Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133 + Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, von Patienten stammende Zellkulturen aus malignen Melanomen zu etablieren und putative CD 1 33-positive Krebsstammzellen zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst primäre Melanom-Einzelzellen aus einem Tumorgewebe präpariert werden, nachdem Erythrozyten aus dem Zellpellet depletiert wurden. Falls erforderlich, charakterisieren Sie die primäre Zellkultur und depletieren Sie die Fibroblasten.

Der letzte Schritt besteht darin, eine magnetische Zellsortierung der CD 1 33 positiven und CD 1 33 negativen Melanomzellen durchzuführen. Letztendlich ist dieses optimierte Max-Verfahren eine hervorragende Methode, um hochangereicherte und lebensfähige Populationen von CD 1 33-positiven und CD 1 33-negativen Zellen zu erhalten. Wir haben die Technik zuerst verwendet, um Insko-Daten in der personalisierten Medizin zu validieren, wo wir versuchen, das Ansprechen von Krebspatienten auf Medikamente vorherzusagen, und dafür kann keine kommerziell verfügbare Zelllinie verwendet werden.

Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass wir einen schnellen Zugang zu CD 1 33-positiven Zellen haben, bei denen es sich um mutmaßliche Krebsstammzellen beim malignen Melanom handelt. Die Technik wird von Catherine Davis, einer Labortechnikerin aus meinem Labor, vorgestellt. Übertragen Sie das frisch isolierte Tumorgewebe aus der Operation in steriles PBS, das 1%Penicillin-Streptomycin enthält, in das Gewebekulturlabor.

Übertragen Sie das Tumorgewebe in eine sterile Petrischale, saugen Sie die überschüssige Lösung ab. Geben Sie dann 500 Mikroliter Dissoziationsmischung hinzu und zerkleinern Sie den Tumor mit frischen sterilen Skalpellen in kleine Stücke von zwei bis vier Millimetern. Übertragen Sie nun zwei bis vier Gramm zerkleinertes Tumorgewebe in ein sanftes Max-C-Röhrchen mit fünf Millilitern Dissoziationsmischung.

Spülen Sie die Petrischale mit einer zusätzlichen Dissoziationsmischung von 4,5 Millilitern aus und geben Sie die restlichen Gewebefragmente in das sanfte Max C-Rohr. Schließen Sie den Schlauch, befestigen Sie ihn kopfüber an der Hülse der Dissoziation und führen Sie das Programm H Tumor Null Eins aus. Inkubieren Sie die Probe anschließend 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Rotation bei höchster Laufgeschwindigkeit.

Befestigen Sie nun den Schlauch kopfüber an der Hülse der Dissoziation und führen Sie das Programm H Tumor Null zwei aus. Dann inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius unter kontinuierlicher Rotation bei 12 U/min. Führen Sie als Nächstes das sanfte Max-Programm H Tumor Null Drei aus.

Resuspendieren Sie die Probe und geben Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Rühren Sie die Zellsuspension bei Bedarf mit einer sterilen Filterspitze auf, bis die vollständige Suspension durchläuft. Spülen Sie das Zellsieb mit fünf Millilitern Quantum 2, 6, 3 Medium, pelletieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300 G und entsorgen Sie den Überstand.

Wenn der Zellgaumen aufgrund einer hohen Anzahl von Tices und Lügen gelesen erscheint, roter Blutkörperchen, wie im Begleittextprotokoll beschrieben. Drehen Sie die Tumorzellen in Quanten 2, 6, 3 erneut und säen Sie routinemäßig eine Kultur aus, um Zellen zu passieren, wenn sie eine Konfluenz von 80 % erreichen. Analysieren Sie die primäre Zellkultur phänotypisch mit einem Mikroskop.

Ernten Sie dann eine kleine Menge der primären Zellkultur für die RNA-Extraktion nach der CD-NA-Synthese und führen Sie R-T-P-C-R mit Primern für neoplastische Melanom-, Stammzell- und Stromazell-Markergene durch. Die wichtigsten Gene, die analysiert werden müssen, sind der Fibroblastenmarker CD 90, der Melanom- und Melanozytenmarker, der Krebsstammzellmarker CD 1 33, der Marker für reife dendritische Zellen, CD 83, und ein Housekeeping-Gen wie HPRT oder GAAP dh. Wenn die kombinierte mikroskopische und R-T-P-C-R-Analyse eine hohe Faserblastenkontamination der primären Melanomkultur ergab, fahren Sie mit der Depletion der Fibroblasten mit den Anti-Fibroblasten, Mikrokügelchen und LD-Säulen fort.

Waschen Sie 80%ige Konfluenzzellen mit vorgewärmtem PBS, fügen Sie die entsprechende Menge Accutane hinzu und inkubieren Sie, bis sich die Zellen von der Kulturoberfläche lösen. Ernten Sie die Zellen in Quantum 2 6 3 Medium und geben Sie sie in ein 50 Milliliter Röhrchen. Zählen Sie die Zellen auf und zentrifugieren Sie die erforderliche Anzahl von Zellen fünf Minuten lang bei 300 G und vier bis acht Grad Celsius.

Überstand vollständig absaugen und wiederbeleben. Suspendieren Sie bis zu eins mal 10 bis zur Achtel der Zellen in maximal 350 Mikrolitern Puffer, fügen Sie 100 Mikroliter FCR-Blockierungsreagenz und 50 Mikroliter CD 1 33 hinzu. Ein Biotin.

Gut mischen und 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit maximal 10 Millilitern Puffer und zentrifugieren Sie sie anschließend fünf Minuten lang bei 300 g und vier bis acht Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand nach einer zweiten Wäsche vollständig an.

Resuspendieren Sie das Zellpellet in maximal 400 Mikrolitern Puffer. 100 Mikroliter Anti-Biotin-Mikrokügelchen zugeben und gut mischen, 15 Minuten bei vier bis acht Grad Celsius inkubieren. Um den max-Separator für die magnetische Trennung vorzubereiten, befestigen Sie den quadro max an den max-separator-Multis-Ständer.

Setzen Sie die benötigte Anzahl an LS-Säulen mit den Säulenflügeln nach vorne in das Magnetfeld des quadro max ein. Setzen Sie in jede LS-Säule einen Vorabscheidefilter und ein entsprechendes Sammelrohr ein. Spülen Sie den Filter und die Säule unter jeder Säule mit maximal drei Millilitern Puffer und entsorgen Sie den Durchfluss.

Nachdem Sie die Zellen wie zuvor beschrieben in maximalem Puffer gewaschen haben, resuspendieren Sie die Zellen in maximal 500 Mikrolitern Puffer und tragen Sie die Zellsuspension auf ihre vorbereitete LS-Säule auf. Dreimal waschen mit maximal drei Millilitern Puffer pro Spalte. Sammeln Sie den Gesamtzufluss der unmarkierten negativen Zellfraktion von cd 1 33

Entsorgen Sie anschließend den Vorabscheidefilter. Nehmen Sie die Säule aus dem Abscheider und stellen Sie sie auf ein geeignetes Auffangröhrchen. Tragen Sie maximal fünf Milliliter Puffer auf.

Spülen Sie die markierten CD 1 33 positiven Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken, um die Reinheit der negativen Fraktion zu erhöhen. Die Zellsuspension wird auf eine neue äquilibrierte LS-Säule aufgetragen und die negative Fraktion CD 1 33 aus dem Abwasser aufgefangen. Diese resezierten Lymphknotenmetastasen wurden von einem Melanompatienten im Spätstadium gewonnen.

Nach mechanischer und enzymatischer Dissoziation des Gewebes enthielt das Pellet der filtrierten Zellen eine hohe Kontamination mit Erythrozyten. Anschließend führte die Erschöpfung der roten Blutkörperchen zu einem Zellpellet von hellbrauner Farbe. Diese Zellen wurden hier in Quantenmedium 2 6 3 kultiviert, einem R-T-P-C-R aus Melanozyten und Melanom, Fibroblasten, dendritischen und Stammzellmarkern.

Gene wird verwendet, um zu überprüfen, ob die Zellen aus dem Tumor und nicht aus dem umgebenden Stroma stammen. Adulte Melanozyten dienten als normale Kontrollzellen für die Träne und die embryonale Karzinomzelllinie N-C-C-I-T als Positivkontrolle für den Stammzellmarker CD 1 33. Diese Daten zeigen, dass einige Primärzellen tatsächlich positiv auf Tränen reagieren und daher melanozytären Ursprungs sind.

Die Kultur ist auch negativ für CD 83, den Marker für reife dendritische Zellen. Interessanterweise exprimiert diese Melanomzelllinie CD 1 33, ein Gen, das für die asymmetrische Zellteilung entscheidend ist und ein bekannter Marker für Krebsstammzellen ist. Hier ist eine Hellfeldaufnahme einer primären Zellkultur zu sehen, die nach der Behandlung der Fibroblastendepletion stark mit Fibroblasten kontaminiert ist, die Kulturen repräsentieren primäre Melanomzellen.

Die primären Melanomzellen wurden in CD 1 33 positive und CD 1 33 negative Zellen sortiert. Diese Daten aus Immunfluoreszenz-, Färbe- und Western-Blot-Analysen deuten auf eine hohe Sortiereffizienz und Reinheit hin. Der Ansatz hat große Auswirkungen auf die personalisierte Medizin, da wir jetzt von Patienten stammende Gewebe und Zellen verwenden können, um das Ansprechen jedes Patienten individuell besser vorherzusagen.

Diese Methode wird uns helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie zum Beispiel: Woher stammt der Tumor? Wie können Patienten behandelt werden? Und es wird dazu beitragen, systembiologische Ansätze durch die Validierung ihrer Experimente besser neu zu definieren.