Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Chromosomen für die GB-Bandenfärbung und molekulare zytogenetische Untersuchungen zu gewinnen und vorzubereiten. Zunächst werden die Zellen in die logarithmische Wachstumsphase kultiviert. Anschließend werden die Chromosomen mit Smid, einem Hypotonikum und einem Fixans mittels Zelllyse isoliert.

Geben Sie die Zellsuspension auf Objektträger. Färben Sie einen Objektträger. Als Kontrolle der chromosomalen Präparation führen Sie die GB-Bandenfärbung oder molekularbiologische Verfahren an den verbleibenden Objektträgern durch.

Als letzten Schritt bei der GB-Bandenanalyse werden die Chromosomen mittels Lichtmikroskopie und Karyotypisierung analysiert. Letztendlich stehen die Chromosomen und Kerne für die Karyotypisierung oder FISH (fluoreszenzbasierte in-situ-Hybridisierung) zur Verfügung. Die Idee, diese Methode zu veröffentlichen, entstand zunächst aufgrund der hohen Nachfrage anderer Forscher, die Unterstützung bei der Detektion von Chromosomeninstabilität in verschiedenen Zelltypen unterschiedlicher Organismen sowie für anschließende molekulare zytogenetische Untersuchungen suchten.

Diese Technik ist entscheidend für die Diagnose und letztlich auch die Prognose zahlreicher angeborener genetischer Erkrankungen, einschließlich Krebs, da sie die Visualisierung von Chromosomenumordnungen ermöglicht, die diagnostisch aussagekräftig sind. Für diese Erkrankungen kann diese Methode Aufschluss über die in verschiedenen Arten menschlicher Zellen vorkommenden Chromosomenumordnungen geben. Außerdem lässt sie sich auf Zellen anderer Organismen wie Resus-Macaques, Ratten und Mäuse in Kultur anwenden.

2 Millionen adhärente Zellen bis zu 80 % Konfluenz bringen und 10 Mikroliter einer 10 Mikrogramm pro Milliliter enthaltenden Lösung pro Milliliter Zellen hinzufügen. Die Zellen 45 Minuten lang bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator inkubieren.

Verwenden Sie dann eine sterile Pipette, um das Medium aus der Kultur in ein 15-Milliliter-Kegelrohr zu überführen und heben Sie es für später auf. Zum Waschen der Zellen geben Sie zwei Milliliter HBSS in den Kolben, schwenken diesen und entfernen anschließend den Puffer. Fügen Sie danach ein Milliliter Trypsin hinzu, wobei sichergestellt werden muss, dass die gesamte Oberfläche des Kolbens bedeckt ist. Sobald sich der Großteil der Zellen gelöst hat, pipettieren Sie das Medium aus dem Kegelrohr zurück auf die Zellen.

Geben Sie 10 Milliliter der Zellsuspension in 15-Milliliter-Kegelröhrchen ab. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 200 G. Entfernen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter 75 Millimolar Kaliumchlorid, das nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. Zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 200 G. Entfernen Sie bei 25 Grad Celsius alles bis auf 0,5 Milliliter des Überstands und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig.

Geben Sie fünf Milliliter frisches Fixansatzmittel für Zellen hinzu. Anschließend geben Sie weitere fünf Milliliter des Fixansatzmittels hinzu und wirbeln und zentrifugieren Sie bei 200 ×g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie jedes Zellpellet in fünf Milliliter Fixansatzmittel.

Lagern Sie die Zellen bis zu einem Jahr bei vier Grad. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang mit 200 G. Bei 25 Grad Celsius.

Entfernen Sie das Überstand bis nur noch 0,3 bis 0,5 Milliliter verbleiben, nachdem das Pellet vorsichtig resuspendiert wurde. Geben Sie mithilfe einer Pipette drei Tropfen der Zellsuspension aus einem Abstand von etwa fünf Zentimetern auf einen um etwa 45 Grad geneigten Objektträger und lassen Sie die Suspension über den Objektträger laufen.

Fügen Sie einen großen Tropfen frische Kfz-Lärmlösung, Fixierungsmittel, zum Objektträger hinzu. Streichen Sie die Unterseite des Objektträgers auf ein Papiertuch ab und lassen Sie den Objektträger anschließend vollständig trocknen. Bereiten Sie eine frische Gim-Stabilisierungslösung vor.

Legen Sie die Objektträger auf einen Färberhalter. Bedecken Sie den gesamten Objektträger mit der Gim-erhaltenden Lösung. Nach fünf Minuten spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser ab, lassen sie abtropfen und trocknen sie an der Luft.

Geben Sie vier Tropfen Permount auf den Objektträger und legen Sie ein Deckglas auf, wobei sichergestellt werden muss, dass sich keine Blasen unter dem Deckglas befinden. Entfernen Sie den überschüssigen Permount mit einem Papiertuch. Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10×- und 100×-Vergrößerung.

Wenn die Metaphasezellen reichlich vorhanden und gut ausgebreitet sind, können die restlichen Objektträger für andere experimentelle Verfahren verwendet werden. Geben Sie 50 Milliliter der Behandlungslösungen in vier Copeland-Gläser. Tauchen Sie danach jeden Objektträger fünf Sekunden lang in Glas Nummer eins ein.

Die Objektträger schnell im Gefäß Nummer zwei abspülen. Im Gefäß Nummer drei mindestens 30 Sekunden belassen. Im Gefäß Nummer vier abspülen und anschließend die Objektträger trocknen lassen.

Frische GIM-Konservierungslösung herstellen. Die Objektträger auf einen Färbergestell stellen. Die gesamte Objektträgerfläche fünf Minuten lang mit der GIM-Konservierungslösung bedecken.

Spülen Sie die Objektträger und destilliertes Wasser in der gleichen Reihenfolge, in der sie gefärbt wurden. Anschließend mindestens 10 Minuten trocknen lassen. Bringen Sie einen Deckglaser mit Perm Mount auf, wie zuvor gezeigt.

Danach die Zellen unter einem Lichtmikroskop für die verbleibenden Objektträger analysieren. Die Trypsin-Inkubationszeit anpassen, basierend auf den Ergebnissen des ersten Objektträgers.

Ein erfolgreicher Test liefert Chromosomen, die gut verteilt und von geeigneter Chromosomenmorphologie sind. GB-bandierte Chromosomen weisen die charakteristischen hellen und dunklen Bandenmuster auf. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Chromosomen für die GB-Bandung sowie weitere molekulare zytogenetische Untersuchungen zur Aufklärung von Chromosomeninstabilität gewinnt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann diese Erntemethode in etwa drei Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Für das GB-Banding-Verfahren ist es wichtig, die Trypsin-Inkubationszeit zunächst an einem Objektträger zu testen, bevor mit dem GB-Banding an den übrigen Objektträgern fortgefahren wird.