Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entnahme und Vorbereitung von Chromosomen für GB-Banding und molekularzytogenetische Tests. Kultivieren Sie zunächst die Zellen in die logarithmische Phase. Dann entnehmen Sie die Chromosomen mit Smid, einem hypotonen und einem Fixiermittel.

Lassen Sie die Zellsuspension in Objektträger fallen. Färben Sie eine Folie. Als Monitor der Chromosomenpräparation fahren Sie mit GB-Banding oder molekularen Techniken der verbleibenden Objektträger fort.

Als letzten Schritt beim GB-Banding analysieren Sie die Chromosomen durch Lichtmikroskopie und Karyotypisierung. Letztendlich werden die Chromosomen und Zellkerne für die Karyotypisierung oder Fischanalyse zur Verfügung stehen. Die Idee, diese Methode zu veröffentlichen, kam mir ursprünglich aufgrund der hohen Nachfrage anderer Forscher, die Unterstützung beim Nachweis von Chromosomeninstabilität in verschiedenen Zelltypen verschiedener Organismen und für anschließende molekularzytogenetische Tests anforderten.

Diese Technik ist für die Diagnose und letztendlich die Prognose vieler angeborener genetischer Störungen, einschließlich Krebs, unerlässlich, da sie die Visualisierung von Chromosomenumlagerungen ermöglicht, die diagnostisch sind. Bei diesen Erkrankungen kann diese Methode jedoch einen Einblick in die Chromosomenumlagerungen geben, die in verschiedenen Arten menschlicher Zellen vorkommen. Es kann auch auf Zellen anderer Organismen wie Resus, Maca, Ratten und Mäuse angewendet werden.

2 Millionen adhärente Zellen auf 80% Confluenz und fügen Sie 10 Mikroliter von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Col pro Milliliter Zellen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5%CO2-Inkubator für 45 Minuten.

Übertragen Sie dann das Medium mit einer sterilen Pipette aus der Kultur in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und bewahren Sie es für später auf. Um die Zellen zu waschen, geben Sie zwei Milliliter HBSS in den Kolben, schwenken Sie es und entfernen Sie den Puffer. Fügen Sie dann einen Milliliter Trypsin hinzu und stellen Sie sicher, dass es die gesamte Oberfläche des Kolbens bedeckt. Sobald sich der Großteil der Zellen abgelöst hat, pipettieren Sie das Medium im konischen Röhrchen zurück auf die Zellen.

Aliquotieren Sie 10 Milliliter der Zellsuspension in konische 15-Milliliter-Röhrchen. Bei 200 g 10 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie das Supernat.

Das Pellet wird erneut in 10 Milliliter 75 Millimolare Kaliumchlorid suspendiert, das nach einer 10-minütigen Inkubation von 37 Grad Celsius auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 g. Entfernen Sie bei 25 Grad Celsius alle bis auf 0,5 Milliliter des Überstands und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig.

Geben Sie fünf Milliliter frisches Fixiermittel für Autogeräusche in die Zellen. Fügen Sie dann fünf Milliliter hinzu, mehr von dem Fixiermittel und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 200 G. Reanimation, suspendieren Sie jedes Zellpellet in fünf Millilitern Fixiermittel.

Lagern Sie die Zellen bis zu einem Jahr bei vier Grad. Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 200 g. Bei 25 Grad Celsius.

Entfernen Sie das Suppenmittel, bis nach dem sanften Wiederbeleben des Pellets nur noch 0,3 bis 0,5 Milliliter übrig sind. Pipettieren Sie drei Tropfen der Zellsuspension aus einer Entfernung von etwa zwei Zoll auf einen Objektträger, der in einem Winkel von etwa 45 Grad geneigt ist. Und lassen Sie die Federung über den Schlitten rollen.

Fügen Sie einen großen Tropfen frisches Autogeräusch hinzu, das die Rutsche fixiert. Fahren Sie die Rückseite der Folie auf ein Papiertuch und setzen Sie die Folie dann zum vollständigen Trocknen hinaus. Bereiten Sie frische Gim-Sustaining-Lösung vor.

Legen Sie die Objektträger auf ein Färbegestell. Decken Sie den gesamten Objektträger mit der Gim-Sustaining-Lösung ab. Spülen Sie die Objektträger nach fünf Minuten mit destilliertem Wasser ab und lassen Sie sie an der Luft trocknen.

Geben Sie vier Tropfen Dauerwellenhalterung auf die Folie und platzieren Sie ein Deckglas, um sicherzustellen, dass sich keine Blasen unter dem Deckglas befinden. Entfernen Sie den Überschuss pro Halterung mit einem Papiertuch. Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop unter 10-facher und 100-facher Vergrößerung.

Wenn die Metaphasenzellen reichlich vorhanden und gut verteilt sind, können die verbleibenden Objektträger für andere experimentelle Verfahren verwendet werden. Geben Sie 50 Milliliter der Behandlungslösungen in vier Copeland-Gläser. Tauchen Sie jede Folie danach fünf Sekunden lang in das erste Glas ein.

Spülen Sie den Objektträger schnell in Dose Nummer zwei aus. Lassen Sie es mindestens 30 Sekunden lang im Glas Nummer drei. Spülen Sie es in Glas Nummer vier aus und lassen Sie die Objektträger trocknen.

Bereiten Sie frische GIM-Sustaining-Lösung vor. Legen Sie die Objektträger auf ein Färbegestell. Decken Sie den gesamten Objektträger fünf Minuten lang mit der Gim-Sustaining-Lösung ab.

Spülen Sie die Objektträger und das destillierte Wasser in der gleichen Reihenfolge ab, in der sie fleckig waren. Anschließend mindestens 10 Minuten trocknen lassen. Platzieren Sie ein Deckglas mit der Dauerwellenhalterung, wie zuvor gezeigt.

Analysieren Sie dann die Zellen unter einem Lichtmikroskop auf die restlichen Objektträger. Passen Sie die Inkubationszeit an. Basierend auf den Ergebnissen der ersten Folie.

Ein erfolgreicher Assay liefert Chromosomen, die gut verteilt sind und eine geeignete Chromosomenmorphologie aufweisen. Richtig. GB-gebänderte Chromosomen enthalten die charakteristischen hellen und dunklen Bandenmuster. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Chromosomen für das GB-Banding und weitere molekularzytogenetische Tests zur Aufklärung der Chromosomeninstabilität entnimmt.

Einmal gemeistert, kann diese Erntetechnik in etwa drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Für das GB-Bandingverfahren ist es wichtig, zunächst die Inkubationszeit tripsin auf einer Folie zu testen, bevor Sie mit dem GB-Band fortfahren. Der Rest der Folien.