Name: Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Lernen Sie eine PCR-basierte Methode zur Quantifizierung von Donor Cell Engraftment im kompetitiven murinen Knochenmarktransplantationsmodell. Diese Technik bietet höhere Sensitivität und Kosteneffizienz für Transplantationsbiologie.

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Wir danken Dr. Charles Greenberg für die Nutzung seiner Real-time PCR-Maschine. Diese Arbeit wird durch MUSC Hollings Cancer Center Gründerfonds, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103.780-01A1 und NIH 3P30CA138313-01S3 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health oder andere Mittel Agenten.

Ein. Bone Marrow Zellisolation <ol><li> Einschläfern männlichen Spenders FVB / NJ Mäusen und weibliche FVB / NJ Mäusen mit CO 2-Methode durch Genickbruch folgte. Die weiblichen FVB / NJ Knochenmarkzellen als wettbewerbsfähigen Zellen verwendet werden. </li><li> Verwenden Sie kleine Schere und Pinzette, sezieren Sie Oberschenkel und tibiaes von Mäusen und legen Sie sie in einem 60 mm Gewebekulturschale mit 6 ml eiskaltem RPMI1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS. Verwenden Kimwipe Gewebe Muskeln und anderen Geweben zu entfernen. Schneiden Sie die beiden Enden jedes Knochens Welle in die Schüssel. </li><li> Verbinden Sie das Ende des Knochens mit 23G Nadel auf 3 cc Spritze spülen Knochenmark mit RPMI1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS in die Schüssel. Disaggregieren Knochenmark Gewebe durch wiederholte Bestrebungen mit der gleichen Nadel. Übertragen der Zellsuspension zu 15 ml-Zentrifugenröhrchen. </li><li> Abzentrifugieren der Zellen für 5 min bei 400 × g, Entfernen des Überstandes werden die Zellen in 1 ml Raumtemperatur Erythrozyten-Lyse-Puffer (155 mM potassium Bicarbonat, 10 mM Ammoniumchlorid, 0,1 mM EDTA, pH = 7,4) und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min fügen 5-10 ml RPMI 1640 mit 5% Hitze-inaktiviertem FBS. </li><li> Führen Sie die Zellen durch eine Zelle Sieb. Sammeln des Durchflusses durch ein neues Röhrchen. Spindown für 5 min bei 400 x g beträgt. Entfernen Sie den Überstand; das Zellpellet sollten keine rote Farbe. Das Fehlen von roten Farbe eine vollständige Entfernung von roten Blutkörperchen. Zellpellet in 10 ml RPMI1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS. Vorsichtig vortexen, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension ist völlig einheitlich. Einen aliquoten und zählen Sie die Zellen in einem Hämazytometer. Berechnen Sie, wie viel Volumen der Zellen für Knochenmarktransplantation und aliquoten genug Zellen benötigt und mischen männlichen Spenderzellen mit Konkurrenten weiblichen Zellen bei einem Verhältnis von 5:2. Spindown für 5 min bei 400 × g, mit PBS gewaschen, in PBS resuspendieren mit der Endkonzentration von Donorzellen mit 5 × 10 6 / ml und Kompetitor Zellen bei 2 × 10 6 </sup&gt; / ml. </li></ol> 2. Competitive Bone Marrow Transplantation <ol><li> Bestrahlen weiblichen Empfängermäuse (8-12 wks alt) mit 137Cs Gammastrahlung Strahlers bei einer Einzeldosis von 11Gy 4-6 Std. vor Knochenmarktransplantation. </li><li> Legen Sie die bestrahlten weiblichen Mäusen in einem Maus-Verzögerer. Injizieren des gemischten Donor und Kompetitor-Zellen über die Schwanzvene in 0,1 ml Gesamtvolumen, so dass jede Maus 5 x 10 5 Spenderzellen und 2 × 10 5 Kompetitor Knochenmarkszellen empfängt. </li></ol> 3. Probenentnahme Paare Wochen nach Knochenmarktransplantation, sammeln peripheren Blutproben (~ 50 ul) von weiblichen Empfängermaus durch retro-orbitale Blutung unter Narkose Zustand. Die Proben werden in EDTA beschichtete Röhrchen gesammelt. BM Proben kann auch am Ende des Experiments gesammelt werden, in der Regel von mindestens 4 Monaten nach der Transplantation, mit denselben Verfahren wie vorangegangenen beschrieben (Schritt 1), in der Regel 20-40%1 Tibia BM-Zellen sind genug, um genügend DNA-Menge machen. Blut oder BM Proben aus gleichaltrigen normalen weiblichen und männlichen Mäusen werden auch gesammelt, um Standardkurve vorbereiten. 4. Isolierung genomischer DNA <ol><li> Add 4 × Volumen von Raumtemperatur RBC Lysispuffer (~ 200 ul) in jede Blutprobe. Gut mischen und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. 1 ml PBS, dann drehen bis die meisten der lysierten RBC entfernen. </li><li> Isolieren Sie DNA mit einem Blut-DNA Extraktions-Kits (QIAmp DNA Blood Extraction Kit). Vorwärmen der Elutionspuffer (AE) bei 37 ° C, um die Ausbeute des eluierten DNA verstärken. Männliche und weibliche DNAs für Standard-Kurve ähnlich isoliert. </li><li> (Optional) Genomische DNA kann weiter gereinigt werden oder konzentriert mit EtOH Präzipitationsverfahren in Gegenwart von 3 M Natriumacetat (pH = 5,5). Die DNA-Pellets werden dann in 40-50 ul destilliertem Wasser zur Analyse resuspendiert sofort oder bei -20 ° C für zukünftige Verwendung. </li><li> Messen Sie die DNA konzentration mit Nanodrop ND-1000-Spektren Photometer. Proben mit OD 260/280 zwischen 1,8-2,0 für die weitere Analyse verwendet. </li><li> Verdünnen DNA mit DNase freie H 2 O in einem Gesamtvolumen von 50 ul 4ng/μl. </li></ol> 5. Standardkurve Vorbereitung Verdünnte männlichen und weiblichen DNA DNA mit einer Konzentration von 4 ng / pl, und stellen die DNA-Mischung gemäß den Tabelle1 <table border="1"><tbody><tr><td> % Der männlichen DNA in Female Hintergrund </td><td> Volumen (ul) 4ng/μl männliche DNA </td><td> Volumen (ul) 4ng/μl weibliche DNA </td><td> Gesamtvolumen (ul) </td></tr><tr><td> 0,2 </td><td> 1 </td><td> 499 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> 1 </td><td> 199 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 195 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 25 </td><td> 175 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 87,5 </td><td> 175 </td><td> 25 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 200 </td><td> 0 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Probenvorbereitung für die Standardkurve. Normale männliche und weibliche FVB / NJ Mäuse im Alter von 8-12wks geopfert wurden. Blood and BM-Zellen wurden gesammelt. DNAs aus männlichen und weiblichen Zellen Zellen wurden isoliert und erneut suspendiert in einer Konzentration von 4ng/μl. Die männlichen und weiblichen DNAs wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt, um die DNA-Standardprobe Mischungen erzeugen. 6. Echtzeit-PCR <ol><li> Richten Sie die PCR-Reaktion Platte durch Mischen SYBR Green supermix Reagenz mit Primer und genomische DNA. Das Reaktionsvolumen (20 ul) enthält 400 nM von jedem Primer und 5 ul Blutkörperchen genomische DNA (4ng/μl x5 ul = 20 ng) in jeder Reaktion. DNA samples und Standards wurden in dreifacher Ausführung gesetzt. Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 2 gezeigt. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Gene Namen </td><td> Vorwärts </td><td> Umkehren </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> 5&#39;-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA </td><td> 5&#39;-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG </td></tr><tr><td> Zfy1 </td><td> 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA </td><td> 5&#39;-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. RT-PCR-Primersequenz für murines und Bcl2 Zfy1. <ol start="2"><li> Führen PCR-Reaktion mit Biorad iQ5 PCR-Maschine mit den folgenden Bedingungen: 95 ° C, 3 Min., 42 Amplifikationszyklen bei 95 ° C für 10 sec, 58 ° C für 25 sec und 72 ° C für 15 s, durch ein Schmelz-Kurve folgt fort. </li><li> Erhalten Zyklus Schwelle (Ct)-Werte von Bio-Rad iQ5 2,1 Standard Edition Optical System. Calculate ACt (Ct Zfy1 &lt;/ Sup&gt;-Ct Bcl2) Wert und Zfy1 Expressionsniveau wird als der Wert von 2-δ Ct berechnet. </li><li> Stellen Standardkurven für jede Reaktion Serie mit 2-ACt Lesung aus bekannten männlichen / weiblichen Standard-Mischungen. Die Standardkurven werden durch Auftragen der mittleren von 2-ACt Wert Triplikaten dem bekannten% männlich-DNA im Gemisch mit linearen Regression Beschlag erzeugt. </li></ol>

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<li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+PIM+serine%2Fthreonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li>
</ol>

Wir haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offen zu legen.

Das Ziel unserer aktuellen Studie ist es, dem Publikum einen PCR-basierten Technik Donorzelle Transplantation in einem kompetitiven murine Knochenmark-Transplantation Modell zu quantifizieren. Mehrere Studien haben berichtet mittels RT-PCR, um Spenderzellen in der Transplantationsmedizin Modelle 9-10 zu erkennen. Dr. Schwarzenberger Die Gruppe entwickelte zunächst eine murine Knochenmark-Transplantation Modell mit real-time PCR zu amplifizieren y-Chromosom-spezifischen 8. Diese Methode wurde verwen...

Murine Knochenmark (BM) Transplantation Modell wurde erstmals in den 1960er Jahren 1 entwickelt. Dieses Modell wurde ausgiebig für das Studium der Donor hämopoetischen Stammzelle (HSC) Biologie in einem Wirt Empfängermaus verwendet. Murine Knochenmarktransplantation Modell hat uns mit wertvollen Wissen über HSC-Funktionen und deren Regulierung vorgesehen und in HSC Forschung unverzichtbar. Allogene Knochenmarktransplantation Modell wie C57Bl/6J H2b-Balb / C H2d oder kongene Transplantation Modell wie C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 werden in vielen Laboren verwendet, um die Genfunktion auf HSC Aktivität 2 studieren, Wirkung Arzneimittelbehandlung auf HSC Funktion 3 oder Transplantation Krankheiten wie Graft-versus-host disease (GvHD) 4. Zelloberflächenmarker wie MHC Haplotyp oder CD45.1 werden häufig zur Unterscheidung von Donor-abgeleiteten Zellen vom Empfänger-Ursprung Zellen verwendet. C57Bl/6J H2b, CD45.2 </sup&gt; sind Balb / C H2d und B6.SJL CD45.1 die am häufigsten verwendeten Mausstämmen in Knochenmarkstransplantation, weil die Donorzelle Beitrag kann leicht durch Durchflußzytometrie gemessen CD45.1 vs CD45.2 oder H2b vs beurteilen H2D. Allerdings sind viele andere Stämme, wie FVB / NJ 5 und C3H auch häufig verwendet, um gentechnisch transgenen oder Knockout-Mäuse zu erzeugen. Diese Mäuse können zu einer Inzuchtlinie rückgekreuzt und gewartet werden in einer gemischten genetischen / MHC Hintergrund. In diesen Fällen könnte Bestimmen Donorzelle Engraftment und HSC Funktion schwierig sein als Donor-spezifische Zelloberflächenmarker nicht zugänglich. Mit Y-Chromosom-spezifischen DNA-Sonde, um die Donor männlichen Zellen durch Southern-Blot in sex-mismatched Knochenmarktransplantation erkennen wurde zuerst von Dr. Miwa der Gruppe 6 entwickelt. Dann wurde ein Echtzeit-PCR zur geschlechtsbestimmenden Bereich Y festgestellt eine genaue und hochspezifische Methode ma quantifizieren seinle fetalen Zellen im mütterlichen Blut System 7. Dieses Konzept wurde von Dr. Schwarzenbergers Gruppe für die Entwicklung eines Echtzeit-PCR-Technik in einem murinen Knochenmark-Transplantation Modell Donorzelle Engraftment 8 bestimmen angepasst. Wir weiter diese Methode für die Messung der Donorzelle Transplantation in FVB / NJ Maus Knochenmarktransplantation Modell modifiziert. Dieses Verfahren wird derzeit intensiv in unserer Gruppe für die Untersuchung der Rolle von Pim1 Kinase in HSC Biologie genutzt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> Hitzeinaktiviertem </td></tr><tr><td> Ammoniumchlorid </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumbicarbonat </td><td> Fischer </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA Blood minikit </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> Zellsieb </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR Green supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 real time PCR-Maschine </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spectra Photometer </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

mittels quantitativer real-time pcr zum donor cell engraftment in einem competitive murine bone marrow transplantation modell fest

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine Knochenmark-Transplantation Modelle bieten ein wichtiges Instrument bei der Messung hämatopoetischen Stammzellen (HSC)-Funktionen und die Bestimmung Gene / Moleküle, die HSCs regulieren. In diesen Transplantationsmodell Systemen wird die Funktion des HSK durch die Fähigkeit dieser Zellen, einprägen und rekonstituieren letal bestrahlten Mäusen Empfängers bestimmt. Üblicherweise wird die Donorzelle Beitrag / Verpflanzung durch Antikörper gegen Donor-spezifische Zelloberflächenproteine ​​mittels Durchflusszytometrie gemessen. Allerdings ist diese Methode hängt stark von der Spezifität und die Fähigkeit des Zelloberflächenmarkers zu Donor-abgeleiteten Zellen von Empfänger-Zellen stammt, die möglicherweise nicht für alle Maus-Stämmen zu unterscheiden. Betrachtet man die verschiedenen Hintergründen von gentechnisch veränderten Mauslinien auf dem Markt, hat diese Zelle Oberfläche / Durchflusszytometrie basierende Methode erheblichen Einschränkungen vor allem in Maus-Stämme, die gut definierte Oberfläche Marker fehlen, um getrennte Spenderzellen aus kongene Empfänger cells. Hier haben wir über einen PCR-basierten Technik Donorzelle Engraftment / Beitrag Transplantatempfänger Mäusen zu bestimmen. Wir transplantiert männlichen Spender-Knochenmark HSCs zu letal bestrahlten kongene weiblichen Mäusen. Periphere Blutproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation gesammelt. Knochenmark-Proben wurden am Ende der Experimente erhalten. Genomische DNA wurde isoliert und das Y-Chromosom spezifischen Gens, Zfy1, wurde amplifiziert mittels quantitativer Echtzeit-PCR. Die Verpflanzung von männlichen Spenders-abgeleiteter Zellen in den weiblichen Empfängermäuse wurde gegen Standardkurve mit bekannten Anteil männlicher vs weiblichen DNAs berechnet. Bcl2 wurde als Referenz-Gen um das Gesamt-DNA Menge normalisieren verwendet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass dieser Ansatz zuverlässig bestimmt Donorzelle Verpflanzung und bietet eine nützliche, aber einfache Methode zur Messung hämatopoetischen Zellen Rekonstitution in murine Knochenmark-Transplantation Modelle. Unsere Methode kann routinemäßig in den meisten Labors durchgeführt werden, da keinekostspielige Ausrüstung wie Durchflusszytometrie erforderlich.

Abbildung 1 und 2 zeigten Beispiele von Standard-Kurven mit Mittelwerten von 2-ACt gegen Prozentangaben männlicher DNA. 1A zeigten spezifische Schmelztemperatur für Bcl2 und Zfy1 Amplikons bei 78,5 ° C und 88,5 ° C lokalisiert sind. Bcl2 wird als Referenz-Gen, um die Gesamtmenge der geladenen DNA in jeder PCR-Reaktion eingesetzt zu normalisieren. Bcl2 Amplifikationskurven (Log Ansicht) für jede Standardprobe miteinander unabhängig von männlichen DNA-Konzentration verschmelzen...

Bestimmung Donorzelle Transplantation stellt eine Herausforderung in der Maus Knochenmarktransplantation Modelle, die gut definierte phänotypische Marker fehlen. Wir beschrieben eine Methode zur männlichen Spenders Engraftment bei weiblichen Transplantatempfängers Mäusen zu quantifizieren. Dieses Verfahren kann in allen Mausstämmen zur Untersuchung von HSC-Funktionen verwendet werden.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine PCR-basierte Technik durchzuführen, um die Engraftment-Rate von Spenderzellen in einem kompetitiven murinen Knochenmark-Transplantationsmodell zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Knochenmark-Transplantation bei weiblichen Empfänger-Mäusen unter Verwendung von männlichen Spenderzellen durchgeführt wird. Anschließend wird peripheres Blut zu verschiedenen Zeitpunkten von den Empfänger-Mäusen entnommen und die genomische DNA isoliert. Die Proben werden zur Erstellung einer Standardkurve vorbereitet.Schließlich wird eine Echtzeit-PCR mit Standardproben und Testproben durchgeführt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch Berechnung anhand einer Standardkurve mit einem bekannten prozentualen Anteil männlicher gegenüber weiblicher DNA den Einwuchs männlich stammender Spenderzellen in weibliche Empfänger-Mäuse nachweisen. Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden wie einer auf Durchflusszytometrie basierenden Methode liegt in seiner höheren Empfindlichkeit, Wirtschaftlichkeit und der Möglichkeit, Proben über einen langen Zeitraum zu lagern.Vor allem ist unsere Technik weitgehend unabhängig vom genetischen Hintergrund und kann für beliebige genomische Hintergründe von Mäusen verwendet werden, beispielsweise anhand gut definierter Oberflächenmarker, um Spenderzellen von Empfängerzellen zu unterscheiden. Nach der Tötung von FVB/nj männlichen Spendern und weiblichen Mäusen arbeiten Sie unter einer laminarer Luftströmungswerkbank; verwenden Sie kleine Scheren und Pinzetten, um die Femur- und Tibiaknochen zu entnehmen, und legen Sie diese in eine 60 Millimeter große Zellkultur-Schale, die sechs Milliliter eiskaltes RPMI 1640 mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS enthält. Benutzen Sie ein Kim-Tuch, um Muskulatur und anderes Gewebe zu entfernen, und schneiden Sie beide Enden jedes Knochenröhrenabschnitts in der Schale ab. Verbinden Sie danach die Enden der Knochen mit einer 23-Gauge-Nadel, die an einer 3-cc-Spritze mit RPMI 1640 mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS befestigt ist, und spülen Sie das Knochenmark aus.Verwenden Sie dieselbe Nadel, um das Knochenmarkgewebe durch wiederholte Aspirationen zu disaggregieren. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 400 ×g. Nach dem Abgießen des Überstandes resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Raumtemperatur-Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie fünf bis 10 Milliliter RPMI 1640 mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS hinzufügen. Führen Sie die Zellen durch einen Zellfilter und sammeln Sie das Durchflussvolumen in einem neuen Röhrchen. Nach erneuter Zentrifugation der Zellen fünf Minuten bei 400 ×g und Entfernung des Überstandes sollte das Zellpellet keine rote Färbung aufweisen, was auf eine vollständige Entfernung roter Blutkörperchen hinweist. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter RPMI 1640 mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS. Nach vorsichtigem Vortexen geben Sie eine kleine Aliquotprobe in ein Hämozytometer und zählen die Zellen.Berechnen Sie das Zellvolumen, das erforderlich ist, um es mit konkurrierenden weiblichen Zellen im Verhältnis fünf zu zwei für eine Knochenmarktransplantation zu mischen. Als letzter Schritt zur Vorbereitung der Zellen für die Injektion mischen Sie die Donor- und Konkurrenz-Zellen, pelletieren Sie die Zellen, waschen Sie mit PBS und resuspendieren Sie in PBS bei einer Endkonzentration von fünf mal 10 hoch sechs pro Milliliter Donorzellen und zwei mal 10 hoch sechs pro Milliliter für Konkurrenz-Zellen, vier bis sechs Stunden vor der Knochenmarktransplantation. Bestrahlen Sie weibliche Empfängermäuse mit Cäsium-137-Gammastrahlung bei einer Einzeldosis von 11 Gray.Stellen Sie die bestrahlten weiblichen Mäuse in eine Mäusehalterung und injizieren Sie die gemischten Donator- und Konkurrenz-Zellen über die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen von 0,1 Milliliter, sodass jede Maus fünf mal 10 hoch 5 Donator-Zellen und zwei mal 10 hoch 5 Konkurrenz-Knochenmark-Zellen erhält, um Blutproben zu entnehmen. Nach der Anästhesie sammeln die Mäuse etwa 50 Mikroliter Blut in EDTA-beschichteten Röhrchen durch retroorbitale Blutentnahme. Sammeln Sie außerdem Proben von altersgerecht gepaarten männlichen und weiblichen Mäusen.Als Nächstes genomische DNA aus Versuchsmäusen und Mäusen isolieren. Für die Standardkurve etwa 200 Mikroliter RBC-Lysepuffer mit Raumtemperatur zu jeder Blutprobe hinzufügen und fünf Minuten lang inkubieren. Ein Milliliter PBS hinzufügen und kurz zentrifugieren, um den größten Teil der lysierten Erythrozyten zu entfernen.Danach die DNA mit einem Blut-DNA-Extraktionskit isolieren, wobei der Elutionspuffer auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. Zur Verbesserung der Ausbeute die DNA-Konzentration jeder Probe messen. Proben mit einem OD260/280-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0 werden für die weitere Analyse verwendet.Um eine Standardkurve aufzustellen, verdünnen Sie die männliche und weibliche DNA auf eine Konzentration von vier Nanogramm pro Mikroliter und bereiten die DNA-Mischung gemäß diesen Anleitungen vor. Richten Sie die PCR-Reaktionsplatte ein, indem Sie Cyber Green Super Mix-Reagenz mit den hier gezeigten Primern und genomischer DNA mischen. Jede 20-Mikroliter-Reaktion enthält 400 Nanomolar jedes Primers und fünf Mikroliter genomischer DNA aus Blutzellen, durchgeführt im Triplikat.Führen Sie die PCR gemäß den im Textprotokoll angegebenen Bedingungen durch und ermitteln Sie die Cycle-Schwellenwerte oder CT-Werte. Berechnen Sie Delta CT als Differenz CT hoch ZY1 minus CT hoch BCL2, und bestimmen Sie die ZY1-Expressionsniveaus als 2 hoch minus Delta CT. Erstellen Sie Standardkurven, indem Sie das arithmetische Mittel der Triplicate von 2 hoch Delta CT gegen den bekannten prozentualen Anteil männlicher DNA in der Mischung auftragen und eine lineare Regressionsgerade anpassen. Hier sind Beispiele für Standardkurven, die mit den Mittelwerten von 2 hoch Delta CT über den Prozentsätzen männlicher DNA dargestellt wurden.Dieses Diagramm zeigt eine spezifische Schmelztemperatur für die BCL2- und ZFY1-Amplicons, die bei 78,5 bzw. 88,5 Grad Celsius liegen. BCL2 dient als Referenzgen zur Normalisierung der insgesamt in jeder PCR-Reaktion eingesetzten DNA-Menge. Die BCL2-Amplifikationskurven für jede Standardprobe verlaufen unabhängig von der Konzentration männlicher DNA nahezu identisch, was auf gleichmäßige Mengen der eingesetzten DNA hinweist.Jedoch wanderten die Amplifikationskurven von ZFY nach links, je höher die Menge an männlicher DNA in der Probe war. Hämatopoetische Stammzellen von PIM-TKO-Mäusen weisen Defekte bei der Rekonstitution tödlich bestrahlter Mäuse auf, und wie erwartet wiesen die empfangenden Mäuse, die mit PIM-TKO-Zellen transplantiert worden waren, einen deutlich geringeren Anteil männlicher Zellen auf als Mäuse, die mit Wildtyp-Zellen transplantiert worden waren. Zur Validierung unserer Methode untersuchten wir die Integration männlicher Spenderzellen bei transplantierten weiblichen Mäusen, die Knochenmarkzellen von Wildtyp- im Vergleich zu PIM-Dreifach-Knockout- (TKO-)Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Transplantation erhalten hatten, wobei sowohl peripheres Blut nach sechs Wochen als auch Knochenmarkproben nach 16 Wochen analysiert wurden. Die Analyse erfolgte nach dem Ansehen dieses Videos.Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine PCR-basierte Methode verwendet, um die Einwanderung von Spenderzellen in einem kompetitiven Modell der marinen Knochenmarktransplantation zu quantifizieren.

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Medicine

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Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu...

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Knochenmarktransplantation bietet eine Möglichkeit, um den Genotyp der Knochenmark stammende Zellen zu ändern. Wenn das Gen von Interesse an beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen exprimiert wird, kann die Knochenmarktransplantation Knochenmark stammende Zellen zu einem anderen Genotyp ändern, ohne die nicht-Knochenmark stammende Zellen Genotyp.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

Dieses Video zeigt die Induktion der Darmtransplantat-gegen-Wirt-Krankheit, GvHD, bei einer tödlich bestrahlten Empfängermaus unter Verwendung von allogenen hämatopoetischen Stammzellen und GvHD-induzierenden Milz-alloreaktiven T-Lymphozyten. Dieses Protokoll hilft bei der Etablierung eines schweren akuten intestinalen GvHD-Modells, um den Mechanismus der Krankheit zu verstehen und innovative Therapieoptionen zu entwickeln.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit in Mausmodellen durch allogene Knochenmark- und Milzzelltransplantation

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Wir präsentieren ein schnelles und flexibles Protokoll für ein retrovirales In-vivo-Expressionssystem auf Basis eines einzelnen T-Zell-Rezeptors (TCR).  Retrovirale Vektoren werden verwendet, um Vorläuferzellen des Knochenmarks zu transduzieren, um die Entwicklung und Funktion eines einzelnen TCR in vivo als Alternative zu TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

Intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) von der Calvarium wird in Kombination mit genetischen Tiermodelle zur Untersuchung der Referenzfahrt und Engraftment des blutbildenden Zellen des Knochenmarks (BM) Nischen angewendet.

Kombination von intravitalen Fluoreszenz-Mikroskopie (IVFM) mit genetischen Modellen Engraftment Dynamik der blutbildenden Zellen des Knochenmarks Nischen zu studieren

Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Einrichtung kompetitiver Knochenmarktransplantationsexperimente an Mäusen, um die Funktion hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen ohne vorherige Reinigung von Stammzellen durch Zellsortierung zu untersuchen.

Competitive Transplantationen Blutstammzell-Fitness zur Bewertung

Dieses Manuskript bietet eine Beschreibung der Methodik, die zur Etablierung von Transduktions-Transplantations-Mausmodellen verwendet wurde. Es wird detailliert über technische Fehler berichtet, die bei der Durchführung von Knochenmarktransplantationen vermieden werden sollten. Es sollte ein klares Verständnis für die Bedeutung eines hohen Virustiters, Transfektion/Transduktion und Bestrahlung gewonnen werden.

Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Wir beschreiben drei Methoden der Knochenmarktransplantation (BMT): BMT mit Ganzkörperbestrahlung, BMT mit abgeschirmter Bestrahlung und BMT-Methode ohne Vorkonditionierung (adoptive BMT) zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese in Mausmodellen.

Knochenmarktransplantationsverfahren bei Mäusen zur Untersuchung der klonalen Hämatopoese

Dieses Protokoll beschreibt die intrafemorale Injektion einiger hämatopoetischer oder leukämischer Stammzellen, einschließlich geneditierter Zellen, in murine Xenotransplantatmodelle, die nicht nur eine schnelle und sichere Transplantation von Zellen, sondern auch serielle Analysen des Knochenmarks ermöglichen.

Vereinfachte intrafemorale Injektionen mit lebenden Mäusen ermöglichen eine kontinuierliche Knochenmarkanalyse

Lernen Sie eine PCR-basierte Methode zur Quantifizierung von Donor Cell Engraftment im kompetitiven murinen Knochenmarktransplantationsmodell. Diese Technik bietet höhere Sensitivität und Kosteneffizienz für Transplantationsbiologie.

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest (Video) | JoVE Journal

Mittels quantitativer real-time PCR zum Donor Cell Engraftment in einem Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Modell fest

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