Name: Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von MAMs und Glycosphingolipid-angereicherten Mikrodomänen aus dem Mäusehirn durch Dissektion, Homogenisierung und Zentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Stoffwechselprozesse in der Neurowissenschaft.

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Wir erkennen den Beitrag von Renata Sano in der Konzeption des ersten Protokolls. Ad&#39;A. hält die Jewelers Für Kinder (JFC) Stiftungsprofessur für Genetik und Gentherapie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse GM60905, DK52025 und CA021764, und den amerikanischen libanesischen syrischen Assoziierte Charities (ALSAC) finanziert.

<html> Das folgende Protokoll ist für die Isolierung und Aufreinigung von MAMs und Edelsteine ​​aus Maushirn bestimmt Lösungen für die Isolierung von Mitochondrien, MAMs und Edelsteine ​​benötigt Fraktionierung, um rohes mitochondrialen Präparation zu erhalten: Lösung A: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf) Lösung B: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO 3 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf) MAMs Isolation: Isolierung Medium: 250 mM Mannit, 5 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA Gradient Puffer: 225 mM Mannitol, 25 mM HEPES pH 7.5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (Endkonzentration) GEMs Isolation: Inhalt &quot;&gt; GEM Extraction Buffer: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf) GEM solubilisierende Puffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Bedarf). Ein. First Step subzelluläre Fraktionierung: Entfernen der Kerne, lysierten Zellen und Zelltrümmer <ol><li> Einschläfern Maus in CO 2-Kammer. </li><li> Umgehend entfernen Gehirn, halbieren, legen in 2 ml Röhrchen auf Eis und wiegen. </li></ol> Hinweis: Bewahren Sie Gehirnhälften separaten während des gesamten Verfahrens. Das gilt für die Behandlung von einem einzigen Gehirn Hälfte. <ol start="3"><li> Die Hälfte Gehirn in einer vorgekühlten 2 ml Glas Dounce Gewebe Mahlwerk mit 1 ml kaltem Lösung A. mit insgesamt 15 Schlägen eines großen Freiraum Pistill homogenisiert. </li><li> Transfer zu einem 15 ml Falcon-Röhrchen auf Eis und verdünnterHomogenate bis zu 10 Volumina w / v, z. B. 0,225 g bis 2,25 ml. </li><li> Zentrifuge Proben bei 1.400 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Transfer zu einem 30 ml-Rundkolben aus Glas Zentrifugenröhrchen auf Eis. Achten Sie darauf, um das Pellet zu stören. </li><li> Resuspendieren des Pellets in der gleichen 10 Volumen Lösung A. Homogenisieren in derselben Schleifmaschine, mit 3-6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill, 1 ml auf einmal. </li><li> Übertragen zu einem frischen 15 ml Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 710 × g für 10 min bei 4 ° C. Dies führt zu einem Pellet von Kerne und Zelltrümmer. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und Pool mit dem Überstand in Schritt 1,6 gespeichert. </li></ol> 2. Zweiter Schritt: Crude Mitochondrien Isolation <ol><li> Zentrifuge Überstände bei 13.800 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand in ein Ultra-Clear Beckman Zentrifugenröhrchen auf Eis </li><li> Pellet in 10 Volumen Lösung A. Homogenisieren in derselben Schleifmaschine, mit 3-6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill, 1 ml auf einmal. </li><li> Zentrifuge nach Schritt 2.1. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,4. </li><li> Das resultierende Pellet ist eine angereicherte mitochondrialen Fraktion. Pool die Überstände (Cytosol und ER), mit Parafilm abdecken und auf Eis. </li><li> Das Pellet mit 6 Striche eines kleinen Zwischenraum Pistill in 4,8 ml / g (g wird auf die ursprüngliche Gehirngewicht bezeichnet) der Lösung B, in einer frischen Homogenisator. </li><li> Verwendung von Glas Pasteurpipetten, bereiten einen diskontinuierlichen Sucrosegradienten in einem Ultra-Clear Beckman Zentrifuge Rohr, das Hinzufügen anschließend dem Boden des Röhrchens wie folgt, sorgfältig sichergestellt keine Blasen gebildet werden: Resupended Pellet (0,32 M Saccharose) 3 ml 850 mM Saccharose (in 1 mM NaHCO 3) 3 ml 1 M Saccharose (in 1 mM NaHCO 3) 3 ml 1,2 M Sucrose (in 1 mM NaHCO3) </li><li> Zentrifugieren bei 82.500 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Die resultierende Trennung am Ende des Gradienten wird erzeugen drei Bands und ein Pellet: 1) Myelin und anderen Kontaminanten Membran (0,32 M - 0,85 M-Schnittstelle), 2) ER, Golgi, Plasmamembranen (0,85 M - 1 M-Schnittstelle); 3) Synaptosomen (1 M - 1,2 M-Schnittstelle), 4) Rohprodukt Mitochondrien (Pellet), das für die nachfolgenden Reinigungsstufen verwendet </li></ol> 3. Isolierung von Mitochondrien-assoziierte ER Membran, MAMs <ol><li> Resuspendieren des frisch isolierten rohen Mitochondrien von einer Gehirnhälfte, in 2 ml Isolation Medium mit frisch hinzugefügten Protease-Inhibitoren. </li><li> Bereiten Sie eine 30% Percoll Gradienten mit Gradient Puffer 8 ml pro halbe Gehirn, und in einem Ultra-Clear Beckman Zentrifuge Tube. </li></ol> * Hinweis: Achten Gradientenpuffer konzentrierter (1,43 mal), um die korrekte Endkonzentration nach d zu erreicheniluting Percoll und 30%. <ol start="3"><li> Layer mitochondriale Suspension auf der vorbereiteten Gradienten langsam zu vermeiden Blasen. </li><li> Zentrifugieren bei 95.000 × g für 30 min, 4 ° C. </li><li><ol class="lroman"><li> Entfernen Sie die schwere Fraktion (unteres Band) FIRST mit einem Glas Pasteur Pipette und Transfer zu einem frischen Rundkolben Glasrohr, auf Eis. </li><li> Entfernen Sie die leichte Fraktion (oberes Band) SECOND mit einem anderen Glas Pasteur Pipette und Transfer zu einem separaten frischen Rundkolben Glasrohr, auf Eis. </li></ol></li><li> Verdünnte beide Fraktionen in Schritt 3.5 mit 10 ml Isolationsmedium und Zentrifuge gesammelt bei 6.300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen des Überstands aus der schweren Fraktion in Schritt 3,6 erhalten wird, das Pellet mit weiteren 10 ml Isolationsmedium und zentrifugieren, wie in Schritt 3.6. Das resultierende Pellet wird die reine mitochondriale Fraktion sein. </li><li> Den Überstand aus dem Licht Fraction in Schritt 3,6 bis einem Ultra-Clear Beckman Zentrifugenröhrchen erhalten, auf Eis. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Hinzufügen ausreichender Isolation Medium zu dem Überstand in Schritt erhaltenen 3,8, um das Rohr und Zentrifuge bei 100.000 × g für 1 Stunde, 4 ° C zu füllen Das resultierende Pellet wird die MAMs Bruch sein. Entfernen Sie vorsichtig und den Überstand verwerfen. </li></ol> Hinweis: Bei diesem Schritt können Sie auch bei 100.000 xg zentrifugieren für 1 Stunde, 4 ° C wird der Überstand in Schritt 2,6 gespeichert. Das Pellet wird der ER-Fraktion sein, und der Überstand der cytosolischen Fraktion. 4. Extraktion von Glycosphingolipid angereichert Mikrodomänen, GEMs <ol><li> Lyse pure Mitochondrien und / oder MAM Fraktionen in 500 ul-1 ml Extraktionspuffer für 20 min auf Eis. </li><li> Zentrifuge Lysaten bei 15.300 × g für 2 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Sammle Überstände (Triton X-100 löslichen Material) und re-Zentrifuge Pelletsfür 2 min zu entfernen verbleibende lösliche Material. (Triton X-100 extrahiert Mitochondrien und / oder Triton X-100 extrahiert MAMs). </li><li> Solubilisierung Pellets in Lösungsvermittler Buffer. Diese solubilisierten Materials stellt die GEM Fraktionen und können zur weiteren Analyse verwendet werden. </li></ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
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</ol>

Keiner der Autoren keine Interessenkonflikte zu erklären.

Die Stellen des Kontakts zwischen intrazellulären Membranen oder zwischen Organellen und der Plasmamembran von Zellen repräsentieren dynamischen Signalisierung Plattformen für grundlegende zelluläre Prozesse. Die genaue Charakterisierung ihrer Funktion und Zusammensetzung sowohl unter physiologischen und pathologischen Bedingungen erfordert zuverlässige und reproduzierbare Reinigung Protokolle. Die Verfahren detailliert hier wurden speziell von unserem Labor zur Isolierung und Aufreinigung der MAMs und ihre entsprechend...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENZIEN </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fraktionierung </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Bicarbonate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumchlorid, Hexahydrate </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchlorid, Dihydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-Mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, Fraktion V, Heat Shock, Lyophilisat </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Gemeinsam </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitoren Tablets, Complete EDTA-free </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders </td><td> Kimble Chase </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Polypropylen Konische Zentrifugenröhrchen, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml Round-Bottom Glass Zentrifugenröhrchen </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes </td><td> Kimble Chase </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrazentrifuge Röhren, Ultra-Clear, Thinwall, 14x89 mm </td><td> Beckman-Coulter </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Einweg-Flaschen aus Glas Pasteur Pipetten, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondrien-assoziierte er membranen (mams) und glycosphingolipid angereichert mikrodomänen (gem): isolation aus mäusehirn

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Intrazellulären Organellen sind hochdynamische Strukturen mit unterschiedlicher Form und Zusammensetzung, die Zell-spezifischen intrinsischen und extrinsischen Hinweise ausgesetzt sind. Ihre Membranen werden häufig an definierten Kontaktstellen, die Naben für den Austausch von Signalmolekülen und Membrankomponenten 1,2,3,4 geworden gegenübergestellt. Die miteinander organellären Membranmikrodomänen, die zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und den Mitochondrien bei der Öffnung des IP3-Ca 2 +-Kanal als den Mitochondrien-ER zugehörigen Membranen oder MAMs 4,5,6 bekannt sind ausgebildet sind. Das Protein / Lipid-Zusammensetzung und biochemischen Eigenschaften dieser Membran Kontaktstellen wurden ausgiebig insbesondere in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulierung der intrazellulären Ca 2 + 4,5,6 untersucht. Die ER dient als primären Speicher von intrazellulärem Ca 2 +, und reguliert in diesem Rahmen eine Vielzahl von zellulären Prozessen stromabwärts von Ca 2 +-Signalisierung, inkl.uding posttranslationale Proteinfaltung und Protein maturation7. Mitochondrien, auf der anderen Seite aufrechtzuerhalten Ca 2 +-Homöostase durch Puffern zytosolischen Ca 2 +-Konzentration wodurch die Einleitung Apoptosewege stromabwärts von Ca 2 + 4,8 Unwucht. Der dynamische Charakter der MAMs macht sie zu idealen Standorte, um grundlegende zelluläre Mechanismen, einschließlich Ca 2 +-Signalisierung und Regulation der mitochondrialen Ca 2 +-Konzentration, Lipid-Biosynthese und Transport, Energiestoffwechsel und das Überleben der Zelle 4,9,10,11,12 sezieren. Mehrere Protokolle wurden für die Reinigung dieser Mikrodomänen aus Lebergewebe und kultivierten Zellen 13,14 beschrieben. Unter zuvor publizierten Methoden in Betracht, haben wir ein Protokoll für die Isolierung von Mitochondrien und MAMs vom erwachsenen Mäusehirn angepasst. Um dieses Verfahren haben wir eine zusätzliche Reinigungsstufe, nämlich ein Triton X100 Extraktion hinzugefügt, die enables die Isolierung des Glycosphingolipid angereicherten Mikrodomäne (GEM) Bruchteil der MAMs. Diese Zubereitungen GEM teilen sich mehrere Proteinkomponenten mit Caveolae und Lipidflößen, aus der Plasmamembran oder anderen intrazellulären Membranen abgeleitet und vorgeschlagen, als Sammelpunkte für die Bündelung von Rezeptorproteinen und für Protein-Protein-Wechselwirkungen 4,15 funktionieren.

Basierend auf unserer Erfahrung mit der Verwendung dieses Protokoll können wir sicher empfehlen es für die Isolierung und Reinigung von MAMs, Edelsteine ​​und mitochondriale Fraktionen aus Mäusehirn. Das Verfahren wie oben in hohem Maße reproduzierbar und konsistent. In Abbildung 1 zeigen wir ein repräsentatives Bild des Weges pure Mitochondrien und MAMs Schicht auf einem Percoll-Gradienten (Schritt 3,4). Eine definierte, milchige Band enthaltenden gereinigten Mitochondrien (Mito-P) segregiert am untere...

Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.

Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Mitochondrium, die Membran des endoplasmatischen Retikulums, mikrodomänen oder MAMs aus dem Gehirn von Mäusen zu isolieren. Anschließend werden gereinigte MAMs weiter extrahiert, um die glykoreichhaltigen lipidangereicherten Mikrodomänenfraktionen oder sogenannte Gems zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn der Maus präpariert wird, das dann in einem spezifischen Puffer mithilfe eines Dounce-Homogenisators homogenisiert wird. Der resultierende Homogenat wird bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um Kerne, intakte Zellen und zellulären Abfall zu entfernen.Der zweite Schritt besteht darin, eine rohe mitochondriale Fraktion herzustellen. Durch eine weitere Zentrifugation des Überstandes wird das resultierende Pellet resuspendiert und mithilfe eines diskontinuierlichen Saccharosegradienten weiter aufgetrennt. Anschließend wird die rohe mitochondriale Fraktion auf einen Percoll-Gradienten aufgetragen.Nach der Zentrifugation und mehreren Waschschritten werden die reine mitochondriale Fraktion und die MAMs erhalten. Im letzten Schritt werden die MAMs mit einer Lösung behandelt, die TRITTON X 100 enthält, um die glykoreiche Lipid-mikrodomänen-angereicherte Fraktion gem zu extrahieren. Abschließend wird die Reinheit der Fraktionen durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung von Antikörpern gegen Proteinmarker überprüft, die charakteristisch für die verschiedenen Organellenfraktionen sind.Der Hauptvorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu bestehenden Methoden liegt darin, dass es an die Isolierung von Mitochondrien- sowie von Mam- und Gem-Fraktionen aus dem Gehirn erwachsener Mäuse unter Verwendung einer relativ geringen Menge an Untersuchungsmaterial angepasst wurde. Dieses optimierte Verfahren ist sehr reproduzierbar und ermöglicht die Isolierung ausreichender Mengen der verschiedenen Organellfraktionen, die von Forschern, insbesondere auf dem Gebiet der Neurobiologie, verwendet werden können. Zur Analyse ihrer Proteine von Interesse wird die Durchführung des Verfahrens von einer Technikerin aus meinem Labor, a, a, übernommen.Nachdem das Gehirn von einer mit Kohlendioxid euthanasierten Maus entfernt wurde, beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Gehirn der Länge nach halbieren. Legen Sie jede Hälfte in ein separates zwei-Milliliter-Gefäß auf Eis. Wiegen Sie die Gefäße unter Verwendung eines leeren, vorab gekühlten zwei-Milliliter-Gefäßes, um die Waage zu taren, und lagern Sie sie auf Eis.Überführen Sie die Hälfte des Gehirns in einen vorab gekühlten zweimilliliterfassenden Glas-Down-Tissue-Homogenisator, der ein Milliliter kalte Fraktionierungslösung enthält. Homogenisieren Sie mit insgesamt 15 Hubstößen eines Stößels mit großem Spielausgleich. Geben Sie das Homogenat in ein steriles 15-Milliliter-Falcon-Gefäß auf Eis und verdünnen Sie es entsprechend dem Probengewicht bis auf das 10-Fache mit kalter Fraktionierungslösung A.Dann zentrifugieren Sie die Probe bei 1.400 × g für 10 Minuten bei vier Grad. Entfernen Sie vorsichtig das Überstand, achten Sie darauf, das Pellet nicht aufzuwirbeln, und überführen Sie es in ein 30-Milliliter-Rundkolben-Glasküvette auf Eis. Anschließend resuspendieren Sie das Pellet in demselben 10-fachen Volumen der Fraktionierungslösung.Homogenisieren Sie das resuspendierte Pellet im gleichen Homogenisator, diesmal jeweils ein Milliliter. Verwenden Sie dabei drei bis sechs Hubbewegungen eines Stößels mit geringem Spaltmaß. Vereinigen Sie das Homogenat in einem 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 710 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Dies führt zu appellativen Kernen und Zelltrümmern. Vorsichtig den Überstand entfernen und mit dem zuvor aufbewahrten Überstand aus der vorherigen Zentrifugation vereinigen, um die mitochondriale Isolierung zu beginnen. Die S-Überstände bei 13.800 × g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugieren. Anschließend das Pellet in ein UltraClear-Beckman-Zentrifugenröhrchen auf Eis überführen.Suspendieren Sie die Pellets, die den mitochondriellen Anteil enthalten, in 10 Volumina Fraktionierungslösung A und homogenisieren Sie jeweils ein Milliliter. Verwenden Sie diesmal drei bis sechs Hubzüge mit einem Glas-Pestel mit geringem Spalt, und vereinigen Sie die Homogenate in einem neuen 30-Milliliter-Rundkolben aus Glaszentrifugenröhrchen auf Eis. Reinigen Sie die Probe anschließend durch Wiederholung dieser Schritte ein weiteres Mal. Zentrifugieren Sie das Homogenat. Entnehmen Sie die Überstände S und resuspendieren Sie das Zellpellet, indem Sie es in 10 Volumina Lösung A suspendieren und jeweils ein Milliliter nacheinander erneut homogenisieren. Im nächsten Schritt resuspendieren Sie das Pellet, das die angereicherte mitochondriale Fraktion enthält, in 4,8 Milliliter Fraktionierungslösung B pro Gramm ursprüngliches Hirngewicht, und homogenisieren Sie mithilfe von sechs Hubbewegungen eines Stößels mit geringem Spaltabstand in einem frischen Homogenisator. Bewahren Sie dieses Homogenat auf Eis auf. Bereiten Sie anschließend ein diskontinuierliches Saccharosegradient in einem UltraClear Beckman-Zentrifugenröhrchen vor.Zunächst die resuspendierte Palette hinzufügen, gefolgt von drei Milliliter 850 Millimolar Saccharose, drei Milliliter einmolarer Saccharose und schließlich drei Milliliter 1,2-molarer Saccharose. Dabei sicherstellen, dass die Lösung langsam von unten zugegeben wird, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Abschließend bei 82.500 × g für zwei Stunden bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Die resultierende Trennung ergibt drei Banden und das Überstand. Das Überstand enthält die rohen Mitochondrien, die in den nachfolgenden Reinigungsschritten verwendet werden. Wieder aufnehmen Sie die frisch isolierten rohen Mitochondrien aus einer Gehirnhälfte mit zwei Millilitern Isoliermedium.Fügen Sie anschließend acht Milliliter eines 30 %igen per-core-Gradienten in ein frisches UltraClear-Beckman-Zentrifugenröhrchen hinzu. Schichten Sie die mitochondriale Suspension sehr langsam auf den vorbereiteten Gradienten, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Zentrifugieren Sie danach bei 95.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, nachdem die Gradientenseparation erfolgt ist.Entfernen Sie zuerst die schwere Fraktion, also das untere Band, mit einer Glas-Pasta-Pipette und überführen Sie sie in ein frisches Glasrohr mit Rundboden. Bewahren Sie das Rohr auf Eis auf. Entfernen Sie anschließend die leichte Fraktion, also das obere Band, mit einer neuen Glas-Pasta-Pipette und überführen Sie sie in ein separates, frisches Glasrohr mit Rundboden.Stellen Sie dieses Reagenzglas ebenfalls auf Eis. Verdünnen Sie beide Fraktionen mit 10 Milliliter Isolationsmedium und zentrifugieren Sie bei 6.300 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie das Überstand von der schweren Fraktion und resuspendieren Sie das Pellet mit weiteren 10 Milliliter Isolationsmedium.Zentrifugieren Sie die Probe erneut unter den gleichen Bedingungen. Der resultierende Pellet stellt die reine mitochondriale Fraktion dar. Überführen Sie anschließend das Überstand von der leichten Fraktion in ein UltraClear-Beckman-Zentrifugenröhrchen auf Eis.Das Pellet aus dieser Fraktion wird verworfen, da es kontaminierende Mitochondrien enthält. Geben Sie ausreichend Isolationsmedium zum Überstand der leichten Fraktion hinzu, um das Gefäß zu füllen, und zentrifugieren Sie eine Stunde lang bei 100.000 × g und vier Grad Celsius. Das resultierende Pellet enthält die mit Mitochondrien assoziierten ER-Membranen oder MAMs.Entfernen und verwerfen Sie vorsichtig das Supinat. Beginnen Sie die Extraktion der glykoreichen Fingerlipid-mikrodomänen oder „Gems“, indem Sie die MAM-Fraktion in 500 Mikrolitern bis einem Milliliter Extraktionspuffer auf Eis für 20 Minuten inkubieren. Zentrifugieren Sie danach das Lysat 15.000 × g für zwei Minuten bei vier Grad Celsius.Sammeln Sie das Überstand und zentrifugieren Sie das Pellet zwei Minuten lang, um sämtliches verbleibende mit Triton 100 lösliche Material zu entfernen; lösen Sie das Pellet schließlich in Puffer zur Solubilisierung auf. Dieses solubilisierte Material stellt die Gem-Fraktionen dar und kann für weitere Analysen verwendet werden. Western Blots wurden durchgeführt, um die Reinheit und Verteilung von Markern für das endoplasmatische Retikulum, zytosolische Proteine und mitochondriale Marker in der zytosolischen Fraktion zu überprüfen.Die Fraktion des endoplasmatischen Retikulums, die reine mitochondriale Fraktion und die MAM-Fraktion. Western Blots zeigten außerdem, dass die GEMS positiv für CAVI-1, einen Marker für CLI, sowie negativ für Proteine des endoplasmatischen Retikulums und der Mitochondrien waren. Andererseits waren die mit Triton X-100 extrahierten MAMs positiv für Marker des endoplasmatischen Retikulums und der Mitochondrien und wiesen nur geringe Mengen an CAVI-1 auf, während dieser Versuch durchgeführt wurde.Es ist wichtig, frisch präpariertes Hirngewebe zu verwenden und anschließend alle Lösungen, Proben und Röhrchen auf Eis zu halten. Außerdem wird empfohlen, von jedem Schritt der Fraktionierung eine kleine Menge der Probe aufzubewahren, um mittels Immunblotting den Gesamterfolg des Reinigungsverfahrens überprüfen zu können.

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