Name: Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:51:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Erfahren Sie schnelle kolorimetrische Assays zur Unterscheidung von RNA und DNA in biomolekularen Proben. Diese Methode nutzt die unterschiedliche Reaktivität der Zuckerbausteine für eine effiziente Analyse.

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Diese Arbeit wurde von der University of Virginia und der Jeffress Memorial Trust (J-971) finanziert. Wir danken L. Columbus, K. Jain, und P. Randolph für hilfreiche Diskussionen und die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Ein. Benedikt Assay für reduzierende Zucker <ol><li> Bereiten Sie eine geeignete Menge von Benedict-Reagenz - 940 mM wasserfreies Natriumcarbonat, 588 mM Natriumcitrat-Dihydrat, 68 mM Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat. Dieses Reagenz kann bei Raumtemperatur (RT) für mindestens sechs Monate ohne merkliche Änderung der Reaktivität gespeichert werden. </li><li> Das obige Reagenz 6x. So 600 ul Reaktionen, mit 100 ul von Benedikt-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (zB Eppendorf-Marke), pro Probe untersucht werden. </li><li> Hinzufügen zwischen 10 ul und 500 ul Probe auf diesem Rohr, das optimale Volumen kann auf der Basis der Intensität der Farbbildung in einem anfänglichen Probelauf ermittelt werden. Wenn ausreichend Probe ist dann beginnen solche Studien an der maximal mögliche Probenvolumen (dh fünf Sechstel des gesamten Reaktionsvolumen, 500 ul der Probe in diesem Fall), und dann verdünnen anschließenden Tests. </li><li> Fügen ddH 2 O an der TUsein, um das Endvolumen auf 600 ul bringen; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren. </li><li> Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und lassen Sie es bei RT für 10 min abkühlen. </li><li> Zentrifugieren Probenröhre bei&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen. </li><li> Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette. </li><li> Blank UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser. </li><li> Die Extinktion dieser Probe bei 475 nm. </li></ol> 2. Bial Orcinol Assay für Pentosezucker <ol><li> Bereiten Sie eine geeignete Menge an frischem Bial-Reagenz - 24,2 mM Orcin Monohydrat (siehe Abbildung 2b für die Struktur dieser Verbindung), 6 M HCl, 0,025% w / v Eisenchloridhexahydrat. Hinweis:Für eine längere Lagerung können die Bial-Reagenz als zwei separate Stammlösungen hergestellt werden: (i) Reagenz A [0,05% w / v FeCl3 • 6H 2 O in konzentrierter HCl] und (ii) Reagenz B [422 mM Orcin Monohydrat in 95 vorbereitet % Ethanol]. Reagenz A kann bei RT für sechs Monate gelagert werden; Reagenz B können bei 4 ° C einen Monat gelagert werden, mit einer Folie zu Belichtung zu begrenzen. 1 (B) v / v-Verhältnis vor Gebrauch: Diese Stammlösungen werden in einem 15 (A) gemischt. </li><li> Die obige Reagenz 2x. So werden 1,0 ml Reaktionen, 500 ul Bial-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, pro Probe untersucht werden. </li><li> Fügen Sie überall von 10 ul bis 500 ul der Probe in dieser Röhre. Da pro Note 1,3 (oben), wenn eine ausreichende Probe besteht dann beginnen Studie Reaktionen mit der maximal möglichen Probenvolumen (dh die Hälfte der gesamten Reaktionsvolumens, 500 ul Probe in diesem Fall) und von dort zu verdünnen. </li><li> Hinzufügen ddH 2 O, um das Rohr um den f bringeninal Volumen auf 1,0 ml; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren. </li><li> Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und lassen Sie es bei RT für 10 min abkühlen. </li><li> Zentrifugieren Probenröhre bei&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen. </li><li> Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette für Sichtprüfung. </li><li> Für semi-quantitativen Analyse, blank Das UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser und messen die Absorption der Küvette Probe bei 660 nm. </li></ol> 3. Disches Diphenylamin Assay für 2&#39;-deoxypentose Zucker <ol><li> Bereiten Sie eine geeignete Menge Disches Diphenylamin Reagenz - 60 mM Diphenylamin, 11 M Eisessig, 179 mM Schwefelsäure, 62% v / v Ethanol. Dieses Reagenz kann vorbestellt werdenVergleich im Voraus und bei RT in einem dunklen Behälter oder mit Folie abgedeckt, um Belichtung begrenzen. Aufgrund Lichtempfindlichkeit sollte das Reagenz nicht unbegrenzt gelagert werden, obwohl in der Praxis kann es alle zwei bis drei Monate ohne sichtbare Veränderung in der Reaktivität vorbereitet werden. </li><li> Die obige Reagenz 2x. So werden 1,0 ml Reaktionen, 500 ul Disches Reagens an ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, pro Probe untersucht werden. </li><li> Fügen Sie überall von 10 ul bis 500 ul der Probe in dieser Röhre. Da pro Note 1,3 (oben), wenn eine ausreichende Probe besteht dann beginnen Studie Reaktionen mit der maximal möglichen Probenvolumen (dh die Hälfte der gesamten Reaktionsvolumens, 500 ul Probe in diesem Fall) und von dort zu verdünnen. </li><li> Fügen ddH 2 O an das Rohr, um das Endvolumen auf 1,0 ml zu bringen; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren. </li><li> Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und allow es bei RT für 10 min abkühlen gelassen. </li><li> Zentrifugieren Probenröhre bei&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen. </li><li> Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette für Sichtprüfung. </li><li> Für semi-quantitativen Analyse, blank Das UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser und messen die Absorption der Küvette Probe bei 600 nm. </li></ol> 4. Weitere Hinweise zur Verwendung <ol><li> Die folgenden Klassen von Molekülen eignen Referenzsubstanzen für positive und negative Kontrollreaktionen für jeden Assay: <ul><li> Benedikt - Positive = freie Ribose, Fructose, Glucose, Negative = RNA, DNA, ATP, etc. (Alle Saccharid fehlt eine kostenlose reduzierenden Zucker-Funktionalität) </li><li> Bial - Positive = RNA (zB Bäcker Hefe-Extrakt), Ribose, ATP, UMP, Negative = bovine serum Albumin (BSA) oder jedes andere Protein </li><li> Disches - Positive = DNA (zB Kalbsthymus); Negativ = RNA, ATP, etc. (Alle nicht-2&#39;-desoxygeniertem Nukleotid) </li></ul></li><li> Diese Assays haben sich als ziemlich elastisch ist, um Verbindungen häufig in der Proteinreinigung eingesetzt, so z. B. gemeinsame Salze wie NaCl, (NH 4) 2 SO 4 und K 2 SO 4 nicht stören, und die Reaktionen im Allgemeinen erscheinen unberührt der Inhalt des Verdünnungsmittels. Detergenzien oder chaotropen Agenzien wie Harnstoff kann sich auf die Reaktivität der Assays, wenn der pH-Wert hochbasischen; einem neutralen bis sauren pH-Bereich liegt in der Regel optimal für die Bial und Disches Assays aufgrund der darunterliegenden Reaktions Chemie (siehe den Text und die Protonen in Abbildung 2b, c). Potenziell suboptimal Reaktionsbedingungen, vermutete Störkomponenten, etc. sollten auf einer Fall-zu-Fall-Basis getestet werden, wobei positive und negative Kontrolle Experimenten with Referenz-Verbindungen. </li></ol>

<ol><li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%3A+A+Compendium+of+Methods+from+Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th, Wiley. (1999).</li>
<li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoet%2C+D+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th, John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+RLP+%22The+Biochemistry+of+the+Nucleic+Acids%22">The Biochemistry of the Nucleic Acids</a>. , 10th, Chapman and Hall. (1986).</li>
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<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Benedict, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+detection+of+reducing+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A reagent for the detection of reducing sugars.</a> J. Biol. Chem. 277, e5(1908).</li>
<li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simultaneous+estimation+method+of+DNA+and+RNA+by+the+orcinol+reaction+and+a+study+on+the+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism.</a> J. Biochem. 67, 629-633 (1970).</li>
<li>Almog, R., Shirey, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+orcinol+test+for+the+specific+determination+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modified orcinol test for the specific determination of RNA.</a> Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).</li>
<li>Dische, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+color+reactions+for+determination+of+sugars+in+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">New color reactions for determination of sugars in polysaccharides.</a> Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).</li>
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<li>Deckert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+electron+microscopy+structure+of+affinity-purified+human+spliceosomal+B+complexes+isolated+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions.</a> Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).</li>
<li>Stevens, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+functional+characterization+of+the+yeast+spliceosomal+penta-snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.</a> Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).</li>
<li>Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+protein+assay+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric protein assay techniques.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Die kolorimetrische Assays hier vorgestellten bieten eine einfache Ansatz rasch beurteilt die chemische Natur der biomolekularen Mischungen, wie sie beispielsweise auftreten, wenn Reinigung von Proteinen, RNAs oder-Komplexen aus Ganzzellen-Lysat in Vorbereitung für weitere Studien. Als Strukturbiologie verfolgt mehr native-like Baugruppen zunehmend größeren Herausforderungen wie Probe Heterogenität wird durch die komplizierte und Mehrkomponenten-Komplexen gestellt werden. Supramolekularen Aggregate sind oft nur ma...

Ein Großteil der Zellbiologie erfolgt über molekulare Wechselwirkungen zwischen DNA und RNA. 4 Diese natürlich vorkommenden Nukleinsäuren (NA) miteinander zusammenwirken, 5 mit Proteinen, 6 und mit einer Vielzahl von niedermolekularen Verbindungen und Liganden in vivo (zB divalente Kationen 7). Die Wechselwirkungen können kurz-oder langlebig (kinetisch), können von hohen Bereich zu geringe Affinität (thermodynamische Kraft) moderieren und können zeigen auch erhebliche Unterschiede in den chemischen Eigenschaften und Spezifität - einige Verbände sind recht spezifisch (zB DNA · · · Transkriptionsfaktoren, RNA · · · Spleißfaktoren), während andere Kommunikationen notwendigerweise weit mehr generische (zB DNA · · · bakteriellen histonähnliche HU-Proteine ​​8). Nicht-spezifische Interaktionen mit NAs können praktische Konsequenzen für in vitro Experimente mit Mischungen von biomolecules, da es möglich und sogar wahrscheinlich ist, dass einige NAs wird mit den Biomoleküle von Interesse zu verbinden, zumindest unter gewissen Teilmenge der experimentellen Bedingungen verwendet wird (Ionenstärke, pH usw.). Betrachten wir zum Beispiel Herstellung eines Proteins von Interesse (POI) über heterologe Überexpression des rekombinanten Proteins in Escherichia coli Zellkultur; solches Verfahren wird routinemäßig in praktisch jedem strukturellen Biologielabor durchgeführt 9 In Vorbereitung für weitere Experimente, wie. Als biochemischen / biophysikalischen Charakterisierung, Kristallisation, etc., anfänglichen Bemühungen in der Regel auf die Erzielung einer ausreichenden Menge des POI konzentrieren möglichst reiner Form wie möglich, idealerweise als chemisch homogen und biophysikalisch monodisperse Probe. Nach dem Aufbrechen der Wirtszellen, zielen die frühen Phasen eines typischen Aufreinigung Workflow, um den POI aus E. isolieren coli-Proteine, Nukleinsäuren, Zellwandtrümmern,und andere Komponenten des zellulären Lysat. Jedoch Host NAs kann mit dem POI mehrere physikochemische Gründen co-läutern - ein hochbasisches POI kann unspezifisch Pulldown-Wirts-DNA / RNA, die POI kann ein generisches NA-bindende Aktivität aufweisen (zB die oben erwähnten HU); das POI kann eine ziemlich spezifische NA-Bindungsprotein sondern zeigen Kreuzreaktivität mit Host-RNAs oder DNAs sein; Host NAs kann mit einer Chromatographiematrix wechselwirken und dadurch einfach koeluieren mit dem POI, und so weiter. Willkürliche, hoch-affine Bindung von Host NAs zu einem POI können stellen eine ärgerliche Problem, weil die NA Verunreinigungen wird wahrscheinlich mit nachgeschalteten Experimente (zB Fluoreszenzanisotropie Assays POI • RNA-Bindung 10) stören. Alternativ unerwartete POI · · · NA Verbände können auch zufällig angesehen werden, wie solche Wechselwirkungen beleuchten die POI-Nukleinsäure-bindende Kapazität. So oder so, ob NAs wichtigen Komponenten oder Verunreinigungen sind, muss man zunächst quantifizieren undBestimmung der Art (DNA, RNA) von Co-Reinigungskatalysator NAs in Vorbereitung für nachfolgende Versuche. Mehrere analytischen Methoden existieren zur Detektion und Quantifizierung von NA in einer Probe. Die meisten der verfügbaren Methoden sind grundsätzlich entweder spektrophotometrischen (z. B. A 260 Extinktionswerte und A 260 / A 280-Verhältnisse), fluorometrische (z. B. die Bindung von Thiazolorange oder andere fluoreszierende Farbstoffe auf NA) oder farbmetrisch (Suszeptibilität von Nukleosiden, um chemische Reaktionen Ausbeute daß Chromophore absorbierend im UV-VIS-Bereich des elektromagnetischen Spektrums), wie kürzlich von De Mey et al. 1 Jedoch ist der entscheidende Schritt des Identifizieren des Typs des Polynukleotid, wie RNA oder DNA über den Rahmen viele dieser Quantifizierung Ansätze. Hier bieten wir einen Satz von kolorimetrischen Assays für die schnelle Erkennung der Arten von NA-Komponenten in einem proteinhaltigen Probe. Die hier beschriebenen Protokolle ceine effizient ohne zusätzlichen Schritte der Isolierung der potentiellen NA Verunreinigungen ausgeführt werden, und sich auf Benedikts Assay für reduzierende Zucker 11, das Orcinol-Assay für Pentosen 12,13, 14,15 und Diphenylamin Reaktionen von 2&#39;-deoxypentoses (Abbildungen 1 und 2) . Die Benedikts Test (2a) nutzt die Fähigkeit der linearen, offenkettige (Aldehyd)-Form einer Aldose Zucker zu Cu 2 +, unter Oxidation des Zuckers Carbonylgruppe zu einer Carboxylat-Komponente und Produktion von Cu 2 O als eine Reduzierung unlöslichen roten Niederschlag. Diese Reaktion testen mit freien reduzierenden Zuckern wie Aldosen und Ketosen (die mit den entsprechenden Aldosen über Endiol Zwischenprodukte umzuwandeln) positive, aber nicht mit Pentosezucker, dass in zyklischer Form als Teil der kovalenten Rückgrat eines DNA-oder RNA-Polynukleotid gesperrt. Aufgrund des minimalistischen Erfordernis einer freien Halbacetal Funktionalität, andere Compounds, die positiv getestet werden in diesem Test konnte - und wirken somit als potenzielle Störfaktoren - gehören α-Hydroxy-Ketone und kurze Oligosaccharide (zB das Disaccharid Maltose). Sowohl die Bial Orcin (Abbildung 2b) und Disches Diphenylamin (Abbildung 2c) Reaktionen werden bei der erstmaligen Zerstörung des Polynukleotid Backbone, über Depurinierung der Nukleosid-und weitere Säure-oder Basen-katalysierten Hydrolyse der Muttergesellschaft Nukleotide, die Furan-2 ergeben -carbaldehyd (Furfural) Derivate; diese Derivate reagieren dann entweder mit einem Polyhydroxyphenol wie Orcin (Bial) oder Diphenylamin (Disches) Reagenzien, farbige Kondensationsprodukte von weitgehend unbekannten chemischen Struktur zu bilden. Die DNA im Vergleich zu RNA-Spezifität des Disches Assay beruht auf der Tatsache, daß der Pentosezucker muss 2&#39;-desoxygenierten, um es zu Störungen durch Oxidation zu ω-hydroxylevulinyl Aldehyd, das weiter reagiert mit Diphenylaminunter sauren Bedingungen unter Bildung eines hellblauen Kondensat (Abbildung 2c). Mit den hier beschriebenen Protokolle gestrafft haben wir gefunden, dass diese zuckerfreie spezifischen kolorimetrischen Reaktionen können zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, und wird auch auf das Vorhandensein von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose oder Ribose in einer biomolekularen Probe.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz oder Ausrüstung </td><td> Lieferant / Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare, Notizen </td></tr><tr><td> Wasserfreies Natriumcarbonat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumcitratdihydrat </td><td> Sigma </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Orcinol Monohydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> Konzentrierte HCl </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Eisenchloridhexahydrat </td><td> Sigma </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylamin </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> Fisher Scientific </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Ribose </td><td> Sigma </td><td> R-7500 </td><td> prep bei 1% w / v in H 2 O </td></tr><tr><td> Ribonukleinsäure aus Bäckerhefe (S. cerevisiae) </td><td> Sigma </td><td> R6750 </td><td> prep bei 10 mg / ml in H 2 O; bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Desoxyribonukleinsäure (Natriumsalz), aus Kalbsthymus </td><td> Sigma </td><td> D1501 </td><td> prep bei 10 mg / ml in H 2 O; lagern bei 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien, Geräte und Sicherheit Die Materialien werden in der fo aufgeführtllowing Tabelle in der Reihenfolge, in der sie in dem Protokoll Abschnitt. Soweit nicht anders vermerkt (siehe oben), können alle Reagenzien bei Raumtemperatur und Beleuchtung gespeichert werden. Für alle Posten, die nicht unten aufgeführt (z. B. Mikrozentrifugenröhrchen), kann die übliche Marke / Modell / Sorte fand in einem Standard biochemischen Labor eingesetzt (z. B. Marke Eppendorf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen) werden. Standard-Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen sollte Schritte, welche Zentrifugation (zB zu sedimentieren Partikelmaterial in der Nähe des Ende jedes Protokoll) verwendet werden. Keine spezielle Material ist bevorzugt, solange die Rohre abzudichten; die typischen Polypropylenröhrchen in Biochemie Laboratorien gefunden funktionieren gut. In Bezug auf die Sicherheit Bedenken und Entsorgung, sollte Standard-Labor-Vorsichtsmaßnahmen (Schutzbrille, Abzugshauben) bei der Aufstellung ausgeübt werden, die Arbeit mit und die Entsorgung von Lösungen mit konzentrierter Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure. Für organische Reagenzien wie Orcin oder diphenylamin sind Nitril vorzuziehen gemeinsamen Latex (Naturkautschuk) Vielfalt. </td></tr></tbody></table>

schnelle kolorimetrische assays zur qualitativ unterscheiden rna und dna in biomolekulare proben

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biochemischer Experimente in der Regel erfordert genaue Kenntnisse, in einem frühen Stadium, der Nukleinsäure, Protein und anderen biomolekularen Komponenten in potentiell heterogenen Proben. Nukleinsäuren können über mehrere etablierte Methoden, einschließlich analytischen Methoden, die spektrophotometrische sind (z. B. A 260), fluorometrische (z. B. die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffe) oder farbmetrisch (Nukleosid-spezifischen chromogenen chemische Reaktionen). 1 Obwohl es nicht leicht unterscheiden kann erkannt werden RNA aus DNA, das A 260 / A 280-Verhältnis wird üblicherweise verwendet, da sie einen einfachen und schnellen 2 Beurteilung der relative Gehalt an Nukleinsäure, die überwiegend in der Nähe 260 nm absorbiert und Protein, das hauptsächlich in der Nähe 280 nm absorbiert bietet. Ratios &lt;0,8 werden als Indikator für die &quot;reinen&quot; Protein Proben entnommen, während reine Nukleinsäure (NA) durch Verhältnisse gekennzeichnet ist&gt; 1,5 3. However, gibt es Situationen, in denen das Protein / NA Gehalt nicht deutlich oder können als zuverlässig abgeleitet von einfachen UV-VIS spektrophotometrische Messungen. Zum Beispiel werden (i) Proben können ein oder mehrere Proteine, die relativ frei von den aromatischen Aminosäuren, die für Absorption bei ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) sind, wie es der Fall mit einigen kleinen RNA-bindenden Proteinen und (ii) Proben weisen Zwischenprodukt A 260 / A 280-Verhältnisse (~ 0,8 &lt;~ 1,5), wo das Protein / NA Inhalt ist weit weniger klar und kann sogar auf eine gewisse hoher Affinität Zusammenhang zwischen dem Protein und NA-Komponenten. Für derartige Szenarien beschreiben wir hier eine Reihe von kolorimetrischen Assays rasch unterscheiden RNA, DNA und reduzierende Zucker in einer potentiell Mischprobe von Biomolekülen. Die Methoden beruhen auf der Differenz Empfindlichkeit der Pentosen und andere Kohlenhydrate Benedikt, Bial (Orcin) und Disches (Diphenylamin) Reagenzien, die gestrafft Protokolle com seinabgeschlossen innerhalb weniger Minuten, ohne irgendwelche zusätzlichen Schritte aufweist, um die Komponenten zu isolieren. Die Assays können parallel durchgeführt werden, um zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, sowie die Anwesenheit von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose, Ribose und (Abbildung 1).

Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 für die Anwendung dieser kolorimetrische Assays bekannt Referenzsubstanzen gezeigt. Vertreter qualitative Daten für die Benedikt (a), Orcin (b) Bial und Disches Diphenylamin (c) Assays gezeigt, und Standard-Kurven für diese drei Tests sind in Abbildung 4 dargestellt. Einsatzplatten 3 (ac) zeigen die linke Felder positive / negative Kontrollexperimente unter Verwendung geeigneter reaktiver / unreaktiv Analyten; diese visuellen Ergebnisse sind in sit...

Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, festzustellen, ob eine potenziell heterogene Probe von Biomolekülen Nukleinsäuren und/oder reduzierende Zucker enthält. Und wenn ja, unterscheiden Sie zwischen RNA und DNA basierend auf der unterschiedlichen Reaktivität ihrer Zuckeranteile. Dies wird erreicht, indem zunächst der Benedict-Assay angewendet wird, um festzustellen, ob das biomolekulare Gemisch freie reduzierende Zucker enthält.Als zweiter Schritt wird eine Datei mit Arsen oder einem Assay verwendet, der feststellt, ob Zuckerbestandteile Pentoringe enthalten oder nicht. Das Diphenylamin-Reagenz wird verwendet, um festzustellen, ob der Pentozucker eine Desoxyribose ist, wie in der DNA oder nicht, wie in der RNA. Die Ergebnisse zeigen die Art des Biopolymers auf der Grundlage von leicht unterscheidbaren Farbprodukten, die durch die differentielle Reaktivität von zuckerbasierten Komponenten in der Probe gebildet werden und die mit spektrophotometrischen Messungen gegen Standardkurven analysiert werden können.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektrophorese mit Fluoreszenzfarbstoffen, Picogrün oder Cybergold besteht darin, dass es keine Einschränkungen aufgrund von Größe, Ladung oder Zuckerkomponente gibt und sie zeit- und kosteneffizient ist, um Zucker zu reduzieren. Bereiten Sie ein geeignetes Volumen von sechs x Benedict-Reagenz her, bestehend aus 940 Millimolar wasserfrei, Natriumcarbonat 588 Millimolar, Natriumcitratdihydrat und 68 Millimolar Kupfer. Zwei Sulfat-Penta-Hydrate.Für jede zu untersuchende Probe werden 100 Mikroliter des sechs x Benedict Reagenzes in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Geben Sie zwischen 10 und 500 Mikroliter Probe in jedes Röhrchen und fügen Sie doppelt destilliertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 600 Mikroliter Wirbel oder Pipette zu bringen. Um die Lösung zu mischen.Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang in einem kochenden Wasserbad und lassen Sie sie dann 10 Minuten abkühlen, bevor Sie fünf Minuten lang bei etwa 10.000 U/min zentrifourieren. Um Partikel zu sedimentieren, übertragen Sie das Supinat in ein sauberes Vete, nachdem Sie das UV- vs. Spektralphotometer mit Wasser bei 475 Nanometern abgeblendet haben.Messen Sie die Absorption der Probe, um auf Pentozucker zu testen. Bereiten Sie zwei x BALs Reagenz mit 24,2 Millimolaren, sechs molaren Chlorwasserstoff und 0,025 Gew.-% Eisenchlorid-Hexahydrat gemäß dem Textprotokoll vor. Geben Sie für jede Probe 500 Mikroliter Gallenreagenz in ein Mikrozentrifugenröhrchen.Geben Sie zwischen 10 und 500 Mikroliter Probe in jedes Röhrchen und fügen Sie doppelt destilliertes Wasser hinzu, um das endgültige Volumen auf einen Milliliter zu bringen. Eine Mischung. Kochen Sie die Proben 20 Minuten lang, kühlen Sie sie dann 10 Minuten lang bei Raumtemperatur ab, nachdem Sie die Probe heruntergeschleudert haben, um das Partikelmaterial zu sedimentieren, und messen Sie die Absorption bei 660 Nanometern mit Wasser als Rohling.Bereiten Sie zwei x Schalen Diphenylamin-Reagenz vor, bestehend aus 60 Millimolar Diphenylamin, sieben molaren Eisessig, 179 Millimolar Schwefelsäure und 62% Volumen pro Volumen. Ethanol. Kombinieren Sie für jede Reaktion 500 Mikroliter Reagenz, die Probe und doppelt destilliertes Wasser, um das Gesamtvolumen auf einen Milliliter zu bringen. Nach dem 20-minütigen Kochen der Proben, dem Abkühlen auf Raumtemperatur und dem Schleudern wird die Extinktion bei 600 Nanometern gemessen.Hier sehen Sie ihre repräsentativen qualitativen Daten für das Benedicts Biles Arsenal und Schalen, Diphenylamin-Assays für bekannte Referenzverbindungen. Die linken Felder zeigen sowohl Positiv- als auch Negativkontrollen an, und die rechten Felder zeigen den sichtbaren Nachweisbereich der Assays an. Dieses Panel veranschaulicht die Robustheit der Assays, indem es die Reaktion der Schale mit Proben unterschiedlicher Heterogenität zeigt.Zum Beispiel DNA mit RNA oder DNA mit Protein. Beachten Sie, dass die positiven Ergebnisse des Dish-Assays für DNA-haltige Proben auch in Gegenwart von kontaminierender RNA oder Protein erhalten bleiben. Die Verdünnungsbereiche in den vorherigen Proben variieren, da jede Reaktion eine unterschiedliche visuelle Nachweisgrenze hat.Abhängig von der Art des zu untersuchenden Zuckers kann die photometrische und nicht die visuelle Detektion verwendet werden, um die Messbereiche zu verbessern, wie in dieser Standardkurve gezeigt. Für den Benedict-Assay kann diese Technik, sobald sie gemeistert ist, in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

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RNA-CISH-Signaldetektion: Eine Technik zum Nachweis chromogener Signale während der RNA-In-situ-Hybridisierung in intakten Gewebeproben

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Verbesserte Northern Blot Detektion von kleinen RNA-Spezies in Drosophila melanogaster

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Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

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