Name: Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Lernen Sie die Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen für zytogenetische Analysen wie G-Banding und FISH. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Karyotypisierung und molekulare Untersuchungen.

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In dieser Handschrift beschriebenen Arbeiten wurden mit Mitteln des Patrick F. Taylor Stiftung ermöglicht.

1. Chromosom Ernten von adhärenten Zellen <ol><li> Standard-Protokoll <ol><li> Wachsen Zellen nach bestimmten Zellkulturbedingungen. Wenn die Zellen logarithmischen Phase (80% Konfluenz) erreicht, mit 10 ul / ml Colcemid zu der Zellkulturflasche. Ein Minimum von 2 x 10 6 Zellen empfohlen. </li><li> Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator für 45 min. Verwendung einer sterilen Pipette Medien von Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Beiseite stellen. </li><li> Behutsam die Zellen durch Zugabe von 2 ml HBSS-Puffer in den Kolben. Swirl Puffer und entfernen Sie dann mit einer Pipette. Entsorgen. </li><li> 1 ml Trypsin, um sicherzustellen, dass es die gesamte Oberfläche der Flasche bedeckt. Nur lassen die Zellen in Trypsin für ca. 2 min. Nachdem die Mehrheit der Zellen freistehend, pipettieren, die Medien in der konischen Rohr wieder auf den Zellen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in 10 ml-Aliquots in 15 ml konische Röhrchen.Zentrifuge bei 200 × g für 10 min. Überstand entfernen und das Pellet. </li><li> 10 ml 0,075 M KCl, die auf 37 ° C zu der verbleibende Pellet im konischen Rohr vorgewärmt wurde. Wirbelrohr bei mittlerer Geschwindigkeit zu KCl und Zellen mischen. </li><li> Zellen bei 37 ° C für 10 min. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 25 ° C. Überstand entfernen (bis etwa 0,5 ml Überreste) und Pellet erneut. </li><li> Zu den Zellen unter Vortexen: 5 ml frischem Carnoy-Fixativ (Eisessig 3:1-Verhältnis von Methanol) Vorsichtig. Daraufhin 5 ml mehr ohne Fixiermittel Vortexen für insgesamt 10 ml. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen. 5 ml der Fixierlösung in jedes Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen. 5 ml der Fixierlösung in jedes Röhrchen. Die Zellen können nun in 4 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom harvesting Lymphoblastoidzelllinien <ol><li> Wachsen Zellen nach bestimmten Zellkulturbedingungen. (Verwenden Sie geeignete Kanne für die Menge an Zellen in Kultur). Wenn die Zellen logarithmischen Phase (etwa 2 Tage nach Zellen aufgeteilt sind) erreicht, mit 10 ul / ml Colcemid zu der Zellkulturflasche. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom Ernte aus Vollblut Phytohämagglutinin (PHA), ein Lektin aus der roten Bohne abgeleitet ist, ist ein leistungsfähiges Mitogen für humane T-Zellen 16. 72 Stunden nach der Zugabe von PHA in die Kultur, etwa 45% der Zellen in der S-Phase. Dies stellt den Peak mitotische Aktivität und der optimale Punkt, an dem für Chromosomenstudien ernten. Andere Mitogene, wie Pokeweed (1-10 ug / ml) kann, wenn B-Zellen analysiert 17,18 verwendet werden. <ol><li> Sammeln Sie mindestens 1 ml Vollblut in einem grünen Top Natrium-Heparin-Röhrchen. Verwenden Sie innerhalb von 3 Tagen nach der Sammlung. Shop Blut bei RT until bereit. </li><li> Aliquots von 0,25 ml Vollblut in 10 ml vollständigem RPMI-Medium, das L-Glutamin (20% fötales Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Fungizon und 1% PHA). Bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom Ernte aus dem Knochenmark Zytogenetische Analyse auf das Knochenmark ist hilfreich bei vielen malignen hämatologischen Erkrankungen, wie die Beobachtung eines chromosomal abnormen Klon kann diagnostisch für eine bestimmte Art der Leukämie. Chromosomenstudien werden auch verwendet, um den Krankheitsverlauf wie der Beginn der Blastenkrise und Ansprechen auf die Therapie zu beurteilen. Da Knochenmarkzellen werden aktiv teil ist keine Mitogenstimulation notwendig 9,19. Bei akuten Leukämien 24 und 48 h Kulturen werden ebenfalls eingerichtet. <ol><li> Sammeln Sie mindestens 1 ml Knochenmark in einem grünen Top Natrium-Heparin-Röhrchen. Aliquots von 0,25 ml Knochenmark in 10 ml vollständigem RPMI-Medium, das L-Glutamin (20% fötales Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Fungizon). Bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Slide Vorbereitung und Solid-Färbung Eine schnelle Auswertung von einem Vertreter Folie wird Informationen über die Qualität der Ernte, bevor wieder weitere Verfahren wie die G-Bänderung, FISH, CGH, SKY oder bereitzustellen. Manche Labors lieber festen Fleck die Zellen für die schnelle Ernte und Chromosom Beurteilung. Alternativ kann ein Phasenkontrastmikroskop für diese Analyse verwendet werden. Objektträger werden am besten vorbereitet, wenn die Luftfeuchtigkeit etwa 50% und die Temperatur der Umgebungs (20-25 ° C). <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 200 × g für 5 min bei 25 ° C. Entfernen Sie den Überstand bis nur 0,3-0,5 ml verbleibt. </li><li> Nach vorsichtigem Resuspendieren des Pellets, Pipette drei Tropfen der Zellsuspension aus einer Entfernung von etwa 2 auf eine Folie, die in einem Winkel von etwa 45 ° geneigt und ermöglichen der Suspensionum über die Rutsche rollen. In einem großen Tropfen Frisch Carnoy-Fixativ auf der Folie. </li><li> Trocknen Sie die Rückseite der Folie auf ein Papiertuch und dann sitzen die Folie zum Trocknen für mindestens 10 min. Der Schlitten sollte vollständig trocken sein. </li><li> Bereiten Sie frischen Giemsa-Färbelösung (3:1-Verhältnis von Gurr Buffer und Giemsa-Färbung). Legen Sie die Folien auf eine Färbung Rack. Decken Sie die gesamte Folie in der Giemsa-Lösung. Lassen Sie die Folien in der Farblösung für 5 min zu bleiben. Spülen Sie mit destilliertem Wasser gleitet, abtropfen und an der Luft trocknen. </li><li> 4 Tropfen Permount und ein Deckglas auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter dem Deckglas. Das überschüssige Permount kann mit einem Papiertuch entfernt werden. </li><li> Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung. Wenn die Metaphase Zellen reichlich und gut verteilt sind, können die restlichen Folien für andere experimentelle Verfahren verwendet werden. </li></ol> 3. G-Banding Mit Trypsin und Giemsa (GTG) &lt;p&gt; Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das euchromatic Histone in DNA-Bereichen mit höheren Transkriptionsaktivität resultierende denaturiert. Nach Giemsa-Färbung, werden diese Regionen als Streifen treten. Hoch verdichtete Chromatin mit wenig oder ohne Transkriptionsaktivität (Heterochromatin) einen großen Teil seiner Histone vom Trypsin geschützt haben und daher dunkel färben folgenden Giemsa. Es ist wichtig, zunächst G-Band eine Folie, um die Bedingungen zu überwachen und einstellen Trypsin Timing bei Bedarf für die folgenden Folien. <ol><li> Fügen Sie die folgenden Lösungen bis 4 Coplin Gläser. Glas # 1 = 30 ml 1X HBSS und 4 ml 10x Trypsin (0,5%) Jar # 2 = 50 ml 1x HBSS Glas # 3 = 45 ml 1X HBSS und 5 ml fötales Rinderserum Jar # 4 = 50 ml 1x HBSS </li><li> Tauchen Sie jede Folie im Glas Nr. 1 für 5 Sekunden, schnelle Spülung in Jar # 2, lassen jede Folie im Glas Nr. 3 für mindestens 30 sec, schnelles Spülen im Glas Nr. 4 dann lassen Folien zu trocknen. </li><li> Bereiten fresh Giemsa-Lösung (3:1-Verhältnis von Gurr Buffer und Giemsa-Färbung). Legen Sie die Folien auf eine Färbung Rack. Decken Sie die gesamte Folie in der Giemsa-Lösung. Lassen Sie die Folien in der Farblösung für 5 min zu bleiben. </li><li> Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser in der gleichen Reihenfolge, dass sie gefärbt wurden. Die Objektträger für 10 min trocknen. Der Schlitten sollte vollständig trocken sein. </li><li> 4 Tropfen Permount und ein Deckglas auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter dem Deckglas. Das überschüssige Permount kann mit einem Papiertuch entfernt werden. </li><li> Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung. Einstellen Trypsin Zeitpunkt der Rest der Schlitten auf der Basis der Ergebnisse der ersten Folie. </li></ol>

<ol><li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+screening+for+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li>
<li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussbuam%2C+R+%22Genetics+in+Medicine%3A+7th+Edition%22">Genetics in Medicine: 7th Edition</a>. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).</li>
<li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Obstet.+Gynecol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li>
<li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions%5BTitle%5D)+AND+%22Ginecol.+Pol%22%5BJournal%5D)">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li>
<li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stillbirth+classification%E2%80%94Developing+an+international+consensus+for+research%3A+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li>
<li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+congenital+heart+defects%3A+Current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li>
<li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Syndrome%3A+Trisomy+21.%5BTitle%5D)+AND+%22PubMed+Health%22%5BJournal%5D)">Down Syndrome: Trisomy 21.</a> PubMed Health. , (2010).</li>
<li>Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li>
<li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li>
<li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li>
<li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li>
<li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev.+Rep%22%5BJournal%5D)">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li>
<li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li>
<li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+cytogenetics%3A+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li>
<li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarch%2C+MJ+%22The+Association+of+Genetic+Technologists+Cytogenetics+Laboratory+Manual.+San+Francisco%3A+3rd+edition%22">The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition</a>. , ACT. Houston, TX. (1997).</li>
<li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22In+Clinical+Laboratory+Medicine%2C+2nd+edition%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).</li>
<li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7R%CE%B1+deficiency+in+p53%28null%29+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Different%22%5BJournal%5D)">IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li>
<li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--%3Eqter+due+to+paternal+Y%3B+16+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Dysmorphol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li>
<li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li>
<li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+conventional+cytogenetics+%28G-banding%29%2C+comparative+genomic+hybridization+%28CGH%29+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+%28i-FISH%29+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li>
</ol>

Wir haben die vorliegenden Verfahren für Chromosom Isolierung aus Zellen von verschiedenen Organismen, einschließlich von verschiedenen humanen Zelltypen zu erhalten, Rhesus-Makaken, Ratten und Mäuse verwendet 11,20-22. Das Standardprotokoll vorgesehen ist, aber bestimmte Schlüsselschritte und Variablen benötigen, um für diese verschiedenen Arten von Zellen eingestellt werden. Mehrere spezifische Schritte in dem sowohl die chromosomale Herstellung und G-banding, um die bestmögliche Qualität der Ergebnisse sic...

Chromosomenanalyse ist eine herkömmliche Technik genutzt, um den Chromosom Instabilität und Umlagerungen, die zu genetischen Störungen und Bösartigkeit 1,2,8,9 diagnostizieren. Darüber hinaus kann eine höhere Auflösung für die Diagnose und Erforschung von Krebs-und Verfassungs erworbene genetische Anomalien mit der Kombination der klassischen zytogenetischen Verfahren und molekulare zytogenetischen Methoden wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH) erreicht werden und spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15. In jüngerer Zeit haben diese Techniken für die Beurteilung von Chromosom Instabilität mit Stammzellen assoziiert genutzt. Karyotypischen Anomalien wie Aneuploidie von Langzeit kultivierten embryonalen Stammzellen (ES) und adulten Stammzellen aus verschiedenen Organismen wurden von mehreren Laboratorien gemeldet. Neuere Erkenntnisse unterstützt, dass einige Zelllinien sind von Natur aus eher auf Chromosom instabiNG unabhängig von den Kulturbedingungen. Aus diesem Grund wird bei der Festlegung und / oder Aufrechterhaltung von Mensch, Maus oder Rhesus Stammzelllinien, die Chromosomenanalyse wird als Teil der Qualitätskontrolle empfohlen. Viele Berichte beschreiben die zunehmendes Interesse an der Verwendung von Routine-und molekularen Zytogenetik, um die chromosomale Stabilität von Stammzellen und malignen Zellen oder verschiedenen Organismen in der Kultur 10-13 überwachen. Diese Protokolle werden zunehmend von nicht-genetischen Labors für die schnelle Chromosomen Bewertung ihrer kultivierten Zellen 13 verwendet. Wir stellen unsere grundlegende Verfahren zur Herstellung von Chromosom verschiedenen Zelltypen, die sowohl für klinische und Forschungszwecke und Zellen von verschiedenen Organismen stammen angewendet werden können.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Puffer</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsin EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Puffer Tabletten "GURR"</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Caledon Laborchemikalien</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>Tel.: 11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

chromosomenpräparation aus kultivierten zellen

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosom (zytogenetische Analyse) wird weithin für den Nachweis von Chromosomen-Instabilität verwendet. Wenn durch G-Banding und molekularen Techniken wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), gefolgt, hat dieser Test die leistungsfähige Möglichkeit, einzelne Zellen zu Aberrationen, die Gewinne oder Verluste von Abschnitten des Genoms und Umlagerungen, die ein oder mehrere Chromosomen betreffen analysieren. Bei Menschen, in etwa 1 pro 160 Lebendgeburten 1,2, 60-80% aller Fehlgeburten treten Chromosomenanomalien 3,4, 10% der Totgeburten 2,5, 13% der Personen mit angeborenen Herzfehlern 6, 3-6% der Unfruchtbarkeit Fällen 2 und bei vielen Patienten mit Entwicklungsverzögerung und der Geburtsdefekte 7. Zytogenetische Analyse der Bösartigkeit wird routinemäßig von Forschern und Klinikern verwendet, wie Beobachtungen von klonalen Chromosomenanomalien haben gezeigt, dass sowohl diagnostische als auch prognostische Bedeutung haben 8,9.60; Chromosomentrennung ist von unschätzbarem Wert für die Gentherapie und Stammzellforschung von Organismen einschließlich nicht-menschlichen Primaten und Nagetiere 10-13. Chromosomen von Zellen von lebenden Geweben, einschließlich Blut-Lymphozyten, Haut-Fibroblasten, Amniozyten, Plazenta, Knochenmark und Tumorproben isoliert werden. Chromosomen werden in der Metaphase-Stadiums der Zellteilung analysiert, wenn sie am meisten verdichtet werden und damit deutlich sichtbar. Der erste Schritt des Chromosoms Isolationstechnik beinhaltet die Unterbrechung der Spindelfasern durch Inkubation mit Colcemid, um die Zellen ausgehend von der nachfolgenden Stufe Anaphase verhindern. Anschließend werden die Zellen mit einer hypotonischen Lösung behandelt und in ihrem gequollenen Zustand mit Carnoy-Fixiermittel erhalten. Die Zellen werden dann auf Objektträger fallengelassen, und können dann für eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden. G-Banding beinhaltet Trypsin-Behandlung gefolgt von einer Färbung mit Giemsa zu charakteristischen hellen und dunklen Streifen zu schaffen. Das gleiche procedure Chromosomen isolieren können zur Herstellung von Zellen für die Verfahren, wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), und die spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15 verwendet werden.

Hochwertige Metaphasespreitungen sind für die Chromosomenanalyse. Ein erfolgreicher Test ergibt Chromosomen, die gut verteilt sind und von geeigneten Chromosomenmorphologie. Richtig G-gebänderten Chromosomen enthalten den charakteristischen hellen und dunklen Bandenmuster. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Abbildung 1. Eine erfolgreic...

Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Chromosomen für die GB-Bandenfärbung und molekulare zytogenetische Untersuchungen zu gewinnen und vorzubereiten. Zunächst werden die Zellen in die logarithmische Wachstumsphase kultiviert. Anschließend werden die Chromosomen mit Smid, einem Hypotonikum und einem Fixans mittels Zelllyse isoliert.Geben Sie die Zellsuspension auf Objektträger. Färben Sie einen Objektträger. Als Kontrolle der chromosomalen Präparation führen Sie die GB-Bandenfärbung oder molekularbiologische Verfahren an den verbleibenden Objektträgern durch.Als letzten Schritt bei der GB-Bandenanalyse werden die Chromosomen mittels Lichtmikroskopie und Karyotypisierung analysiert. Letztendlich stehen die Chromosomen und Kerne für die Karyotypisierung oder FISH (fluoreszenzbasierte in-situ-Hybridisierung) zur Verfügung. Die Idee, diese Methode zu veröffentlichen, entstand zunächst aufgrund der hohen Nachfrage anderer Forscher, die Unterstützung bei der Detektion von Chromosomeninstabilität in verschiedenen Zelltypen unterschiedlicher Organismen sowie für anschließende molekulare zytogenetische Untersuchungen suchten.Diese Technik ist entscheidend für die Diagnose

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Karyotypisierung ist eine einfache und nützliche Technik allgemein zum Nachweis genetischer Veränderungen verwendet. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll für das Chromosom verteilt Vorbereitung von menschlichen embryonalen Stammzellen für die Überwachung der chromosomalen Status dieser Zellen in Kultur gehalten.

Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Ein quantitatives Verfahren zur Analyse von Chromosomenreplikation Timing beschrieben. Das Verfahren nutzt BrdU Inkorporation in Kombination mit...

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

DNA-Reparaturwege sind wichtig für die Erhaltung der genomischen Integrität und Mutation verhindert und Krebs. Das Ziel des Protokolls ist es, genomische Instabilität durch direkte Beobachtung von Chromosomenaberrationen in Metaphase-Spreads Quantifizierung von Maus-B-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) für Telomer-DNA-Wiederholungen.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Die molekularen Mechanismen der Dekondensation von hochverdichtetem mitotischem Chromatin sind unklar. Wir präsentieren einen zellfreien Assay, der auf mitotischen Chromatinclustern basiert, die aus HeLa-Zellen und Xenopus laevis-Eiextrakt isoliert wurden und den Dekondensationsprozess in vitro originalgetreu rekonstituieren.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

Es wird ein Protokoll für die Vorbereitung hochwertiger mitotischer pflanzlicher Chromosomenausbreitungen durch eine schnelle Air-Dry-Dropping-Methode beschrieben, die für den FISH-Nachweis von Einzel- und High-Copy-DNA-Sonden geeignet ist.

Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Quantifizierung und Charakterisierung von Chromosomenaberrationen in vitro in RAW264.7 Makrophagen der Maus nach der Behandlung mit der Umgebungsluft Feinstaub.

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Dies ist eine Methode, um neuartige DNA-Interaktion Proteine an zielgruppenspezifischen Loci, unter Berufung auf Sequenz-spezifische Erfassung von querverbunden Chromatin für nachfolgende Proteomic Analysen zu identifizieren. Keine Vorkenntnisse über potenzielle Bindeproteine noch Zelle Änderungen sind erforderlich. Ursprünglich entwickelt für die Hefe, wurde die Technologie jetzt für Säugerzellen angepasst.

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

Die Kombination von DNA-Halo-Präparationen mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ermöglicht eine hochauflösende Analyse genomischer Interaktionen mit dem Nukleoskelett. Das angehängte Genom führt zu hybridisierten Fluoreszenzsignalen, die sich in den verbleibenden extrahierten Kernen befinden, während sich das nicht angehängte Genom im Halo der DNA befindet, der die verbleibenden Kerne umgibt.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf DNA-Halo-Präparaten zur Aufdeckung ganzer Chromosomen, Telomere und Genorte

Hi-C 3.0 ist ein verbessertes Hi-C-Protokoll, das Formaldehyd- und Disuccinimidylglutarat-Vernetzer mit einem Cocktail aus DpnII- und DdeI-Restriktionsenzymen kombiniert, um das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung der Chromatin-Interaktionsdetektion zu erhöhen.

Erfassung der Chromosomenkonformation über Längenskalen hinweg

Dieses Protokoll beschreibt die Capture Hi-C-Methode, die verwendet wird, um die 3D-Organisation von megabasierten Zielgenomregionen mit hoher Auflösung zu charakterisieren, einschließlich der Grenzen topologisch assoziierender Domänen (TADs) und langreichweitiger Chromatininteraktionen zwischen regulatorischen und anderen DNA-Sequenzelementen.

Entschlüsselung der hochauflösenden 3D-Chromatinorganisation über Capture Hi-C

Lernen Sie die Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen für zytogenetische Analysen wie G-Banding und FISH. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Karyotypisierung und molekulare Untersuchungen.

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

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