Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine PCR-basierte Technik zur Quantifizierung der Spenderzelltransplantation in einem kompetitiven murinen Knochenmarktransplantationsmodell durchzuführen, indem zunächst eine Knochenmarktransplantation bei weiblichen Empfängermäusen unter Verwendung männlicher Spenderzellen durchgeführt wird. Als nächstes wird peripheres Blut von Empfängermäusen zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und die genomische DNA isoliert. Die Proben werden für eine Standardkurve vorbereitet.

Abschließend wird die real-time PCR mit Standardproben und Testproben durchgeführt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Transplantation von männlichen Spenderzellen in den weiblichen Empfängermäusen durch Berechnung gegen eine Standardkurve mit einem bekannten Prozentsatz an männlicher und weiblicher DNA zeigen. Der männliche Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. einer auf Durchflusszytometrie basierenden Methode, besteht darin, dass sie empfindlicher und wirtschaftlicher ist und die Proben lange gelagert werden können.

Am wichtigsten ist, dass unsere Technik weitestgehend fadenunabhängig ist und für jeden genomischen Hintergrund von Mäusen verwendet werden kann, wie z. B. gut definierte Zelloberflächenmarker, um die Spenderzelle von den Empfängerzellen zu unterscheiden. Nach der Euthanasation von FVB nj verwenden männliche Spender und weibliche Mäuse unter einer Laminar-Flow-Haube eine kleine Schere und Pinzette, um die Femur- und Tibiaknochen zu präparieren und sie in eine 60-Millimeter-Gewebekulturschale mit sechs Millilitern eiskalter Haut zu legen RPMI 1640 mit 5% wärmeinaktiviert. FBS verwenden ein Kim-Tuch, um Muskeln und anderes Gewebe zu entfernen, und schneiden beide Enden jedes Knochenschafts in der Schale ab. Verbinden Sie dann das Ende der Knochen mit einer 23-Gauge-Nadel, die an einer Drei-cm³-Spritze befestigt ist, die mit RPMI 1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS gefüllt ist, und spülen Sie das Knochenmark aus.

Verwenden Sie die gleiche Nadel, um das Knochenmarkgewebe durch wiederholte Aspirationen zu disaggregieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie es fünf Minuten lang bei 400 G. Nachdem Sie das Supernat entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Raumtemperatur, lysieren Sie rote Blutkörperchen, puffern Sie und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie fünf bis 10 Milliliter RPMI 1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS hinzufügen. Lassen Sie die Zellen durch ein Zellsieb und sammeln Sie den Durchfluss in einem neuen Rohr. Nach dem fünfminütigen Schleudern der Zellen bei 400 G und dem Entfernen des Überstands sollte das Pellet keine rote Farbe mehr aufweisen, was auf die vollständige Entfernung der roten Blutkörperchen hinweist, die in 10 Millilitern RPMI 1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS resuspendiert wurden, nachdem es vorsichtig vortext wurde, fügen Sie ein kleines Aliquot zu einem Hämozytometer hinzu und zählen Sie die Zellen.

Berechnen Sie das Volumen der Zellen, die für die Knochenmarktransplantation im Verhältnis fünf zu zwei mit konkurrierenden weiblichen Zellen vermischt werden müssen. Als letzten Schritt zur Vorbereitung der Zellen für die Injektion mischen Sie die Spender- und Konkurrenzzellen, pelletieren die Zellen, waschen die Zellen mit PBS und resuspendieren in PBS in einer Endkonzentration von fünfmal 10 bis 10 pro Milliliter Spenderzellen und zweimal 10 bis sechstel pro Milliliter für konkurrierende Zellen, vier bis sechs Stunden vor der Knochenmarktransplantation. Bestrahlen weiblicher Empfängermäuse mit Cäsium 1 37 Gammastrahlung bei einer Einzeldosis von 11 Grays.

Legen Sie die bestrahlten weiblichen Mäuse in eine Fesselung für Mäuse und injizieren Sie die gemischten Spender- und Konkurrenzzellen über die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen von 0,1 Millilitern, so dass jede Maus fünfmal 10 an die fünfte Spenderzelle und zweimal 10 an die fünfte konkurrierende Knochenmarkzelle zur Entnahme von Blutproben erhält. Nach der Narkose sammeln die Mäuse durch retroorbitale Blutung etwa 50 Mikroliter Blut in EDTA-beschichtete Röhrchen. Sammeln Sie auch Proben von männlichen und weiblichen Mäusen im gleichen Alter.

Als nächstes wird genomische DNA von Mäusen und Mäusen isoliert. Für die Standardkurve geben Sie etwa 200 Mikroliter RBC-Lysepuffer bei Raumtemperatur zu jeder Blutprobe und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang. Fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und schleudern Sie nach unten, um die meisten lysierten Erythrozyten zu entfernen.

Verwenden Sie dann ein Blut-DNA-Extraktionskit, um die DNA zu isolieren, bevor Sie den elucianischen Puffer auf 37 Grad Celsius erwärmen. Um die Ausbeute zu verbessern, messen Sie die DNA-Konzentration jeder Probe. Für die weitere Analyse werden diejenigen mit einem Verhältnis von OD zwei 60 zu zwei 80 zwischen 1,8 und 2,0 verwendet.

Um eine Standardkurve zu erstellen, verdünnen Sie die männliche und weibliche DNA auf eine Konzentration von vier Nanogramm pro Mikroliter und bereiten Sie das DNA-Gemisch gemäß diesen Richtlinien vor. Richten Sie die PCR-Reaktionsplatte ein, indem Sie das Cyber Green Super Mix-Reagenz mit den hier gezeigten Primern und genomischer DNA mischen. Jede 20-Mikroliter-Reaktion enthält 400 Nanomolare jedes Primers und fünf Mikroliter genomische DNA von Blutzellen laufen in dreifacher Ausfertigung.

Führen Sie die PCR gemäß den im Textprotokoll festgelegten Bedingungen durch und ermitteln Sie die Zyklusschwellenwerte oder CT-Werte. Berechnen Sie Delta CT multipliziert die Menge CT hoch ZY eins minus CT hoch BCL zwei und die Expressionsniveaus ZY eins oder zwei hoch minus Delta CT erzeugen Sie Standardkurven, indem Sie den Mittelwert des Triplats zwei hoch der Delta-CT-Werte auf den bekannten Prozentsatz männlicher DNA in der Mischung mit einer gezeigten linearen Regressionsanpassung plotten. Hier sind Beispiele für Standardkurven, die mit Mittelwerten von zwei hoch der Delta-CT gegen Prozentsätze der männlichen DNA aufgetragen wurden.

Dieses Diagramm enthält eine spezifische Schmelztemperatur für BCL zwei und ZFY eins Amplikons, die bei 78,5 bzw. 88,5 Grad Celsius lokalisiert sind. BCL zwei wird als Referenzgen verwendet, um die Gesamtmenge an geladener DNA in jeder PCR-Reaktion zu normalisieren. BCL: Zwei Amplifikationskurven für jede Standardprobe verschmelzen unabhängig von der männlichen DNA-Konzentration miteinander, was auf gleiche Mengen geladener DNA hinweist.

Die Amplifikationskurven von ZFY one wanderten jedoch mit zunehmenden Mengen an männlicher DNA in der Probe hämatopoetischer Stammzellen von PIM-TKO-Mäusen nach links, und wie erwartet wiesen Empfängermäuse, die mit PIM-TKO-Zellen transplantiert wurden, einen viel geringeren Prozentsatz an männlichen Zellen auf als Mäuse, denen Wildtyp-Zellen transplantiert wurden. Um unsere Methode zu validieren, testeten wir die Transplantation von männlichen Spenderzellen an transplantierten weiblichen Mäusen, indem wir Knochenmarkzellen aus Wildtyp- im Vergleich zu PIM-Triple-Knockout- oder TKO-Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation erhielten, sowohl peripheres Blut nach sechs Wochen als auch Knochenmarkproben nach 16 Wochen. Wurden nach dem Ansehen dieses Videos analysiert.

Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die PCR-basierte Methode zur Quantifizierung der Spenderzelltransplantation in einem kompetitiven marinen Knochenmarktransplantationsmodell verwenden können.