Name: Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 56 s
Description: Lernen Sie die SSM-basierte Elektrophysiologie zur Charakterisierung elektrogener Membrantransporter. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller und eukaryotischer Transporter, die mit konventionellen Techniken nicht zugänglich sind.

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Wir danken J. Garcia-Celma, ich Smirnova und R. Kaback für Beiträge zu den LacY Messungen und E. Bamberg für die Unterstützung und hilfreiche Diskussionen.

1. Einrichten einer Vorrichtung zum SSM-basierte Elektrophysiologie Einzelheiten sind in zwei unserer technischen Publikationen, die auch schematische Zeichnungen und Fotografien von unseren Küvetten und Einrichten 1, 2 gegeben. Unterschiedliche Konfigurationen Lösung Austausch und Durchfluss-Protokolle sind auch in unserer Methode Papier 2 diskutiert. Im Folgenden wollen wir noch ein paar letzte Verbesserungen und technische Details, die von unmittelbarer Bedeutung für die Video-Präsentation sind. Ventilsteuerung und Datenerfassung Die Interface-Box enthält einen handelsüblichen USB-Digitalausgang / Analog-Input-Schnittstelle (NI USB 6009 National Instruments) und die Ventil-Treiber. Es steuert die Lösung fließen und ist verantwortlich für die Datenerfassung. Ventile werden in der Regel mit 12 angetrieben V. Doch für schnelle Schaltzeiten der Ventile mit einer Spannung von bis zu 18 gefahren werden V. In dem Video verwenden wir eine 12 V Spannungsversorgung. &lt;/ P&gt; Das Ventil Treiber Leiterplatte betreiben vier Ventile. Es wurde von der Werkstatt des Max-Planck-Institut für Biophysik hergestellt. Ventile können per Computer oder manuell über Schalter an der Frontplatte gesteuert werden. Letzteres ist zum Spülen-und Reinigungsarbeiten-Verfahren bequem. Während der Messung ist die Interface-Box computergesteuerten mit einer Ventilsteuerung und Datenerfassungs-Software (SURFE 2 R-Software, IonGate Biosciences). 2. Vorbereitungen In diesem Abschnitt werden die verschiedenen Protokolle für die Herstellung eines SSM-basierte Elektrophysiologie Experiment genannt. 2.1 Herstellung der Lipid-Lösung für die Bildung des SSM <ol><li> Mix 25 ul Octadecylamine (5 mg / ml in Chloroform) und 375 ul Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml in Chloroform) in einem Glas Fläschchen. </li><li> Unter Verwendung eines Rotationsverdampfers und kontinuierlichen Strom von Stickstoffgas, dampft das Chloroformca. 30 min. </li><li> Entfernen Sie das Lipid aus den Wänden der Glasampulle durch Schütteln mit 500 ul n-Dekan. Die endgültige Lipidkonzentration 15 mg / ml mit 1:60 (w / w) Octadecylamin. </li><li> Die Lösung wird in das Glas Lagervials. Bewahren Sie die Lipid-Lösung bei -20 ° C. </li></ol> 2.2 Chlorierung des Referenz-Elektrode Die Referenzelektroden müssen in regelmäßigen Abständen durch Abrieb chloriert werden. <ol><li> Entfernen Sie den Rest des alten Silberchlorid Schicht mit feinem Sandpapier vor der Chlorung. </li><li> Setzen Sie den Silberdraht zusammen mit einem Platin-Elektrode in eine 1 M Salzsäure-Lösung und chloren für 15 min bei 0,5 mA. Nach Chlorierung, ändert der Silberdraht seine Farbe zu einer homogenen dunkelgrau. </li></ol> 2.3 Herstellung des Polyacrylamidgel Brücke <ol><li> Bereiten einer Lösung, die 100 mM KPi bei pH = 7, 100 mM KCl und 6% Acrylamid. </li><li> In 0,3% APS (10% Lager) und 0,6% TEMED und kurz mischen die Lösung mit einer Pipette. </li><li> Unmittelbar nach dem Mischen der Lösung mit einer Pipette 30 ul der Mischung in den leeren Gelbrücke Behälter zu injizieren. Es ist wichtig, um Luftblasen während der Injektion zu vermeiden. </li><li> Während einer Inkubationszeit von 20 min das Gel polymerisiert. </li><li> Nach der Polymerisation wird das Gel Brücke wird in Lösung (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCl) gespeichert. Um die Lebensdauer der Brücke zu verlängern Gel wird die Lösung bei 4 ° C gelagert </li></ol> 2.4 Herstellung der Messlösungen Aufgrund der starken Wechselwirkung der gelösten Stoffe mit dem SSM werden elektrische Artefakte erzeugt werden, wenn Lösungen unterschiedlicher Zusammensetzung ausgetauscht werden. Daher ist die Herstellung der Lösungen ein kritischer Schritt. Nehmen Sie die folgenden Vorsichtsmaßnahmen bei der Zubereitung der Lösung Prozess Lösung Austausch Artefakte zu minimieren. <ol><li> Als Nicht-Aktivierung und Aktivierung Lösungen aus einer Charge, den pH-Wert und Ionenstärke. </li><li> Hohe Salz Hintergrund hilft Lösung Austausch Artefakte zu reduzieren. </li><li> Teilen Sie die Batch-Lösung in zwei Bänden. </li><li> Fügen Sie die aktivierende Verbindung zum aktivierenden Lösung. Verwenden Sie eine kompensatorische Verbindung in der nicht-aktivierenden Lösung, um die Osmolarität und Ionenstärke der beiden Lösungen so ähnlich wie möglich zu halten. </li><li> Wenn die Lösungen bei 4 ° C gelagert werden, um sicherzustellen, dass alle Lösungen Raumtemperatur erreicht, bevor eine Messung, denn auch kleine Unterschiede in Temperatur Artefakte produzieren kann. </li></ol> 3. Ein SSM-basierte Elektrophysiologie Experiment Hier präsentieren wir Ihnen ein typisches Protokoll für ein SSM-basierte elektrophysiologische Experiment. 3.1 Vorbereiten des SSM-Setup Während die SSM-Setup ist nicht in Gebrauch sind die Rohre mit einer 30% Ethanol gefüllt/ Wasser-Lösung, um das Bakterienwachstum zu verhindern. <ol><li> Waschen Sie das System mit reinem Wasser, um das Ethanol aus dem Schlauch zu entfernen, bevor Montage der Küvette. Ersetzen Sie die Behälter mit Wasser Ethanol Behältern. Mit hohem Druck (0,6 bis 1,0 bar) reinigen Sie das System mit 20-30 ml Wasser. </li><li> Wiederholen Sie den Reinigungsvorgang mit einem 100 mM KPi Puffer bei pH 7,6 oder nicht-aktivierende Lösung. </li><li> Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Flüssigkeit System verbleiben. </li></ol> 3.2 Montage der Küvette <ol><li> Bringen Sie einen O-Ring auf die Referenz-Elektrode </li><li> Nehmen Sie die Gel-Brücke aus dem Storage-Lösung und verbinden Sie das Referenz-Elektrode. </li><li> Prefill der Auslass-Anschluss mit nicht-aktivierende Puffer, legen Sie einen O-Ring und verbinden Sie das Gel Brücke, um die Referenz-Elektroden-Einheit abzuschließen. Besondere Vorsicht, dass keine Luftblasen an der Kreuzung des Gels Brücke und dem Auslass Lösung Strömungsweg sind. </li><li> Vormontieren Hauptteil des cuveTTE indem die Feder Kontaktstift (Verbindung zum Verstärker), das Einlaßrohr (Verbindung zu dem Endgerät Ventil) und den O-Ring (Dichtring für den SSM) und die Schrauben. </li><li> Mit einer Pinzette, nehmen Sie den Sensor-Chip aus dem Speichern-Lösung (10 mM Octadecanthiol in Ethanol). </li><li> Mit einer Pipette abwaschen die verbleibende Lösung mit ca.. 5 ml reinem Ethanol. </li><li> Trocknen Sie die Elektrode unter Stickstoffgas. </li><li> Den Sensor Chip genau an dem Basisteil der Küvette so dass die Zulaufbohrung des Hauptteils der Küvette wird in die kreisförmige aktive Fläche des Sensors gerichtet ist. </li><li> 1 ul der Lipid-Lösung, um den aktiven Bereich des Sensorchips. Stellen Sie sicher, dass die Goldschicht vollständig von der Lipid bedeckt. </li><li> Unmittelbar nach der Zugabe des Lipid-Lösung, schließen Sie die Küvette, indem Sie die vormontierte Hauptteil. </li><li> Vor der Montage die Küvette in die Faraday-Käfig, sicher sein, dass alle Flächen vollständig trocken sind. </li><li> Connect den Verstärker an die Federkontaktstift und der Einlassröhre zum Terminal Ventil. Dann befestigen Sie die Küvette mit den Schrauben im Inneren des Faraday-Käfig. </li><li> Schrauben Sie den Stecker Steckdose an die Spitze der Küvette. Zum Schluss das Auslaufrohr mit dem Auslass-Anschluss und der Spannung Generator zur Referenzelektrode. </li><li> Unmittelbar nach der Montage der Küvettenwaschstation das System mit Puffer bei 0,6 bar. Dies führt zu einer spontanen Bildung SSM. </li></ol> 3.3 Messung Membranparameter Um die Qualität des SSM zu überprüfen, sind Kapazität und Leitfähigkeit gemessen mit Hilfe der Funktion Generator. <ol><li> Mit der Funktion Generator, gelten 100 mV Gleichspannung um die Leitfähigkeit zu messen. </li><li> Berechnen der Leitfähigkeit: Die Stromabfall zeigt die Aufladung des Kondensators Membran. Nachdem der Kondensator vollständig aufgeladen ist der gemessene Strom ergibt die Membran Leitfähigkeit mit Ohm-Gesetz. Aus Gründen der Einfachheit verwenden wir die current 1 Sekunde, nachdem die Spannung angelegt wird, um die Leitfähigkeit G = I / U. berechnen </li><li> Tragen Sie eine dreieckige AC Spannung von 50 mV Spitze-Amplitude und eine Frequenz von 0,5 Hz, um die Kapazität zu messen Höhepunkt. </li><li> Berechnen der Kapazität: Die Amplitude des resultierenden Rechteckstrom stellt die Ladeströme des Kondensators. Die Kapazität C ist gleich der übertragenen Ladung Q = IΔt von AU = 100 mV unterteilt. (AU ist das Doppelte der angelegten Spannung von 50 mV, weil ich die Differenz aktuellen positive minus negative Steigung des dreieckigen Spannung.) </li><li> Überwachen Sie die elektrischen Parameter der Membran wiederholt alle 10 min für ca. 30 bis 40 min, bis konstante Werte erreicht. Waschen dazwischen mit KPi-Puffer bei hohem Druck im Bereich von etwa 0,6 bis 1 bar. </li><li> Schätzen der Qualität des SSM: optimalen Parameter sind in dem Bereich von 0,1 bis 0,2 nS und 2 bis 3,5 nF. Eine hohe Leitfähigkeit über 0,8 nS und eine geringe Kapazität unter 1 nF zeigtdass die SSM nicht korrekt gebildet wird. Eine hohe Kapazität über 4 nF bedeuten kann, dass die aktive Zone nicht vollständig von der SSM bedeckt. </li><li> Wenn die Parameter nicht im optimalen Bereich, sollte die Membran verworfen und andere SSM hergestellt, wobei ein frisch zubereitetes Elektrodenchip. </li></ol> 3.4 Prüfungen für Lösung Austausch Artefakte Nachdem die Membran Parameter überprüft wurden, sollte die Messung Puffer für Lösung Austausch Artefakte getestet werden. <ol><li> Legen Sie die jeweiligen Container-Lösung auf das Fluid-System. </li><li> Entfernen Luftblasen aus dem Fluid-System, mit Hilfe der manuellen Ventilen. </li><li> Mit der Software zur Datenerfassung wählte den Fluss Protokoll, das Sie wollen in Ihrem Experiment verwenden. </li><li> Stellen Sie den Druck bis 0,6 bar und die Messung gestartet. </li><li> Abgesehen von den mechanischen Schalten des Ventils Artefakte im Idealfall kein Artefakt Ströme gemessen werden, oder sie sollte viel SMA dieller als die erwarteten Protein-Transport-Signale. Wenn Lösung Austausch Artefakte beobachtet werden, versuchen, die Puffer Zusammensetzungen und / oder die Vorbereitung Verfahren vor der weiteren Experiment zu optimieren. </li></ol> 3.5 Hinzufügen der Proteinprobe Gewöhnlich Proteoliposomen oder Membranfragmente werden bei -80 ° C gelagert Vor jeder Messung wurde ein Aliquot von etwa 30 ul benötigt. <ol><li> Spülen Sie das SSM mit nicht-aktivierende Lösung. </li><li> Tauen Sie das Protein Probe auf Eis. </li><li> Drei 10-sec Ultraschallbehandlung Zyklen werden mit 10-sec Kühlintervalle auf Eis wechselten. Proteoliposomen werden beschallt mit einem Ultraschallbad. Für Membranfragmente ein Tipp Ultraschallgerät (50W, 30 kHz, 1 mm Durchmesser Sonotrode, Intensität 20%, Zyklus 0.5) verwendet wird. Nach dem letzten Schritt Beschallung nicht setzen die Probe wieder auf Eis, aber spritzen sie sofort in die Küvette. </li><li> Lösen Sie die Ausgangs-Connector zusammen mit der Referenz-Elektrode Assembly. </li><li> Mit einer Pipette absaugen 30 ul der Proteinprobe und montieren Sie die Pipettenspitze auf die Auslaßbohrung. </li><li> Öffnen Sie die manuelle Ventil in der nicht-aktivierenden Weg zum Abfallbehälter und injizieren die Proteoliposomen in die Küvettenvolumens. Achten Sie darauf, um Luft in den Küvettenvolumens spritzen mit dem Sensor. </li><li> Vor dem Entfernen der Pipettenspitze, schließen Sie das manuelle Ventil zur weiteren Lösung Strömung zu verhindern. </li><li> Lassen Sie die Proteoliposomen an die SSM zu einer Inkubationszeit von 1 bis 2 Stunden zu adsorbieren. Es ist auch möglich, über Nacht inkubieren. </li></ol> 3.6 Allgemeine Vorgehensweise eines SSM-basierten Experiment <ol><li> Warm up die Messung Puffer in der Zeit, wenn bei 4 ° C gelagert Alle Mess-Puffer müssen bei Raumtemperatur vor der Messung, um Artefakte zu vermeiden. </li><li> Beim Wechsel Lösungen, reinigen Sie zuerst die Rohre im Inneren der Behälter mit einer Lösung fusselfreien Gewebe, dann legen Sie die neuen Flaschen. </li><li> Vor Beginn der Messung, verwenden Sie die manuelle Ventile, um Luftblasen, die aus dem sich ändernden Verfahren entwickelt haben könnte entfernen. </li><li> Stellen Sie den Druck kurz vor Beginn einer Messung. Wir verwenden routinemäßig einen Druck von 0,6 bar, die an unsere spezifischen Ventil und Rohr-Konfiguration ergibt sich eine Flussrate von etwa 1,0 ml / sec. </li><li> Die ersten Messungen durchgeführt werden können direkt nacheinander durchgeführt und sollte zurückgewiesen, bis die maximale Stromaufnahme konstant bleibt. Falls die in pH unterscheiden eine Inkubationszeit von mindestens 3 min erforderlich, um den pH-Wert der inneren Proteoliposomen vor Beginn der Messung einzustellen. </li><li> Nun ist die Einrichtung ist für die Messung bereit. Um den Lärm zu reduzieren mindestens 3 Messungen sollten und gemittelt werden. </li></ol> 3.7 Kontrollmessungen Ein Signal rundown während einer Reihe von Messungen können aufgrund Proteinabbau oder einem Verlust der Adsorption. Jedes Experiment SSM sollte ichnclude ein heruntergekommenes Kontrolle. Dies geschieht durch wiederholte Messungen mit identischen Lösungen durchgeführt. Die minimale Verminderung Steuereinrichtung eine Messung am Anfang und einer am Ende des Experiments unter Verwendung der gleichen Lösung. Wir empfehlen, den heruntergekommenen Steuerung unter Bedingungen, bei denen Sie erwarten, dass die höchsten Gipfel Amplitude im Experiment zu tun. Dies macht es einfacher, die Verminderung des Signals zu quantifizieren. Das Signal heruntergekommenen durch einen Vergleich der Peak-Amplituden der beiden heruntergekommenen Kontrollen quantifiziert werden. Die resultierende prozentuale Wert kann verwendet werden, um die gemessenen Signale durch Annahme einer linearen Zeitabhängigkeit der heruntergekommenen korrigieren. 3.8 Artifact Kontrollen Wenn möglich, versuchen, um Ihre Ergebnisse durch die Hemmung des Proteins von Interesse validieren nach dem Experiment. Verbleibende Signale sind wahrscheinlich Lösung Austausch Artefakte. Die Signale müssen dann für die gemessenen Artefakte korrigiert werden. <ol><li> Waschen des Systems mit 20-30 ml reinem Wasser und 20-30 ml 30% Ethanol / Wasser. Die ethanolische Lösung vermeidet Bakterienwachstum, wenn das System nicht in Gebrauch ist. </li><li> Nach diesem Reinigungsvorgang, den Druck aus dem System und schalten Sie alle Geräte. </li><li> Entfernen Sie die Küvette aus dem Faraday-Käfig und es absteigen. Alle Teile der Küvette mit Wasser und reinem Ethanol gereinigt werden, falls notwendig, mit einem Ultraschallbad. </li><li> Platzieren Sie den Sensor-Chip in einem Glas Becherglas mit reinem Ethanol. Beschallen das Becherglas für etwa 1 bis 2 min mit einem Ultraschallbad. </li><li> Trocknen Sie den Sensor-Chip unter Stickstoffgas. </li><li> Bewahren Sie den Sensor-Chip weg vom Licht in einem 10 mM Octadecanthiol ethanolischer Lösung. Nach einer Inkubationszeit von etwa 30 min der Sensorchip ist bereit für die Wiederverwendung. </li></ol>

<ol><li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li>
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<li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li>
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<li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose%2FH%2B+symport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

1. Vorteile der SSM-basierte Elektrophysiologie Vergleich zu konventionellen Methoden SSM-basierte Elektrophysiologie hat sich als wertvolles Instrument der elektrophysiologischen Toolbox bewährt. Es ist besonders nützlich in Fällen, in denen Konvention Elektrophysiologie, nämlich Patch-Clamp-und Voltage-Clamp-Verfahren nicht angewendet werden kann: Abgesehen von einigen seltenen Ausnahmen bakterielle Transporter kann nicht untersucht mittels Voltage-Clamp-oder Patch-Clamp-Verfahren aufgrund der geringen Größe von Bakterien und da werden sie sind schwierig in Säugerzellen oder Oozyten auszudrücken. Aber auch physiologisch relevanten Säugetier-Transporter untersucht werden. In diesem Fall SSM-basierte Elektrophysiologie ist attraktiv für Transporter aus intrazellulären Membranen und für Screening-Anwendungen in der Wirkstoffforschung wegen seiner Robustheit und seinem Potenzial für die Automatisierung. SSM-basedUsing konventionellen Elektrophysiologie, zeitaufgelöste Charakterisierung transporters ist eine Herausforderung. Da der Umsatz von Transportern ist gering ein &quot;Riesen-Patch&quot; oder eine &quot;ganze Zelle &#39;Konfiguration erforderlich, die eine inhärent geringen Zeitauflösung in einer Lösung Austauschexperiment haben. Die Komplikation überwinden kann mit Substrat photolytische Freisetzung werden. Es sind jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Substraten für diesen Ansatz geeignet. Hier ist die schnelle Lösung Austausch am SSM bietet die einmalige Gelegenheit, elektrophysiologische Untersuchungen mit hoher zeitlicher Auflösung mit beliebigen Substraten durchzuführen. 2. Einschränkungen und kritischen Schritte Im Gegensatz zu den Patch-Clamp-und Spannungs-Clamp-Techniken, kann SSM-basierte Elektrophysiologie nicht verwendet, um eine mögliche anzuwenden. Transporter Charakterisierung ist daher beschränkt auf Modi, die nicht auf einer Membran Potenzial sehen verlassen transportieren. Im Allgemeinen hat SSM-basierte Elektrophysiologie keine Einschränkungen hinsichtlich der Art des (elektrogenen) Transporter. Aber Spannung clVerstärker oder Patch-Clamp-Verfahren können haben Vorteile, wenn intrazelluläre Komponenten wie Proteine ​​für die Protein-Funktionalität erforderlich sind. Einschränkungen können entstehen, wenn Lösung Austausch schafft große Artefakt Ströme. Dies geschieht, wenn das Substrat starke Wechselwirkung mit dem SSM wie in dem Fall von lipophilen Verbindungen. Artifact Steuerelemente können verwendet werden, um die gemessenen Signale zu korrigieren. Außerdem hohen Salz Hintergrund in allen Messen Puffer können verwendet werden, um die Artefakte zu reduzieren. Aber in den Fällen, in denen die Größe des Artefakts vergleichbar mit dem Signal-Protein ist, ist es fast unmöglich, die Protein-bezogenes Signal aus dem Artefakt zu isolieren. Glücklicherweise sind die hohen Artefakte in einer optimierten Lösung Austausch ungewöhnlich. Es gibt ein paar Schritte, die entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung eines SSM-basierte Elektrophysiologie Experiment sind. Die Herstellung der Proteinprobe ist der wichtigste Teil. Wenn Proteoliposomen verwendet werden, sicher sein, die reconstitution Prozess liefert eine saubere, reproduzierbare Probe einer ausreichenden LPR und der Transporter orientiert in der richtigen Weise. Die LPR kann durch Gefrierbruch Elektronenmikroskopie und Orientierung durch einen ELISA-Experiment überprüft werden, ob Antikörper vorhanden sind. Verwenden Sie nur eine SSM die optimalen Parameter zeigt für Inkubation des Proteins Probe. Die Injektion des Proteins ist ein weiterer kritischer Schritt. Beschallung ist unerlässlich und Luftblasen sollten während der Injektion vermieden werden. Nach der Inkubation werden die Proben Messungen selbst kritisch, da Luftblasen das adsorbierte Protein Probe aus dem Sensor-Chip zu entfernen. Daher ist immer zu entfernen Luftblasen nach dem Wechsel Lösungen. Dennoch ein Signal heruntergekommenen auftreten können. Um eine mögliche Signal heruntergekommenen korrigieren, ist es wichtig, heruntergekommenen Kontrollen während des Experiments zu erreichen. 3. Specialized Systems Die SSM-Setup kann nach seiner Anwendung geändert werden. Darüber thier sind völlig verschieden, hoch spezialisierte Setups zur Verfügung. Es besteht die Möglichkeit, um Protein-Signale unter asymmetrischen Bedingungen, unter einem pH-Gradienten zB messen. Um asymmetrische Pufferzusammensetzungen innerhalb und außerhalb der Proteoliposomen einer dritten Lösung zu schaffen, die ruhenden Lösung, muss eingeführt werden und dies erfordert eine doppelte Austausch Konfiguration. Hier wird ein zusätzliches Drei-Wege-Ventil Umschalten zwischen nicht aktivierenden und ruhenden Lösungen erforderlich. Um die zeitliche Auflösung des Systems entwickelten wir eine alternative Strömungsweg fehlt das Terminal Ventil, aber mit einer anderen Art der Küvette zu erhöhen. Hier ist der Übergang des Aktivierungs-und nicht-aktivierenden Lösung innerhalb der Küvette, 3 mm vor der SSM. Dieses Setup ist gut für die kinetische Analyse von schnellen Transportprozesse geeignet. Es konnte gezeigt werden, dass eine zeitliche Auflösung von nur 2 ms möglich ist. Kommerzielle fully automatisierte Systeme sind mit dem Ziel einer deutlich höheren Durchsatz für Wirkstoff-Screening. Eine bewegliche Einheit sammelt Lösungen und spritzt diese auf die Sensorfläche in 96-Well-Platten in einer Standard-Mikrotiterplatten-Format.

Hier zeigen wir eine neue elektrophysiologische Ansatz auf einem festen Träger Membran (SSM) für die Charakterisierung von Membranproteinen elektrogenen basiert. Der feste Träger aus einer dünnen Goldschicht auf einem Glasträger, wobei der Sensor-Chip. Die hydrophile Goldoberfläche wird die Thiolgruppe eines alcanethiol Reagenz zu binden. Danach schließt Selbstmontage einer Phosphatidylcholin monolyer die Bildung der SSM. Um elektrogenen Reaktionen von Membranproteinen zu messen, werden Proteoliposomen oder Membranfragmente der SSM (Abbildung 1) adsorbiert. Die Protein enthaltenden Membran und die SSM bilden dann einen kapazitiv gekoppelten Membransystem. Daher kann Ladung Translokation an der Protein enthaltenden Membran durch kapazitive Kopplung über den SSM detektiert werden. Diese Methode liefert nur transienten Strömen. Der Spitzenstrom stellt den stationären Transport-Aktivität. Die zeitabhängige Transporter currents kann durch die Schaltung Analyse rekonstruiert werden. Der Sensor-Chip in eine Küvette (Abbildung 2) angebracht ist. Die Küvette weist eine zylindrische Küvette Volumen von 17 ul (Nettovolumen mit O-Ring montiert). Federkontaktstift schafft den Kontakt mit dem Verstärker. Ein Auslass-Anschluss an der Oberseite des Hauptteils angeschraubt und führt die Bezugselektrode, ein chlorierter Silberdraht. Die Küvette wird in einem Faradayschen Käfig montiert. Es ist mit einer Fluidleitung, die verwendet werden, um den Transport Aktivität des Membran-Protein in Reaktion auf eine schnelle Lösung Vermittlungsstelle (3) induziert ist. In der einzigen Lösung Austauschprotokoll beiden Lösungen werden eine nicht-aktivierende und eine aktivierende Lösung erforderlich. Die Strömung wird durch Druckluft über eine Steuerungssoftware auf einem Computer oder Handschalter auf einem Interface-Box gesteuert.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Waterbath Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>RK 52 H</td><td></td></tr><tr><td>Tip Sonicator</td><td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>2-Wege-Ventil</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T011</td><td></td></tr><tr><td>Endventil</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T031</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>Greisinger electronics</td><td>GDH 14 AN</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>Max-Planck-Institut für Biophysik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küvette</td><td>Max-Planck-Institut für Biophysik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml Lösungsbehälter</td><td>Kartell</td><td>1623</td><td></td></tr><tr><td>O-Ringe</td><td>Seal Science Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS 1002</td><td></td></tr><tr><td>Referenzelektrode</td><td>Max-Planck-Institut für Biophysik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Max-Planck-Institut für Biophysik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schläuche</td><td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td><td>AAC00006</td><td></td></tr><tr><td>Sensorchip</td><td>Fraunhofer Institut f&#252; r Schicht und Oberfl&#228; chentechnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interface box</td><td>Max-Planck-Institut für Biophysik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Keithley</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>Bedienungsanleitung</td><td>Ritzel Vygon GmbH</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>USB Analog-Digital-Wandler</td><td>National Instruments</td><td>6009<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Regeants</td></tr><tr><td>1,2&#8209; Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>850356</tr><tr><td>Acrylamid/Bis-acrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3574</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose </td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol </td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR AnalaR NORMAPUR</td><td>603-002-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Natur E. coli Lipide Polar</td><td>Extrakt Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>100600</td><td>für LacY-Rekonstitution</td></tr><tr><td>n-Decan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>Octadecanthiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858</td><td></td></tr><tr><td>Octadecylamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74750</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin</td><td>BIO RAD</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Lactose Monohydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8783</td><td></td></tr></tbody></table>

einführung in die festkörperphysik unterstützte membrane basierend elektrophysiologie

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

Die elektrophysiologischen Verfahren präsentieren wir auf einer festen Membran unterstützt (SSM) eines Octadecanthiol Schicht auf einem mit Gold beschichteten Sensorchip und einem Phosphatidylcholin Monoschicht auf chemisorbierten komponiert wurde. Diese Anordnung wird in eine Küvette, enthaltend die Bezugselektrode, ein chlorierter Silberdraht befestigt. Nach der Adsorption von Membranfragmente oder Proteoliposomen mit dem Membranprotein von Interesse, ist eine schnelle Lösung Austausch verwendet werden, um den Transport Aktivität des Membranprotein zu induzieren. In der einzigen Lösung Austauschprotokoll beiden Lösungen werden eine nicht-aktivierende und eine aktivierende Lösung benötigt. Die Strömung wird durch Druckluft und ein Ventil und Schlauchsystem in einem Faraday-Käfig gesteuert. Die Kinetik der elektrogenen Transportaktivität wird über eine kapazitive Kopplung zwischen der SSM und die Proteoliposomen oder Membranfragmente erhalten. Das Verfahren wird daher ergibt nur transient Ströme. Der Spitzenstrom stellt den stationären Transport-Aktivität. Die zeitabhängige Transporter Ströme können durch die Schaltung Analyse rekonstruiert werden. Diese Methode ist besonders für prokaryotische oder eukaryotische Transporter Transporter von intrazellulärer Membranen, die nicht durch Patch-Clamp-oder Spannungsbegrenzer Methoden untersucht werden kann geeignet.

Bis jetzt wurde SSM-basierte Elektrophysiologie verwendet, um mehr als 20 Transporter, meist von prokaryotischen Ursprungs, z. B. MelB 3, 4 und NhaA PutP 5 (zusammengefasst in 6) zu charakterisieren. Aber auch eukaryotischen Transporter aus intrazellulären Membranen, z. B. ClC7 7 sowie Ionenkanäle, wie zB die Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor-8 untersucht wurden. Hier präsentieren wir als Beispiel Messungen der Zucker / H + cotransporter LacY von Escherichia coli mit Proteoliposomen mit mindestens 85% auf rechts orientierte LacY an einem LPR von 5 9, 10. Wir konzentrieren uns auf die wichtigsten Schritte, die zu einem minimalen kinetischen Modells dieses Transportprotein. 1. Elektrophysiologische Charakterisierung von Wildtyp LacY Der erste Schritt ist eine allgemeine Charakterisierung der elektrogenen Reaktion durch Messen der verschiedenen pH-Werten ( <strong<html> &gt; Abbildung 4), Substrat-Konzentrationen (Abbildung 5) und Substraten. Um die Technik zu validieren, wurden K M und pK-Werte in der Literatur gegeben reproduziert. Die pH-Abhängigkeit der LacY zeigt zwei verschiedene elektrogenen Reaktionen. Die kapazitiv gekoppelte Strom steigt zwischen pH 5 und pH 8,5, sondern auch ihre Form ändert. Unter alkalischen Bedingungen steady state Transport beobachtet wird, während für sauren pH-Werten nur eine schnelle Reaktion elektrogenen bleibt. Um die Steady-State-Signale von den Reaktionen, die wir schnell elektrogenen verwendet Schaltung Analyse Transporter Ströme (Abbildung 6) rekonstruieren zu unterscheiden. Bei pH 7 ist der einphasige Signal wird zweiphasigen. Dies zeigt auch, dass es zwei verschiedene elektrogene Reaktionen. Geschätzte aus der übertragenen Ladung (Integral der Signale), die beiden Reaktionen etwa 6% und 94% des gesamten electrogenicity des Transportzyklus. ove_step &quot;&gt; 2. Zuordnung der elektrogenen Reaktionen Um die beiden elektrogenen Reaktionen auf bestimmte Schritte in der Reaktion Zyklus LacY zuzuweisen, wurde die Variante E325A LacY gemessen (Abbildung 7). Diese Variante zeigt nur Lactose Austausch, sondern ist mangelhaft für alle aktiven Verkehrsträger aufgrund der Hemmung der Protonen-Release. Das Signal des E325A LacY stellt eine schnelle transiente und ist konstant für alle gemessenen pH-Werten. Die Form und die Amplitude des Signals ist ähnlich dem Signal des Wildtyp LacY unter sauren Bedingungen. Darüber hinaus beobachten wir eine kleine negative Phase nach der rückläufigen Spitzenstrom, die charakteristisch für die schnelle transiente Ströme in kapazitiv gekoppelten Systemen gemessen wird. Da Laktose Bindung und Freisetzung ist nicht elektrogenen, muss die schnelle transiente mit einem elektrogenen Konformationsübergang nach Laktose Bindung korrelieren. Es ist bekannt, dass das Proton Release Schrittgeschwindigkeit limiti istng für LacY Umsatz in der Lactose Konzentrationsgradienten angetriebene Verkehrsmittel. In diesem Fall erwarten wir eine Erhöhung der Transportgeschwindigkeit mit alkalischer pH-Wert, weil Protonenabgabe begünstigt wird. Dies ist der Fall für den stationären Transport korreliert Signal von Wildtyp LacY. Darüber hinaus könnte es durch pH-Gradienten Messung gezeigt werden, dass nur der innere pH-Wert des stationären Transport LacY (unveröffentlicht) beeinflusst. Daher die große elektrogenen Reaktion könnte zur Protonenabgabe Schritt zugeordnet werden. 3. Messungen für die kinetische Analyse Nach Identifizierung der elektrogenen Reaktionen und Ausschalten Frachten wurden unter Verwendung eines SSM-Setup mit einer hohen zeitlichen Auflösung von etwa 4,5 ms. Dies ist nur unter Bedingungen möglich, wenn eine Reaktion dominiert das Signal. In diesem Fall sind die Geschwindigkeitskonstanten aus den transienten Strömen unter Berücksichtigung der zeitlichen Auflösung der Signale mit Hilfe eines iterativen Least-Squares-de abgeleitet werden<html> Faltungsalgorithmus (Abbildung 8). Die ermittelten Geschwindigkeitskonstanten sowie die vorgeschlagene minimale kinetische Modell (Abbildung 9) wurden schließlich für die Simulation der Kinetik Transporter verwendet. Die simulierten Kurven geben die Daten, die zusätzlich SSM beweist die kinetischen Modells. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Adsorption Geometrie Proteoliposomen auf der SSM. Die SSM auf einem Sensorchip, eine strukturierte Gold beschichteten Objektträger ausgebildet ist. Um elektrogene Reaktionen von Membranproteinen zu messen, werden Proteoliposomen oder Membranfragmente an die SSM adsorbiert. Die beiden Membranen bilden ein kapazitiv gekoppeltes System. Deshalb ist nur transienten Strömen erfasst werden. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Die SSM Küvette trägt den Sensorchip und die Referenzelektrode. Der Sensorchip zwischen dem Gefäßboden und dem Kopf Küvette eingeklemmt. Die Referenzelektrode ist der Strömungsweg von einem Polyacrylamidgel Salzbrücke isoliert. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> Abbildung 3. Fluidbahn und Stromkreis des SSM-Setup. In der einzigen Lösung Exchange-Protokoll nur eine nicht-aktivierenden (NA) und eine aktivierende (A)-Lösung erforderlich sind. Der Durchfluss wird durch zwei 2-Wege-Ventile (V1) und ein Anschluss-Ventil (V2) gesteuert wird. Die terminalen Ventil schaltet zwischen nicht-aktivierenden und aktivierenden Lösungen, Leiten einer der Lösungen in die Küvette und die andere Lösung zu einem Abfallbehälter (W). Der Sensor-Chip (SSM) an den Verstärker (I / U) verbunden ist,<html> während die Bezugselektrode (AgCl) mit dem Funktionsgenerator (F) in der externen elektrischen Schaltung verbunden. Ein Computer (PC) und eine Interface-Box für Ventilbetrieb-und-Datenerfassungs verwendet. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="Fig. 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> Abbildung 4. Ausgleichsströme mit Wildtyp-LacY Proteoliposomen nach 100 mM Lactose Konzentrationssprünge bei unterschiedlichen pH-Werte gemessen. Die nicht-aktivierende Lösung enthielt 100 mM Glucose während der aktivierenden Lösung enthielt 100 mM Lactose. Alle Lösungen wurden in 100 mM Kaliumphosphatpuffer bei dem angegebenen pH-Wert mit 1 mM DTT hergestellt. Einzelheiten Messbedingungen in dieser und den folgenden Zahlen entnehmen Sie bitte 9 und 10. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Gemittelten normierten Peak-Ströme mit Wildtyp-LacY Proteoliposomen nach Lactosekonzentration Sprünge in verschiedenen Konzentrationen und pH-Werte gemessen. Die K M-Werte aus den hyperbolischen fits erhalten. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="Abbildung 6" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> Abbildung 6. Rekonstruktion der Transporter Ströme. Die transienten Ströme (A) verwendet, um die Transporter Ströme (B) zu rekonstruieren wurden mit Wildtyp-LacY Proteoliposomen nach 100 mM Lactosekonzentration springt bei pH 8,5 (blaue Kurve) und pH 5.2 (rote Kurve) gemessen. Bei pH 8,5 kontinuierlichen Umsatz wird beobachtet, während bei pH 5,2 eine schnelle elektrogenen Reaktion auftritt. Dies wird in dem rekonstruierten aktuellen (B) beobachtet. files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;alt =&quot; 7 &quot;fo: content-width =&quot; 4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 7. Transient Strom mit E325A LacY Proteoliposomen nach einer 100 mM Lactosekonzentration Sprung bei pH 5,2 gemessen. Dieser LacY Variante ist in der Protonenabgabe Schritt des Transports Zyklus gehemmt und somit Transport-defizienten. Die kleine negative Komponente beobachtet ist charakteristisch für schnelle transiente Ströme in kapazitiv gekoppelten Systemen gemessen und durch die Entlastung der Membran Kapazität nach einer schnellen elektrogene Reaktion verursacht. Die Zeitkonstante π0 wird durch die Kapazitäten und Leitwerte des Systems (1) bestimmt. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="Fig. 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> Abbildung 8. Ausgleichsströme mit Wildtyp-LacY Proteoliposomen gemessen after verschiedene Lactosekonzentration springt bei pH 5,2. Unter diesen Bedingungen keine stationären Transport beobachtet wird, sondern ein elektrogenen Konformationsübergangs Laktose bindend. Die gestrichelte Linie zeigt die Übertragungsfunktion, die die zeitliche Auflösung des Systems. Der Einschub zeigt die Bestimmung der ein-und ausschalten Geschwindigkeitskonstanten aus den beobachteten Geschwindigkeitskonstante kobs mit einer hyperbolischen Anpassung an die Daten. Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante wurde aus den transienten Strömen mit einem iterativen Least-Squares-Dekonvolutionsalgorithmus 10 bestimmt. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="Abbildung 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> Abbildung 9. Ein kinetisches Modell für die Reaktion Zyklus LacY. Elektrogenen Zwei Schritte könnten identifiziert und gekennzeichnet durch SSM-Messungen. Ein stark elektrogene Reaktion darstellt ~ 94% der Ladungsverschiebung in der ReaktionZyklus nur an neutralen und basischen pH-Werten beobachtet. Es könnte zum Proton Release Schritt (blauer Pfeil) zugeordnet werden. Ein schwach elektrogenen Schritt bei einem sauren pH-Wert beobachtet, wenn eine kontinuierliche Umsatz von Wildtyp-LacY gehemmt wird. Wir zugeordnet diese Reaktion zu einer elektrogenen Konformationsübergangs Lactose Bindung, die 6% der Ladungsverschiebung in der Reaktion Zyklus darstellt.

Hier präsentieren wir Ihnen eine elektrophysiologische Verfahren auf festen unterstützt Membranen mit Fokus auf ihre Anwendungen für die Charakterisierung von elektrogenen Membrantransportern basiert.

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

So wird die auf unterstützten Membranen basierende Elektrophysiologie, abgekürzt zu SSM-basierter Elektrophysiologie. Es handelt sich um einen neuen elektrophysiologischen Ansatz, der für eine Reihe von Anwendungen eine erhebliche Verbesserung im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden bietet.Das zentrale Werkzeug der herkömmlichen Elektrophysiologie ist die mit Elektrolyt gefüllte Mikropartikelelektrode, während die M-basierte Elektrophysiologie Ladungsverschiebungen über eine festphasenunterstützte Membranelektrode nachweist. Sie ist äußerst nützlich in Fällen, in denen die herkömmliche Elektrophysiologie nicht angewendet werden kann, beispielsweise bei bakteriellen Transportproteinen, die – abgesehen von wenigen seltenen Ausnahmen – nicht mit der Spannungs-Clamp- oder Patch-Clamp-Methode untersucht werden können. In solchen Fällen hat sich die SSM-basierte Elektrophysiologie als sehr erfolgreich erwiesen.Es kann auch zur Untersuchung physiologisch relevanter eukaryotischer Transporter in intrazellulären Membranen eingesetzt werden. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, elektrophysiologische Experimente mit der SSM-Methode durchzuführen. In der Grundlagenforschung kann sie zur Bestimmung kinetischer Parameter und zur Aufklärung des Transportmechanismus angewendet werden, doch ihre Robustheit und Automatisierungsfähigkeit machen sie ideal für Screening-Anwendungen in der Wirkstoffforschung.Die SSM-Elektrode trägt ein zusammengesetztes Membransystem, das aus der zugrundeliegenden SSM und den aufgenommenen Proteasomen oder Membranfragmenten mit Ihrem Transportprotein der Wahl besteht. Die elektrischen Eigenschaften des zusammengesetzten Membransystems können durch eine Ersatzschaltung beschrieben werden, bei der die Membranen ein kapazitiv gekoppeltes System bilden. Beachten Sie, dass das elektrische Verhalten des Systems im Wesentlichen gleich ist, unabhängig davon, ob Membranfragmente oder Protea-Liposomen verwendet werden.Die Ladungsverschiebung im Transportprotein wird über die Kapazität der Blasenmembran an die Messschaltung weitergeleitet. Ein Detektionsprinzip, das als kapazitive Kopplung bezeichnet wird. In einem typischen Experiment liefert der schnelle Lösungsaustausch am VSSM das Substrat für das Transportprotein V; die daraus resultierende elektrogenen Transportaktivität des Proteins erzeugt einen Strom, der kapazitiv über die SSM-Kapazität an das Messsystem gekoppelt wird.Gleichzeitig lädt die elektrogene Proteintätigkeit schrittweise die liposomale Membran auf, was zur Hemmung des Transportproteins und einem abnehmenden Strom im Aufnahmekreis führt. Der gemessene Strom resultiert aus simultanen Transportsreaktionen von Millionen proteahaltiger Liposomen, die an das Enzo adsorbiert sind, wobei jedes etwa 100 Transporter enthält. Der Aufbau besteht aus einer Faraday-Käfiganordnung mit einem Lösungsweg, externen Schaltkreisen zur Ventilsteuerung, Signalverstärkung sowie Datenerfassung und -analyse.Der EC-Käfig umfasst Behälter, Ventile und Schläuche zur Steuerung des Lösungsdurchflusses sowie einen Cubit mit einem XOR-Chip. Der XOR-Chip trägt die SSM-Elektrode und die adsorbierten Proteoliposomen. Die Vete ist mit dem Verstärker und dem Funktionsgenerator des externen elektrischen Schaltkreises verbunden.SSM-Messungen, erzeugen Feuer, zwei Lösungen, eine aktivierende und eine nicht aktivierende neben dem Substrat, das nur in der aktivierenden Lösung vorhanden ist. Beide Lösungen haben die gleiche Zusammensetzung in der Einzelaustauschkonfiguration. Zwei Zwei-Wege-Ventile steuern den Fluss der nicht reaktivierenden und der aktivierenden Lösung.Das Endventil, ein mechanisch gekoppeltes 3×3-Wegeventil, wird verwendet, um zwischen der nicht aktivierenden und der aktivierenden Lösung umzuschalten, wobei eine der Lösungen in den Abfallbehälter und die andere Lösung zur qve geleitet wird. Wenn das Endventil umgeschaltet wird, wird der Fluss der nicht aktivierenden Lösung in den Abfall umgeleitet und die aktivierende Lösung strömt zur qve. Diese Konfiguration ermöglicht einen gleichzeitigen kontinuierlichen Fluss beider Lösungen. Zu jedem Zeitpunkt während des Flussprotokolls kann der Flussweg je nach Bedarf optimiert werden. Allerdings muss beachtet werden, dass der Abstand zwischen der SSM und der Verbindungsstelle der nicht aktivierenden und der aktivierenden Lösungen so kurz wie möglich gehalten werden sollte, da er die Zeitspanne des Lösungsaustauschs bestimmt.Der Stromverstärker außerhalb des Abschirmgehäuses der Leistungseinheit ist mit einem Sensorchip verbunden. Typischerweise wird eine Verstärkung von 10 hoch acht bis 10 hoch neun Volt pro Ampere und eine Ruhezeit von ein bis zehn Millisekunden eingestellt. Ein Funktionsgenerator ist an die Referenzelektrode angeschlossen, und ein Computer mit Ventilsteuerungs- und Datenerfassungssoftware sowie eine Interface-Box vervollständigen das System.Die Schnittstellenbox enthält die Ventilansteuerung, Datenerfassung und die Hardwarelösung für digitale Ausgänge; der Fluss wird durch Druckluft mit einem Druck von 0,22 bar aufrechterhalten. Ein Druck von einem Bar wird mithilfe eines digitalen Manometers überwacht. Er kann durch Befüllen eines Stahlbehälters, der über ein Nadelventil zwischen der Luftzufuhr und den Lösungsmittelbehältern im EC-Cage installiert ist, aufrechterhalten werden.Der CVIC besteht aus vier Teilen. Der Zen-Chip ist zwischen der Vet-Basis und dem Vet-Kopf eingeschlossen. Ein zylindrischer Auslassanschluss ist mit dem Vet-Kopf verschraubt und trägt die Referenzelektrodenanordnung.Die Referenzelektrode besteht aus einem chlorierten Silberdraht mit einem Miniatur-SMC-Stecker und ist durch eine Polyacryl-Gel-Salzbrücke von der Durchflussstrecke isoliert. Wenn die Elektrode nicht verwendet wird, wird die Gelbrückenbaugruppe in einer 100 Millimolar Kaliumphosphat-pH-7-Lösung aufbewahrt, die 100 Millimolar Kaliumchlorid enthält. Zunächst muss die Referenzelektrode in die Referenzelektrodenbaugruppe eingebaut werden, die die Gelbrücke enthält.Es ist wichtig, Luftblasen zu vermeiden, während die Referenzelektrode installiert wird. Nun wird dieser Teil der Vete mit dem Auslassanschluss verbunden, der bereits mit Pufferlösung vorgefüllt wurde. Alle Verbindungen müssen mit O-Ringen abgedichtet werden.Dieses SM wird auf einem Zor-Chip gebildet, einem strukturierten Ziegenbeschichteten Glaslicht. Diese sematische Leiterbahn ist einen Millimeter breit und hat einen Durchmesser und ist über einen 0,2-Millimeter-breiten weißen Kontaktstreifen mit dem Kontaktfeld verbunden. Ein Federkontaktstift stellt die Verbindung zum Verstärker her.Der Zen-Chip wird im Dunkeln in einer 10 LAR Okta-Deccan-Thiol-Ethanol-Lösung aufbewahrt. Um die arkane Thi-Schicht aufrechtzuerhalten und die Okta-Deccan-Virusmoleküle, die nicht absorbiert wurden, zu entfernen, wird die Elektrode mit reinem Ethanol gespült und anschließend in Stickstoffgas getrocknet. Nun kann die Phosphocholin-Monoschicht aufgebaut werden.Die Lipidlösung enthält 15 Milligramm pro Milliliter DFI-Cholin und 250 Mikrogramm pro Milliliter Okta zwei A-Min in Deca und wird bei minus 20 Grad gelagert. Die Elektrode wird nun genau auf der Basis des SA-Cubits platziert.Ein Mikroliter der Lösung wird zur SSM-Elektrode hinzugefügt, ohne die Goldschicht zu berühren. Unmittelbar nach dem Hinzufügen der Lipidlösung kann die vete montiert werden. Das von einem O-Ring abgedichtete vete-Volumen ist zylindrisch und weist ein inneres Volumen von 17 Mikroliter auf, wenn es montiert ist.Der SSM sollte mittig unter der Einlassbohrung positioniert sein. Vor dem Anschließen des Vet muss das Flüssigkeitssystem mit einer 100 Millimolar Kaliumphosphatpufferlösung vorgefüllt werden. Es ist wichtig sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Schläuchen und Ventilen befinden.Nun kann der Vet in den Schilddrüsentageskäfig eingebaut, der Verstärker sowie der Einlass und Auslass des Lösungsflusswegs und der Funktionsgenerator angeschlossen werden. Abschließend kann der Cubit mit einem 100 Millimeter Kaliumphosphatpuffer gespült werden. Dies führt zur spontanen SSM-Bildung, um die Qualität des SSM zu überprüfen.Kapazität und Leitfähigkeit werden mithilfe des Funktionsgenerators gemessen, wobei eine Gleichspannung von 100 Millivolt verwendet wird. Der Stromabfall zeigt das Aufladen des Membrankondensators an, nachdem der Kondensator vollständig geladen ist. Der gemessene Strom ergibt die Membranleitfähigkeit unter Anwendung des Ohmschen Gesetzes.Hier beobachten wir eine Leitfähigkeit von 0,17 Nano-Siemens. Die Kapazität kann mit einer dreieckförmigen Wechselspannung von 50 Millivolt Spitze-zu-Spitze-Amplitude und einer Frequenz von 0,5 Hertz gemessen werden. Die Amplitude des resultierenden Rechteckstroms stellt den Beurteilungsstrom des Kondensators dar.Die Kapazität entspricht der übertragenen Ladung dividiert durch die angelegte Spannung. Diese Membran weist eine Kapazität von 2,3 Nano auf, eine hohe Leitfähigkeit und eine niedrige Kapazität deuten darauf hin, dass die SSM nicht korrekt gebildet ist. In diesen Fällen sollte die Membran verworfen und eine neue SSM unter Verwendung eines neuen Elektrodenchips hergestellt werden.Prototyp-Liposomen werden normalerweise bei Minus 80 eingefroren gelagert. TRE th die Probe auf Eis zu sonifizieren, ist entscheidend, da eine aggregierte Probe Sehne am SSM absorbiert, um eine homogene Prototyp-Liposomen-Suspension zu erhalten. Drei zehnsekündige Sonifikationszyklen werden abwechselnd mit zehnsekündigen Kühlphasen auf Eis durchgeführt.Spülen Sie das SSM mit einer nicht aktivierenden Lösung. Dann schrauben Sie den Auslassanschluss zusammen mit der Referenzelektrodenprobe ab. Injizieren Sie mithilfe einer Pipette 30 Mikroliter der Proteinstichprobe durch den Auslass des Vete in das Ette-Volumen.Befestigen Sie zuerst die Pipettenspitze am Auslassbohrloch. Öffnen Sie dann das manuelle Gerät oben im nicht aktivierenden Weg und injizieren Sie die Protealiposomen. Vor dem Entfernen der Pipettenspitze.Schließen Sie die manuelle Steuerung oben, um einen weiteren Lösungsfluss zu verhindern. Lassen Sie die Protea-Liposomen für eine Inkubationszeit von einer bis zwei Stunden an die SSM adsorbieren. Verwenden Sie das Flussprotokoll-Fenster der Ventilsteuerungs- und Datenerfassungssoftware, um Ihr Flussprotokoll festzulegen.Wenn Sie unter symmetrischen Bedingungen messen möchten, beispielsweise zur Bestimmung der Substratspezifität, des KM-Werts oder der pH-Abhängigkeit, wählen Sie das Protokoll für den Einzel-Lösungsaustausch. Stellen Sie die Flussdauer für jede Lösung auf 0,5 bis eine Sekunde ein. Der Strom wird während des gesamten Flussprotokolls aufgezeichnet.Die Verstärkung wird typischerweise auf 10 hoch neun eingestellt, und für die Abtastrate wählen wir 2000 Datenpunkte pro Sekunde. Speichern Sie abschließend Ihr neues Protokoll unter dem Titel NA a und a. Auf der zweiten Registerkarte des Durchflussprotokoll-Fensters können Sie den geöffneten oder geschlossenen Zustand bestimmter Ventile definieren, um den Durchfluss von nicht aktivierender oder aktivierender Lösung durch Qubit zu steuern.Hier zeigen wir die Messung von Protea-Liposomen, dem zuckerabhängigen Protonenimport wie Y aus E. coli. Die aktivierende Lösung enthält das transportierte Substrat Lactose, während die nicht aktivierende Lösung die gleiche Menge des nicht transportierten Glucose als Ausgleichsverbindung enthält. Zusätzlich zu den Zuckern enthalten die Lösungen 100 Millimolar Kaliumphosphat bei pH 7,6 und ein Millimolar DTT.Nach dem Wechseln der Lösungen verwenden Sie das manuelle Ventil, um sicherzustellen, dass Luftblasen entfernt werden. Stellen Sie den Druck kurz vor Beginn der Messung ein, bevor Sie ein Durchflussprotokoll starten. Üblicherweise verwenden wir einen Druck von 0,6 bar, der bei unserer spezifischen Ventil- und Schlauchkonfiguration eine Durchflussgeschwindigkeit von etwa einem Milliliter pro Sekunde ergibt.Danach hier ein sicheres Fluss-Protokoll auswählen, das NAA-Protokoll, und die Starttaste drücken, um jede Messung zu beginnen. Während der ersten Messungen werden locker gebundene Protea-Liposomen entfernt, weshalb der Spitzenstrom abnehmen kann. Die Messung wiederholen, bis der Spitzenstrom konstant bleibt.Während der ersten Phase des Durchflusses der nicht aktivierenden Lösung beträgt der Strom null. Der Austausch von der nicht aktivierenden zur aktivierenden Lösung, die Lactose enthält, induziert die elektrogenen Transportaktivität der Membran. Positive Ladungen des Proteins sammeln sich im Inneren der Proteoliposomen an, und der Verstärker detektiert einen positiven transienten Strom aufgrund einer positiven Kopplung über das SSM.Dieser positive, positiv gekoppelte Strom wird als Einschalt-Signal V-Austausch aus der aktivierenden Lösung bezeichnet. Die Rückkehr zur nicht aktivierenden Lösung induziert den Protonenzucker-Transportcode aus den Liposomen heraus. In diesem Fall wird ein negativer, LY-gekoppelter Strom angezeigt, das sogenannte Ausschalt-Signal für die proteinkinetische Analyse.Nur das Eins-Signal wird verwendet, da das Aussignal aufgrund des Ladungszustands, den der Schaltvorgang des Membranventils erzeugt, schlecht definiert ist und mechanische sowie elektrische Artefakte verursacht. Glücklicherweise beschränken sich diese auf einen Zeitbereich vor dem Auftreten der proteininduzierten Signale. Beachten Sie, dass die 50 Millisekunden Verzögerung zwischen den durch das Ventilschalten verursachten Artefakten und den Transportsignalen die Zeit angibt, die die Lösung benötigt, um sich vom Endventil bis zur Oberfläche des SSM auszubreiten. Eine solche schnelle Lösungsumspülung, wie sie am SSM durchgeführt wird, stellt einen typischen Relaxationsversuch dar.Bei solchen Experimenten relaxiert der Strom über eine zeitabhängige, vor der stationären Phase liegende Vorzustandsphase in einen konstanten stationären Zustand. Kinetische Details des Reaktionszyklus können aus der Form und der Größe des Vorzustandsstroms abgeleitet werden. Während der stationäre Strom Aufschluss über die kontinuierliche Umsatzrate des Membranproteins gibt.In dem lose gekoppelten System, bei dem Protea-Liposomen an ihren SSM adsorbiert sind, sind die vorherigen stationären Ströme praktisch unverändert. Während ein konstanter stationärer Strom niemals erreicht wird, nimmt der gemessene Strom aufgrund der Aufladung der Liposomen allmählich ab. Der Transportstrom kann aus dem gemessenen lose gekoppelten Strom mittels Schaltungsanalyse berechnet werden.Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse unter Verwendung des Zucker-Protonen-Cotransporters, wie Y, im pH-Bereich zwischen 8,5 und 7,6. Der Transportstrom wird durch eine elektrogenische Reaktion in einem späten Stadium des Reaktionszyklus dominiert. Unter diesen Bedingungen besteht die vorgeschaltete stationäre Phase aus einem einfachen Anstieg des Stroms bis zu seinem stationären Wert.Dieser zerfällt dann aufgrund kapazitiver Kopplung. Von Interesse ist der stationäre Transportstrom. In Abwesenheit eines Membranpotentials wird dieser durch den Spitzenstrom hinreichend gut approximiert.Die Ali Mein-Kinetik kann daher analysiert werden, indem die Spitzeströme für verschiedene Substratkonzentrationen aufgetragen werden. Beachten Sie jedoch, dass Spitzestromamplituden nur dann streng miteinander verglichen werden können, wenn sie aus einem einzelnen Sensor innerhalb eines Experiments stammen. Ein Grund hierfür ist die Variabilität der Absorptionseffizienz. Wenn der pH-Wert weiter gesenkt wird, verwandelt sich das monophasische Signal in ein biphasisches.Und schließlich bleibt ein schneller transiente für den transportdefizienten lag-Y-Mutanten bestehen. Dem schnellen Transienten folgt eine kleine, langsamere negative Komponente. Die negative Komponente ist charakteristisch für schnelle Transientenströme, die in ly-gekoppelten Systemen gemessen werden, und wird durch die Entladung der Membrankapazität verursacht.Hier repräsentiert der Spitzenstrom keinen stationären Transport, sondern vielmehr eine elektrogenische Bestätigung eines frühen Übergangs im Ionenzyklus. Dies wird deutlich, da ein lagY-Mutant keinen stationären Transport zeigt und beim Wildtyp lagY der stationäre Transport durch einen niedrigen pH-Wert gehemmt wird. Die experimentellen Befunde liefern eine mechanistische Interpretation der Ladungstranslokation im Reaktionszyklus von lagY, wie sie im kinetischen Modell dargestellt ist. Die schnelle transiente Erscheinung, die beim transportdefizienten Mutanten beobachtet wird oder im Fall des Wildtyps lagY unter sauren Bedingungen, beruht auf einer schnellen, wöchentlich elektrogenen Reaktion nach Lactosbindung bei höheren pH-Werten. Bei höheren pH-Werten wird das Signal dominiert durch die Hauptreaktion, eine späte elektrogene Reaktion im Reaktionszyklus, die als pseudo-plasmische Protonenfreisetzung in einem kapazitiv gekoppelten System vorgeschlagen wurde.Dies führt zu transienten Strömen, die den stationären Transport von Lag y aufgrund der starken Wechselwirkung der Utes darstellen. Bei Verwendung der SSM entstehen elektrische Artefakte, wenn Lösungen unterschiedlicher Zusammensetzung ausgetauscht werden. Stellen Sie sicher, dass nichtaktivierende und aktivierende Lösungen bezüglich ihres pH-Werts und ihrer ionischen Stärken so ähnlich wie möglich sind.Die Kontrolle sollte durchgeführt werden, da Substrate ebenfalls Artefakte erzeugen können. Testen Sie immer Ihr spezifisches Puffersystem und Flussprotokoll auf Artefakte, indem Sie die bloße SSM verwenden, bevor die Proteinstichprobe hinzugefügt wird. Nach Zugabe der Proteinstichprobe können Kontrollmessungen mit Lösungen durchgeführt werden, die strukturell ähnliche, aber keine Substrate enthalten.Außerdem besteht die Möglichkeit, Substrate auf Artefakte mithilfe von Liposomen oder Membranfragmenten ohne das Protein von Interesse zu testen. Sie können auch Inhibitoren zu Ihren Lösungen hinzufügen oder sie per Pipette aufbringen. Nach dem Experiment direkt an den Auslass des Vete, um die Hemmung des Transportersignals zu messen, verschwinden die proteinspezifischen Signale, sodass nur noch Artefakte durch Lösungsaustausch übrig bleiben.Das Proteinsignal kann dann leicht korrigiert werden. Stellen Sie sicher, dass der Verlust an gebundenem Prot, Liposomen oder Proteindegradierung Ihre Messung nicht beeinflusst. Durch wiederholte Kontrollmessungen unter identischen Bedingungen ist ein Signalabfall von bis zu 20 % akzeptabel und kann durch Annahme einer linearen zeitlichen Abhängigkeit des Abfalls korrigiert werden.Dieser Aufbau ist das Ergebnis von 20 Jahren technischer Entwicklung in unserem Labor. Außerdem sind spezialisierte Systeme mit höherer Zeitauflösung für die kinetische Analyse und geringerem Lösungsmittelverbrauch für teure Substrate verfügbar. Für die Wirkstoffscreening verwenden wir vollautomatische Aufbauten mit höherer Durchsatzleistung.Bis heute wurden mit dieser Methode mehr als 20 Transporter charakterisiert. Dazu gehören Transport-APAs, Komplexe der Atmungskette, Kool-Transporter, Austauscher und sogar Eisenkanäle. Wenn Sie Ihr Problem daher nicht mit der Standard-Elektrophysiologie lösen können, erwägen Sie den Einsatz der SS-Mase-Elektrophysiologie.

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Aufschluss über die elektromechanische Steuerung der Gewebehomöostase mit einem zweischichtigen mikrofluidischen Gerät

Ein experimentelles Protokoll wird vorgestellt, um Gramicidin-A-dotierte Tröpfchen-Interface-Doppelschichten zusammenzusetzen, elektrisch zu stimulieren und zu analysieren. Lipid-Protein-Struktur-Funktion-Beziehungen werden quantifiziert, indem Veränderungen der Membranfläche, des Ionenflusses und der Einkanal-Leitfähigkeit gemessen und diese Reaktionen auf plastizitätsähnliche Veränderungen der ionischen Leitung in einem von elektrischen Synapsen inspirierten Membranmodell in Beziehung gesetzt...

Lipid-Protein-Membranstruktur-Funktions-Charakterisierung mittels Tropfen-Interface-Doppelschichten

Lernen Sie die SSM-basierte Elektrophysiologie zur Charakterisierung elektrogener Membrantransporter. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller und eukaryotischer Transporter, die mit konventionellen Techniken nicht zugänglich sind.

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

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