioren Regionen des Muskels I eins I drei hervor; B drei projiziert nur auf das ipsilaterale BN zwei. Hier sind die extrazellulären Ableitungen vom B-drei-Soma und den Nerven in einem EST-ähnlichen motorischen Muster sowie in einem ingestiv-ähnlichen motorischen Muster. Die blauen Boxen kennzeichnen die Protraktions- und Retraktionsphasen der Muster.Die roten Balken im B-drei-SOMA-Kanal heben die von dem B-drei-Soma aufgezeichneten Aktionspotentiale hervor, während die roten Balken im IB-zwei-Kanal den entsprechenden Zeitpunkt anzeigen, zu dem B drei im ipsilateralen BN-zwei feuert. Während der fütterungsbezogenen motorischen Muster. Beachten Sie, dass die BN-zwei-Einheit von B drei die größte aller Einheiten ist.Daher können wir die BN-Zwei-Einheiten von B drei auch direkt aus den BN-Zwei-Aufnahmen ohne SOMA-Aufnahmen detektieren. Diese Abbildung zeigt die extrazelluläre Stimulation von B 43 sowie die Ableitung von seinem Soma und den entsprechenden Nerven- und Muskelregionen von oben nach unten. Die Kanäle stammen von der B-43-Soma-Ableitung, dem kontralateralen BN zwei, dem ipsilateralen BN zwei, dem ipsilateralen BN drei, der Kontraktionskraft des vorderen Bereichs des I-eins-I-drei-Muskels und der Kontraktionskraft des hinteren Bereichs des I-eins-I-drei-Muskels.Die blaue Box hebt die Kraftmessungen des Muskels I one I three während B 43 hervor. Aktivität B 43 projiziert nur auf das ipsilaterale BN two. Hier sind die extrazellulären Ableitungen vom B 43-Soma und den Nerven in einem ingestiven motorischen Muster sowie einem weiteren ingestiven motorischen Muster.Die blauen Kästen zeigen die Protraktions- und Retraktionsphasen der Muster an. Die roten Balken im B 43 SOMA-Kanal markieren die von dem B 43-Soma aufgezeichneten Aktionspotentiale, während die roten Balken im IBN zwei-Kanal den entsprechenden Zeitpunkt anzeigen, zu dem B 43 im ipsilateralen BN zwei feuert. Bei diesen Mustern ist zu beachten, dass die BN zwei-Einheiten von B 43 klein und ohne Summer-Aufnahmen nur schwer nachweisbar sind, aber regelmäßig am Ende des BN zwei-Motorprogramms feuern, was eine weitere Möglichkeit bietet, sie zu identifizieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne moderne Neuronen extrazellulär für mehrere nachweisen kann.

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