Name: Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Erfahren Sie die metabolische Markierung neu transkribierter RNA mit 4-Thiouridin in eukaryotischen Zellkulturen. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen von RNA-Synthese, -Verarbeitung und -Abbau mit zehnfach höherer Sensitivität.

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Wir möchten Amie Regan für die sorgfältige Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde von NGFN Plus-Grant # 01GS0801, MRC Stipendium Zuschuss G1002523 und NHSBT Zuschuss WP11-05 LD und DFG FR2938/1-1 zu CCF unterstützt

1. Metabolische Markierung mit 4-Thiouridin Machen Sie einen detaillierten Plan des Versuchsaufbaus / schedule, z. B. wenn die 4SU auf Zellkultur hinzufügen und wenn die Proben zu ernten. Plan für mindestens 5 min zwischen jeder Bedingung. Nur behandeln Zellen einer Bedingung zu einer Zeit. Griff max. 3 - 5 Gerichte zu einem bestimmten Zeitpunkt. Griff Zellen möglichst schnell auf Veränderungen der Temperatur und CO 2-Gehalt zu minimieren. Vermeiden, dass die Zellen dem Licht nach 4SU zugesetzt, da dies zu einer Vernetzung der 4SU-markierten RNA an zelluläre Proteine ​​führen kann. Beginn der Kennzeichnung <ol><li> Thaw 4-Thiouridin (4SU) kurz vor der Verwendung und Pipette erforderliche Menge an 4SU für jede Bedingung in ein steriles Falcon-Röhrchen. </li><li> Nehmen Sie die erforderliche Menge an Zellkulturmedium (5 ml pro 10 cm Schale) von den Gerichten und in den 4SU-haltigen Falcon-Röhrchen und gründlich mischen. Entfernen und entsorgen Sie die restlichen Mittel aus den Gerichten. </li> &lt;li&gt; Übernehmen 4SU-haltigem Medium zurück zu den Gerichten. </li></ol> Ende der Etikettierung <ol start="4"><li> Entfernen Zellkulturmedium aus Zellen. 5 ml Trizol zu jeder Platte. Für komplexe Experimente mit mehreren Zeitpunkten oder Bedingungen, wird dieser Schritt am besten durch zwei Personen, ein Entfernen des Mediums, die andere Zugabe Trizol und Ernte des Lysats getan. </li><li> Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur für die komplette Zell-Lyse. </li><li> Verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die Platte sorgfältig spülen mit dem zusätzlichen Trizol. Dies hilft vollständige Zelllyse und Probe Erholung. Gehen Sie vorsichtig mit Trizol ist extrem gefährlich, wenn immer in Kontakt mit der Haut oder den Augen! Haben Gegenmittel für Phenol Verbrennungen an der Hand (z. B. Polyethylenglykol 300 oder 400 in der industriellen Brennspiritus (70:30)). Übertragen Proben Polypropylenröhrchen. Bitte beachten Sie, dass Standard-Falcon-Röhrchen nicht widerstehen diese hohen g-Kräfte). Die Proben können bei -20 ° C für mindestens einen Monat bis Gesamt-RNA aus der is hergestellt. </li></ol> 2. RNA Vorbereitung mit modifizierten Trizol Protocol <ol><li> 1 ml Chloroform (0,2 ml pro ml Trizol) und kräftig schütteln für 15 sec. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 - 3 min. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen wässrige obere Phase (mit dem RNA) in ein neues 15 ml Polypropylen-Röhrchen. </li><li> In der Reaktion ½ Volumen der beiden RNA Niederschlag Puffer und Isopropanol (zB auf 3 ml Überstand 1,5 ml RNA Niederschlag Puffer und 1,5 ml Isopropanol). </li><li> Gut mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> Spin down kurz (5.000 × g für 30 sec) und restliches Isopropanol mit 200 ul Pipette. </li><li> In ein gleiches Volumen 75% Ethanol und schütteln, bis das Rohr Pellet löst. Vermeiden Sie brechen sie in viele kleine Stücke, da dies, kann die Entfernung von Rückständenl Ethanol schwierig. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> Spin down RNA kurz und entfernen restliche Ethanol mit einer 200 ul Pipette. Wiederholen Sie Schritt und entfernen restliche Ethanol mit einem 20 ul Pipette. Nach diesen beiden Schritten sollten keine weiteren Trocknung der Pellets vorgenommen werden. </li><li> In 100 ul H 2 O pro 100 ug erwartet RNA-Ausbeute und gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5-6 mal, um das Lösen der RNA zu unterstützen. </li><li> Auflösen und denaturieren RNA durch Erhitzen auf 65 ° C für 10 min (Shaker) und sofort auf Eis stellen. </li><li> Messen RNA-Konzentration bei 260 nm mit einem Spektralphotometer NanoDrop, nach den Anweisungen des Herstellers. Diese RNA kann bei -80 ° C für mindestens einen Monat gelagert werden. </li></ol> 3. Thiol-spezifische Biotinylierung von Neu transkribierten RNA <ol><li> Beginnen Sie mit 60 - 80 ug Gesamt zellulären RNA. </li><li> Bilden Kennzeichnung Reaktion. Pipette in der folgendenBestellung (pro ug RNA): <ol class="lalpha"><li> 1 ul 10x Biotinylierung Buffer </li><li> 7 ul RNA (mit 1 ug RNA in Nuklease-freiem H 2 O verdünnt) </li><li> 2 ul Biotin-HPDP (1 mg / ml DMF) </li></ol></li></ol> Fügen Sie immer die Biotin-HPDP letzte und sofort mischen durch Pipettieren. Falls die Biotin ausfällt, kann DMF-Gehalt bis zu einer Endkonzentration von 40% gesteigert werden. <ol start="3"><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 1,5 h bei Drehung. </li><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen Chloroform. Gründlich mischen. Inkubieren 2 - 3 Minuten, bis die Phasen zu trennen beginnen und Blasen beginnen zu verschwinden. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig übertragen die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 einmal. Sie können diesen Schritt in 2 ml Phase Lock Gel Schwere Rohre führen zum Verlust der RNA zu reduzieren. </li><li> RNA Niederschlag: Add 1/10 das Volumen von 5 M NaCl und ein gleiches Volumen vonIsopropanol auf die Wasserphase. </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> In ein gleiches Volumen 75% Ethanol, Zentrifuge bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen. </li><li> Spin kurz und entfernen Restethanol mit 200 ul Pipette. </li><li> Spin kurz und entfernen restliche Ethanol mit 20 ul Pipette. </li><li> Nicht in die RNA zu trocknen. Re-suspend es in 50 - 100 ul H 2 O (~ 1 ul pro 1 ug Eingang RNA). Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5 - 6 mal. </li><li> Prüfen RNA-Qualität durch elektrophoretische Analyse auf RNA-Abbau auszuschließen. </li></ol> 4. Dot-Blot-Analyse von 4SU-Einbau (Optional) 4SU ​​Einarbeitung kann leicht durch Dot-Blot-Analyse von biotinylierten RNA bestimmt werden. Dies ist ein optionaler Schritt, Fehlersuche und Abschätzung der 4SU Einbauraten relativ zu einem biotinylierten DNA-Oligo-Steuerung ermöglicht. Für diesen Test wir rIhr Kommentar zu Verwendung iodoacetyl-Biotin statt Biotin-HPDP für Biotinylierung 4SU-markierte RNA in Schritt 3.2. Dies führt zu einer irreversiblen Biotinylierung 4SU-RNA. Daher Spalte-Methoden (z. B. RNeasy) kann zur Rückgewinnung von viel kleineren Mengen von biotinylierten RNA (z. B. 5 ug) verwendet werden. Während RNA biotinyliert mit Biotin-HPDP eignet sich auch für diesen Assay ist das resultierende Signal schwächer und das Signal-Rausch-Verhältnis schlechter (Abb. 3). <ol><li> Verfolgen Sie das Protokoll für 4SU-Kennzeichnung und Isolierung von Gesamt-RNA zellulären wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. </li><li> Biotinylieren 4SU-markierte RNA, wie in Kapitel 3 beschrieben ersetzt Biotin-HPDP mit iodoacetyl-Biotin und führen zwei Chloroformextraktionen vollständig zu entfernen übermäßige iodoacetyl-Biotin-Reste. </li><li> Recover biotinylierten RNA durch Isopropanol / Ethanol-Fällung wie beschrieben oder unter Verwendung einer Säule-basierten Ansatz (z. B. RNeasy) bei kleinen Mengen von RNA (&lt;10 pg) Verwendet. </li><li> Inkubieren Sie die Zeta Membran in Nuklease-freiem Wasser mit rockigen für 10 min. </li><li> Nehmen Sie die Membran aus der Nuklease-freies Wasser und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Membran zwischen zwei saubere Papierhandtücher und fest andrücken. Air-Trocknen der Membran für 5 min in schöner Punkten führen. </li><li> Für jede Probe, bereiten 20 ul 200 ng / ul RNA mit eiskaltem Dotblot Bindungspuffer (10 mM NaOH, 1 mM EDTA). Bewerben 5 ul dieser Verdünnung (dh 1 ug RNA) sowie drei weiteren 10-fache Verdünnungen (dh 100, 10 und 1 ng RNA, respectively) zum Zeta Membran durch Pipettieren. Pipettieren durch einen leeren Rack Pipettenspitzen verwendet werden, um gleichmäßig verteilt Abstand zu liefern. Alternativ können Sie einen Dot-Blot gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Anwenden 5 ul der Biotin-markierten DNA-Oligo in Konzentrationen von 20 ng / ul bis 20 pg / ul (dh 100 bis 0,1 ng Oligo) als positive control der Membran durch Pipettieren. Verwenden Sie einen biotinylierten, 4SU-naive Probe als negative Kontrolle. </li><li> Luft trocknen die Membran für 5 min. </li><li> Inkubieren der Membran für 30 min in 40 ml Blockierungspuffer unter Schütteln. </li><li> Inkubieren der Membran mit 10 ml 1:1000 Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase für 15 min (5 ml PBS + 5 ml 20% SDS + 10 ul Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase) </li><li> Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 10% SDS (20 ml PBS + 20 ml 20% SDS) für 5 min. </li><li> Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml 20% SDS) für 5 min. </li><li> Waschen Membran zweimal in 40 ml PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 ul 20% SDS) für 5 min. </li><li> Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Membran zwischen zwei saubere Papierhandtücher und Druck auf sie fest. </li><li> Visualisieren Membran-gebundenen HRP mit ECL den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Legen Sie die Membran in Folie / Beutel, Luftblasen entfernen und Inkubation für 2 min im Dunkeln. </li><li> Expose MembranFilm für 1 - 5 min. </li></ol> 5. Trennung von markierten und unmarkierten RNA unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen <ol><li> Wärme Waschpuffer (3 ml pro Probe) bis 65 ° C in einem Wasserbad inkubiert. </li><li> Bereiten Sie frischen 100 mM Dithiothreitol (DTT) in Nuklease-freiem H 2 O. Tun Sie dies durch Dekantieren 15 - 30 mg DTT Pulver in ein sauberes 50 ml Falcon-Röhrchen auf der ultra-feinen Waage gelegt. Wiegen und fügen erforderliche Menge an Nuklease-freiem H 2 O. </li><li> Wärme biotinylierte RNA-Proben auf 65 ° C für 10 min zur Denaturierung und sofort auf Eis stellen. </li><li> Platz μMacs Spalten in die magnetische Halterung. Wir empfehlen, nicht mehr als 12 Proben in einer Zeit (6 - 8 Proben sind optimal) zu verarbeiten. </li><li> Pre-Abgleichtransistor Miltenyi Säulen mit 1 ml Waschpuffer Raumtemperatur. Dies dauert etwa 15 min. </li><li> Inzwischen werden 100 ul Streptavidinbeads zu 50 - 100 ul biotinylierten RNA. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min mit der Drehung. </li> &lt;<html> li&gt; Wenn eine der Spalten nicht eingeleitet hat Ablassen von nun dies kann durch leichten Druck auf die Spitze der Säule mit einem behandschuhten Finger erleichtert werden. Sobald die Strömung hat begonnen die Säulen leicht abfließen kann. </li><li> Übernehmen Sie die RNA / Perlen an den Säulen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch es sei denn, Sie wollen die unmarkierten RNA-Fraktion (siehe Abschnitt 7) zu erholen. </li><li> Waschen dreimal mit 0,9 ml 65 ° C Waschpuffer (1 ml Pipettenspitzen schrumpfen beim Pipettieren Puffer bei 65 ° C). </li><li> Dreimal mit 0,9 ml Waschpuffer Raumtemperatur. </li><li> Pipette 700 ul Puffer RLT (RNeasy MinElute Cleanup Kit, Qiagen) in neue 2-ml-Röhrchen und legen Sie sie unter den Spalten. </li><li> Eluieren neu transkribierten RNA in die RLT-Puffer durch Zugabe von 100 ul 100 mM DTT zu den Spalten. </li><li> Führen Sie eine zweite Elution Runde 3 min später in das gleiche Rohr durch das Hinzufügen eines weiteren 100 ul 100 mM DTT. </li></ol> 6. Wiederherstellung der neu transkribierten RNA NHALT &quot;&gt; mit dem RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) nach Protokoll des Herstellers weiter. Elute in 25 ul Nuklease-freiem H 2 O. Measure RNA-Konzentrationen mit einem Spektralphotometer Nanodrop. Um den Bedarf auftauen und wieder einfrieren RNA vor dem Absenden zu vermeiden es zu einem High-Throughput-Assay, empfehlen wir die Vorbereitung unmittelbar nach dem neu transkribierten RNA cDNA gereinigt wird. Verwenden Sie 2,5 ul der neu transkribierten RNA in 20 ul cDNA-Synthese-Mix für cDNA-Synthese nach den Anweisungen des Herstellers. Führen qRT-PCR-Kontrollen unter Verwendung von 1 : 10 Verdünnungen der cDNA mix Shop RNA bei -80 ° C.. 7. Rückgewinnung von unbeschriftet, Unbound RNA (Optional) Bei der ungebundenen RNA wiederhergestellt werden muss, sammeln und kombinieren die Flow-Through (nach Zugabe der RNA-Streptavidinbeads Lösung für die Spalten) und die erste Wäsche für anschließende Fällung. In der Regel genügt es zur Ausfällung nur 50% des ungebundenen RNA als this enthält&gt; 80% des Ausgangsmaterials. <ol><li> Fügen Sie dem gleichen Volumen Isopropanol (kein Salz muss hinzugefügt wie der Waschpuffer enthält bereits 1 M NaCl werden). </li><li> Zentrifuge bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> In ein gleiches Volumen 75% Ethanol, Zentrifuge bei 20.000 × g für 10 min bei 4 ° C, Überstand verwerfen. </li><li> Spin kurz und entfernen Restethanol mit 200 ul Pipette. </li><li> Spin kurz und entfernen restliche Ethanol mit 20 ul Pipette. </li><li> Nicht in die RNA zu trocknen. Resuspendieren in 100 ul H 2 O. Gut mischen durch Auf-und Abpipettieren 5 - 6 mal. Inkubation bei 65 ° C für 10 min unter Schütteln und übertragen direkt zu Eis. </li><li> Prüfen RNA-Qualität durch elektrophoretische Analyse auf RNA-Abbau auszuschließen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Metabolische Markierung von neu transkribierten RNA wesentlich verbessert die Leistung von High-Throughput-Technologien wie Microarrays und RNA-seq durch die Bereitstellung geeigneter Vorlagen, um die biologische Frage von Interesse anzusprechen. Das vorliegende Protokoll umfangreich Optimierung. Es erlaubt&gt; 1000-fache Anreicherung von neu transkribierten RNA und bietet hoch reproduzierbare Ergebnisse. Der experimentelle Aufbau eines 4SU-Tagging Experiment ist von entscheidender Bedeutung...

Gene Expression Profiling ist ein wichtiges Instrument verwendet, um zelluläre Prozesse und die damit verbundenen komplexen Interaktion Netzwerk studieren. Studien zur mRNA waren typischerweise die Methode der Wahl, um grundlegende Einblicke in die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erhalten. Die Entwicklung der gesamten Transkriptom-Microarrays 1 und, in jüngerer Zeit, der nächsten Generation Sequenzierung von RNA (RNA-seq) 2-4 angeheizt diesen Ansatz. Während diese Technologien revolutioniert unser Verständnis der Komplexität der zellulären Genexpression, stehen sie wesentliche Einschränkungen aufgrund ihrer intrinsischen Eigenschaften der Vorlage Probe, dh gesamten zellulären RNA. Erstens, kurzfristige Veränderungen in Gesamt-RNA Ebenen nicht übereinstimmen Änderungen in Transkriptionsraten, sind aber von Natur aus abhängig von der RNA-Halbwertszeit der jeweiligen Transkripte. Während eine fünffache Induktion eines kurzlebigen Transkript, zB Codierung für einen Transkriptionsfaktor, wird leicht nachweisbar sein in Gesamt-RNAinnerhalb einer Stunde die gleiche Induktion einer langlebigen Transkript, z. B. Codierung für ein metabolisches Enzym, bleiben nahezu unsichtbar. Darüber hinaus, auch eine komplette Abschaltung (&gt; 1.000-fach Down-Regulation) in der Transkription von durchschnittlich Gen mit einer RNA-Halbwertszeit von fünf Stunden nehmen Sie einfach fünf Stunden seines gesamten RNA-Spiegel von nur zweifache verringern . Daher begünstigt Analyse von Gesamt-RNA die Erkennung von Up-Regulation von kurzlebigen Transkripte, von denen viele für Transkriptionsfaktoren und Gene mit regulatorischen Funktionen 5 codieren. Darüber hinaus wird die tatsächliche kinetische Kaskade Regelung verdunkelt und primären Signalwege nicht von sekundären unterschieden werden. Beide wiederum zu erheblichen Verzerrungen in stromabwärts bioinformaticsanalysen führen. Zweitens können Veränderungen in Gesamt-RNA Levels nicht auf Änderungen in der RNA-Synthese oder Zerfall zugeschrieben werden. Messungen der Letztere erfordern Zelle invasive Ansätze, z. B. Blockierung transcriptizur Verwendung von Actinomycin D 6, und erweiterte Überwachung der laufenden RNA Verfall im Laufe der Zeit. Bei einer mittleren mRNA Halbwertszeit in Säugerzellen von 5 - 10 h 5,7, wird mRNA-Spiegel der meisten Gene nur um weniger als das Doppelte nach mehreren Stunden der transkriptionellen Verhaftung verringert. Diese eher kleine Unterschiede führen in grob ungenaue Messungen von mRNA Halbwertszeiten für die meisten zellulären Genen aufgrund der exponentiellen Natur der zugrunde liegenden mathematischen Gleichungen. Schließlich, während RNA-seq der gesamten zellulären RNA ergab, dass etwa die Hälfte unserer Gene unterliegen alternatives Spleißen Veranstaltungen 8, den zugrunde liegenden Kinetik sowie die dynamischen Mechanismen Führung Gewebe-und Kontext-spezifische Regulation der RNA-Prozessierung noch schwer abzuschätzen sind. Darüber hinaus verarbeitet der Beitrag der RNA zu differentiellen Genexpression, insbesondere für nicht-kodierenden RNAs, bleibt zu bestimmen. Insgesamt stellen diese Einschränkungen Haupthindernisse fürbioinformatische kinetische Modellierung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Vor kurzem haben wir eine Methode entwickelt, genannt hochauflösende Genexpressionsanalysen, um diese Probleme zu überwinden 5,7,9. Es basiert auf metabolische Markierung der neu transkribierten RNA unter Verwendung von 4-Thiouridin (4SU-Tagging), ein natürlich vorkommendes Uridinderivat basiert und bietet direkten Zugang zu neu transkribierten Transkripte mit minimaler Störung des Zellwachstums und der Genexpression (siehe Abbildung 1) 5, 10-12. Exposure von eukaryotischen Zellen zu 4SU Ergebnisse in seine schnelle Aufnahme, Phosphorylierung 4SU-Triphosphat und Einbau in neu transkribierten RNA. Nach Isolierung der gesamten zellulären RNA ist die 4SU-markierten RNA-Fraktion Thiol-spezifisch biotinylierte Erzeugen einer Disulfidbrücke zwischen Biotin und den neu transkribierten RNA. &#39;Total zellulären RNA&#39; kann dann quantitativ in markierte (&#39;neu transkribiert&#39;) und unmarkierten (&#39;pre-existin getrennt werdeng &#39;) RNA mit hoher Reinheit unter Verwendung von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen. Schließlich wird markierten RNA aus den Perlen durch Hinzufügen eines Reduktionsmittels (z. B. Dithiothreitol) Spalten der Disulfidbrücke und Lösen der neu transkribierten RNA aus den Perlen zurückgewonnen. Neu transkribiert RNA zeigt die transkriptionelle Aktivität von jedem Gen während des Zeitrahmens 4SU Exposition. 4SU-Tagging in der Zeitskala von Minuten stellt somit eine Momentaufnahme der eukaryotischen Genexpression und eine ideale Vorlage für down-stream bioinformatischen Analysen (z. B. Promotor-Analyse). In Fällen, in denen stationären Bedingungen angenommen werden kann, die Verhältnisse neu transkribiert / total neu transkribiert / unmarkiertem und unmarkierten / Gesamt-RNA liefern nicht-invasiven Zugang zu präzisen RNA Halbwertszeiten 7,13. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die neu transkribierten RNA nach nur 5 min von 4SU-Tagging (5 min 4SU-RNA) gereinigt beachten ist jünger als 15 und 60 min 4SU-RNA.Bei der Durchführung sowohl ultra-kurz und zunehmend länger 4SU-Tagging in einem experimentellen Setting mit RNA-seq kombiniert, werden die Kinetik der RNA-Prozessierung bei Nukleotid Auflösung 9 offenbart. Schließlich erlauben Zeitverlauf Analysen neu transkribiert und Gesamt-RNA mit Computermodellen kombiniert eine integrative Analyse der RNA-Synthese und Zerfall 14. Zusammenfassend kann dieser Ansatz zur direkten Analyse der Dynamik der RNA-Synthese, Verarbeitung und Zersetzung in eukaryotischen Zellen. Es gilt in allen wichtigen Modellorganismen einschließlich Säugetiere, Insekten (Drosophila), Amphibien (Xenopus) und Hefe 5,15,16. Es ist direkt kompatibel mit Microarray-Analyse 5,17, RNA-seq 9,13,14, und gilt in vivo 12,15. Hier haben wir ausführlich die Methodik zu beschriften, zu isolieren und zu reinigen, neu transkribierten RNA in kultivierten Säugetierzellen. Darüber hinaus Potentiometeral Probleme und Fallstricke werden diskutiert.

<table><tbody><tr><td>4-Thiouriidin</td><td>Carbosynth</td><td>T4509</td><td>Bereiten Sie 50 mM Vorrat in sterilem H2O vor, lagern Sie bei -20 μV; C in Aliquoten von 50-500 &mu; L, nicht verwendetes Reagenz entsorgen, nicht wieder einfrieren.</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td><td><stark>WARNUNG - ÄTZEND und GESUNDHEITSGEFÄHRDEND!</STARK> Sofortiger Zugang zu Phenol-Gegenmittel (PEG-Methanol); Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>372978</td><td>WARNING - GESUNDHEITSGEFÄHRLICH</STARK></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat, nukleasefrei</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td>1,6 M Stammlösung mit nukleasefreiem Wasser herstellen.</td></tr><tr><td>5M nukleasefreies NaCl</td><td>Sigma</td><td>71386</td><td>Stammlösung</td></tr><tr><td>Nukleasefrei H2O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>Herstellung von 1 ml Aliquoten in nukleasefreien Röhrchen.</td></tr><tr><td>RNA-Fällungspuffer</td><td></td><td></td><td>1,2 M NaCl, 0,8 M Natriumcitrat in nukleasefreiem Wasser. Bereiten Sie sich im Voraus unter streng nukleasefreien Bedingungen vor. Bei Raumtemperatur in 50 ml Falkenröhrchen lagern.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Verwendung mit nukleasefreiem Wasser zur Herstellung von 80% Ethanol, Lagerung bei -20 °C.</td></tr><tr><td>1 M nukleasefreies Tris Cl, pH 7,5</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stammlösung</td></tr><tr><td>500 mM nukleasefreies EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stammlösung</td></tr><tr><td>10x Biotinylierungspuffer (BB)100</td><td></td><td></td> <td>mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in nukleasefreiem Wasser, Aliquote von 1 ml herstellen.</td></tr><tr><td>Dimethylformamid (DMF)</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Bereiten Sie 1 mg/ml Stammlösung vor, indem Sie 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF auflösen. Durch die sanfte Erwärmung wird die Solubilisierung verbessert. Bei 4 Grad lagern; C in Aliquoten von 1 ml.</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy Tuben 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0032 005.152</td><td>Optional für den Schritt der Chloroform-Extraktion.</td></tr><tr><td>Zeta-Membran</td><td>BIORAD</td><td>162-0153</td><td></td></tr><tr><td>10x Dot-Blot-Bindungspuffer</td><td></td><td></td><td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Biotin-Oligo</td><td></td><td></td><td>5'-Biotin, 25 Nukleotide, beliebige</td></tr><tr><td>Sequenz Natriumdodecylsulfat</td><td>Fisher BPE9738</td><td></td><td>Für 100 ml 20%ige Stammlösung 20 g SDS auf 80 ml PBS pH 7-8 geben und das Volumen auf 100 ml einstellen. Alle hochprozentigen SDS-Lösungen über 20 °C warm halten die Lösungen sollten leicht ausfallen.</td></tr><tr><td>EZ-Link Iodacetyl-LC-Biotin</td><td>Pierce</td><td>21333</td><td>Bereiten Sie 1 mg/ml Stammlösung vor, indem Sie 50 mg Iodacetyl-Biotin in 50 ml DMF auflösen. Durch die sanfte Erwärmung wird die Solubilisierung verbessert. Bei 4 Grad lagern; C in Aliquoten von 1 ml. Erzeugt eine irreversible, thiolspezifische Biotinylierung.</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Dot-Blot-Blocking-Puffer</td><td></td><td></td><td>Mischen Sie 20 ml 20% SDS mit 20 ml 1 x PBS pH 7-8 und fügen Sie EDTA bis zur Endkonzentration von 1 mM hinzu.</td></tr><tr><td>Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase </td><td>Vector Laboratories</td><td>SA5004</td><td>Bei -20 & °C lagern. Mischen Sie 10 ml 20% SDS mit 10 ml 1 x PBS. Addieren Sie 20 &mu; l Streptavidin-HRP vor der Anwendung. </td></tr><tr><td>ECL-Reagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>RNP2109</td><td>gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden.</td></tr><tr><td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19236</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Lagern Sie die Kügelchen bei 4 °C.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Waschpuffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in nukleasefreiem H2O.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43817</td><td>Als 100 mM DTT in nukleasefreiem H2O zubereiten, vor Gebrauch immer frisch zubereiten.</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Lagern Sie Säulen bei 4 > C, die restlichen Bestandteile des Kits bei Raumtemperatur.</td></tr><tr><td>1,5 ml Schraubhülsen aus Polypropylen</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td>Kompatibel mit Dimethylformamid</td></tr><tr><td>2,0 ml Röhrchen aus Polypropylen mit Schraubverschluss</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td>Kompatibel mit Dimethylformamid</td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Kompatibel mit Dimethylformamid</td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Kompatibel mit Dimethylformamid</td></tr><tr><td colspan="4">Alle Lösungen/Reagenzien sollten bei Raumtemperatur gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.</td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstung </td></tr><tr><td>UV/VIS-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>oder gleichwertig. Verwenden Sie eine geringe Lautstärke (1-2 &mu; l) für Messungen niedriger RNA-Konzentrationen, um übermäßige Probenverluste zu vermeiden.</td></tr><tr><td>15-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>VWR International</td><td>525-0153</td><td>Im Gegensatz zu Standard-15-ml-Röhrchen vertragen diese bis zu 15.000 &#215; g</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td>Oder gleichwertige Geräte, die 13.000&#215 erreichen können; g</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitsrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA-16250</td><td>Oder gleichwertige Ausrüstung, die 13.000&#215 erreichen kann; g</td></tr><tr><td>Adapter für 15 ml Gefäße</td><td>Laborger&#228; te Beranek</td><td>356964</td><td>Oder gleichwertige Ausrüstung, die 13.000&#215 erreichen kann; g</td></tr><tr><td>Gekühlte Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Oder gleichwertig.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer compact</td><td>Oder gleichwertig.</td></tr><tr><td>Magnetständer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Ein Ständer fasst 8 μm; Macs-Spalten.</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Grant</td><td>SUB Aqua 5</td><td>oder gleichwertig.</td></tr><tr><td>Ultrafeine Mensur</td><td>A& D</td><td>GR-202</td><td>oder gleichwertig.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>Für RNA-Gele; oder gleichwertig.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% Agarose-Fertiggele</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>Für RNA-Gele; oder gleichwertig.</td></tr></tbody></table>

metabolische markierung der neu transkribierten rna für high resolution gene expression profiling von rna synthese, verarbeitung und decay in zellkultur

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Die Entwicklung der gesamten Transkriptom-Microarrays und Sequenzierung der nächsten Generation revolutioniert unser Verständnis der Komplexität der zellulären Genexpression. Zusammen mit einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen beteiligt sind genaue Messungen der zugrundeliegenden Kinetik immer wichtiger. Hier stehen diese leistungsstarken Methoden wesentliche Einschränkungen aufgrund intrinsischen Eigenschaften der Vorlage Proben sie studieren, dh gesamten zellulären RNA. In vielen Fällen Veränderungen in zelluläre Gesamt-RNA entstehen entweder zu langsam oder zu schnell, um die molekularen Mechanismen und deren Kinetik mit ausreichender Auflösung darzustellen. Darüber hinaus werden der Beitrag der Änderungen in der RNA-Synthese, Verarbeitung und Zerfall nicht ohne weiteres unterschieden. Wir haben vor kurzem entwickelte hochauflösende Genexpressionsanalysen, diese Einschränkungen zu überwinden. Unser Ansatz basiert auf metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-thiouri Basisdine (daher auch als 4SU-Tagging bezeichnet) durch rigorose Reinigung neu transkribiert RNA mit Thiol-spezifische Biotinylierung und Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen gefolgt. Es ist für einen breiten Bereich von Organismen einschließlich Vertebraten, Drosophila und Hefe. Wir haben erfolgreich angewendet 4SU-Tagging, um Echtzeit-Kinetik der Transkriptionsfaktor Aktivitäten zu untersuchen, liefern präzise Messungen der RNA Halbwertszeiten und erhalten neue Einblicke in die Kinetik der RNA-Prozessierung. Schließlich können Computermodelle eingesetzt, um eine integrierte, umfassende Analyse der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erzeugen.

1. Ausgangsmaterial und erwartete Renditen Nach 1 Std. (hr) von 4SU-Exposition neu transkribierten RNA entspricht etwa 1-4% der gesamten zellulären RNA. Dies wird niedriger sein Wachstum verhaftet Zellen, da sie nicht mehr synthetisieren RNA zur Rechenschaft für das Zellwachstum / Replikation. Als Kennzeichnung für 1 Stunde, empfehlen wir der Testdurchführung mit 60 - 80 ug Gesamt-RNA. Beginnend mit weniger als 30 ug Gesamt-RNA Ergebnisse in kleinen RNA-Pellets, die schwer nach der Biotinylieru...

Zelluläre Gesamt-RNA ein Template für die Untersuchung schlechte kurzfristige Änderungen in der RNA-Synthese und Zerfall sowie die Kinetik der RNA-Prozessierung. Hier beschreiben wir metabolische Markierung der neu transkribierten RNA mit 4-Thiouridin gefolgt von Thiol-spezifische Biotinylierung und Aufreinigung von neu transkribierten RNA ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden.

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Diese Methode zielt darauf ab, die Kinetik der RNA-Synthese, -verarbeitung und -Abbaus in Kulturen eukaryotischer Zellen direkt und präzise zu messen. Die Zellen werden in Gegenwart von vier Thio-Uridin inkubiert, um die neu transkribierte RNA metabolisch zu markieren, anschließend werden die markierten Zellen lysiert und die gesamte zelluläre RNA gereinigt. Danach erfolgt eine thiol-spezifische Biotin-Markierung, um gezielt die neu transkribierten RNA-Moleküle zu biotinylieren. Im nächsten Schritt werden mittels streptavidinbeschichteter magnetischer Kügelchen die mit vier Thio markierten, neu transkribierten Transkripte von der bereits vorhandenen RNA abgetrennt. So erhält man RNA-Fraktionen, die gesamte, neu transkribierte sowie unlaborierte, bereits vorhandene RNA enthalten.Die RNA kann anschließend einer downstream-Analyse unterzogen werden, einschließlich Q-R-T-P-C-R, Mikroarrays oder Next-Generation-Sequenzierung. Im Vergleich zu Studien zur Gesamtzell-RNA ermöglicht die Analyse neu transkribierter RNA eine etwa zehnfach höhere Empfindlichkeit bei der Detektion kurzfristiger Veränderungen der Genexpression. Darüber hinaus erlaubt sie präzise Messungen der Halbwertszeiten von RNA und macht erstmals tatsächlich die Kinetik der RNA-Prozessierung sichtbar. Die metabolische Markierung neu synthetisierter Transkripte kann erfolgreich eingesetzt werden, um die regulatorischen molekularen Mechanismen der Genexpression aufzuklären.Es kann auch auf andere Modellorganismen wie ops, oph und Hefe angewendet werden. Beginnen Sie mit einem detaillierten Versuchsplan, wobei zwischen jeder Bedingung mindestens fünf Minuten eingeplant werden sollten. Tauen Sie die vier Thio-Uridin-Markierungen kurz vor Gebrauch auf und pipettieren Sie die für jede Bedingung benötigte Menge in sterile Falcon-Röhrchen ab. Für jede Behandlungsbedingung überführen Sie fünf Milliliter des Zellkulturmediums von jeder 10-Zentimeter-Kulturschale in das Röhrchen mit vier Thiopurinen und mischen gründlich ab. Aspirieren Sie anschließend das verbleibende Medium von den Kulturen. Danach geben Sie das markierte Medium zurück zu den Zellen und inkubieren für die experimentell definierte Zeit. Nach dem Entfernen des Zellkulturmediums geben Sie fünf Milliliter Triol pro Platte hinzu.Die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um eine vollständige Zelllyse zu gewährleisten. Die Platte vorsichtig mit dem zugesetzten Triol spülen und die Proben in Polypropylenröhrchen überführen, die einer Zentrifugation bei 13.000 G standhalten können. Die Proben können dann bei minus 20 Grad Celsius gelagert oder direkt zur Gewinnung der gesamten zellulären RNA gemäß dem Triol-Protokoll verwendet werden. Beginnen Sie mit Proben von 60 bis 80 Mikrogramm gesamter zellulärer RNA. Für die Markierungsreaktion ein Mikroliter 10x Biotin-Puffer zu einem Mikrogramm RNA hinzufügen, die in sieben Mikrolitern nukleasefreiem Wasser verdünnt ist.Dann zwei Mikroliter Biotin-HPDP in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter zugeben, jeweils pro Mikrogramm RNA in DMF, und sofort durch Pipettieren vermischen. Falls Biotin ausfällt, kann der DMF-Gehalt erhöht werden. Die Endkonzentration von 40 % erreichen und die Reaktion für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren.Fügen Sie anschließend eine gleiche Menge Chloroform hinzu, mischen Sie kräftig und inkubieren Sie zwei bis drei Minuten lang, bis sich die Phasen zu trennen beginnen und die Blasen zu verschwinden beginnen. Zentrifugieren Sie die Proben und übertragen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase in ein neues Gefäß. Nach einer zweiten Chloroform-Extraktion fügen Sie ein Zehntel des Volumens einer fünf Molaren Natriumchlorid-Lösung sowie eine gleiche Menge Isopropanol hinzu.Um die RNA aus der wässrigen Phase auszufällen, pelletieren Sie die RNA durch Zentrifugation. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet einmal mit einem gleichen Volumen 75 %igem Ethanol nach der Zentrifugation; danach entsorgen Sie den Überstand. Zentrifugieren Sie kurz und entfernen Sie das restliche Ethanol mit einer 200-Mikroliter-Pipette.Zentrifugieren Sie erneut und entfernen Sie das restliche Ethanol mit einer 20-Mikroliter-Pipette. Resuspendieren Sie die RNA in 50 bis 100 µL Wasser, indem Sie gründlich durch Pipettieren mischen. Überprüfen Sie die RNA-Qualität mittels Elektrophorese, um eine RNA-Degradation auszuschließen.Temperieren Sie drei Milliliter Waschpuffer pro Probe auf 65 Grad Celsius in einem Wasserbad. Denaturieren Sie außerdem die biotinylierten RNA-Proben 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Anschließend sofort auf Eis stellen.Stellen Sie die Micromax-Säulen in den Magnetständer. Preequilibrieren Sie die Milton-e-Säulen mit einem Milliliter Waschpuffer bei Raumtemperatur. Geben Sie in der Zwischenzeit 100 Mikroliter Streptavidin-Kügelchen zu der biotinylierten RNA und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation.Wenn eine der Säulen nicht zu laufen begonnen hat, leicht mit einem behandschuhten Finger auf die Oberseite der Säule drücken. Sobald der Fluss beginnt, laufen die Säulen problemlos leer. Die RNA-Perlen-Gemische auf die Säulen auftragen. Falls die unmarkierte RNA analysiert werden soll, sammeln Sie den Durchlauf der unmarkierten RNA-Fraktion, waschen Sie anschließend dreimal mit 0,9 Millilitern Waschpuffer bei 65 Grad Celsius und danach dreimal mit 0,9 Millilitern Waschpuffer bei Raumtemperatur.Pipettieren Sie anschließend 700 Mikroliter Puffer RLT in neue 2-Milliliter-Röhrchen und stellen Sie diese unter die Säulen. Geben Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete 100 Millimolar DTT zu den Säulen hinzu, um die neu transkribierte RNA in den RLT-Puffer eluieren zu lassen. Nach drei Minuten geben Sie weitere 100 Mikroliter 100 Millimolar DTT zur Säule hinzu und sammeln das EENT im selben Röhrchen auf.Fahren Sie mit dem RN easy mini loot Reinigungsprotokoll wie in der Herstelleranleitung beschrieben fort, geben Sie 25 Mikroliter nukleasefreies Wasser auf die Säule und stellen Sie die Säulen in die Röhrchen, die in eine Zentrifuge gegeben werden. Nach einer Minute Zentrifugation werden die Säulen aus den Röhrchen entnommen und die RNA-Konzentrationen mithilfe eines Nano-Drop-Spektrophotometers bestimmt. Beachten Sie, dass spektrophotometrische Messungen von neu transkribierter RNA nicht sehr zuverlässig sind und dazu neigen, den tatsächlichen RNA-Gehalt zu überschätzen.Um das wiederholte Einfrieren und Auftauen von RNA vor der Einreichung für einen Hochdurchsatz-Assay zu vermeiden, empfehlen wir, die cDNA unmittelbar nach der Reinigung der neu transkribierten RNA herzustellen. Verwenden Sie 2,5 µL der neu transkribierten RNA-Vorlage in einer 20-µL-cDNA-Synthesereaktion gemäß den Herstelleranweisungen. Verdünnen Sie die cDNA-Proben im Verhältnis 1:10 und analysieren Sie 5 µL der cDNA-Verdünnung mittels qRT-PCR.Lagern Sie die CD-NA-Proben bei minus 80 Grad Celsius, um die minimale vier-SU-Konzentration zu bestimmen, die für eine effiziente Gewinnung neu transkribierter RNA erforderlich ist. Reinigen Sie die neu transkribierte RNA nach der Markierung mit vier SU in steigenden Konzentrationen von vier SU und analysieren Sie sie mittels Elektrophorese. Hier zeigte sich, dass die Gewinnung von neu transkribierter RNA, die eine Stunde lang in primären humanen Fibroblasten markiert wurde, zwischen 50 und 200 Mikromolar vier SU deutlich anstieg, danach jedoch zu einem Plateau überging. Alternativ kann die Einbindung von vier SU durch eine Dot-Blot-Analyse an biotinylierter RNA mit einem Streptavidin-Horseradish-Peroxidase-Konjugat gemessen werden.Die Biotinylierungseffizienz von Biotin-HPDP ist ungefähr dreimal geringer als die von Otto-Acetyl-Biotin. Daher wird jedes dritte bis vierte Su-Rest in neu transkribierten.RNA wird tatsächlich durch Biotin HPDP biotinyliert. Die Signalintensitäten können ebenfalls durch Vergleich mit der biotinylierten Kontrolle quantifiziert werden. Die Rückgewinnung neu transkribierter RNA mittels DNA-Oligos ist hochgradig quantitativ.Diese aus Daten des Agilent Bioanalyzer abgeleiteten Ergebnisse zeigen, dass die neu transkribierte RNA signifikant höhere Mengen an großen, ungefalteten Transkripten enthält. Schließlich können die Inkorporationsraten von vier su in neu transkribierter RNA sogar direkt durch spektralphotometrische Analyse quantifiziert werden. Dazu ist eine Präzipitation der neu transkribierten RNA mit Glykogen sowie Isopropanol und Ethanol erforderlich.Der zusätzliche Peak bei 330 Nanometern spiegelt die Inkorporationsrate von vier SU in neu transkribierte RNA wider. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tril äußerst gefährlich sein kann. Daher sollte ein Gegenmittel für Phenol-Belastungen, bestehend aus Polyethylenglykol 300, gemischt mit technischem, denaturiertem Alkohol im Verhältnis 70 zu 30, leicht verfügbar sein.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neu transkribierte RNA metabolisch markiert und aufreinigt, was insgesamt etwa acht Stunden für sechs bis zwölf Proben in Anspruch nimmt.

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Research

Forschung

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Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur (Video) | JoVE Journal

Metabolische Markierung der neu transkribierten RNA für High Resolution Gene Expression Profiling von RNA Synthese, Verarbeitung und Decay in Zellkultur

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