Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

So wird die auf unterstützten Membranen basierende Elektrophysiologie, abgekürzt zu SSM-basierter Elektrophysiologie. Es handelt sich um einen neuen elektrophysiologischen Ansatz, der für eine Reihe von Anwendungen eine erhebliche Verbesserung im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden bietet.

Das zentrale Werkzeug der herkömmlichen Elektrophysiologie ist die mit Elektrolyt gefüllte Mikropartikelelektrode, während die M-basierte Elektrophysiologie Ladungsverschiebungen über eine festphasenunterstützte Membranelektrode nachweist. Sie ist äußerst nützlich in Fällen, in denen die herkömmliche Elektrophysiologie nicht angewendet werden kann, beispielsweise bei bakteriellen Transportproteinen, die – abgesehen von wenigen seltenen Ausnahmen – nicht mit der Spannungs-Clamp- oder Patch-Clamp-Methode untersucht werden können. In solchen Fällen hat sich die SSM-basierte Elektrophysiologie als sehr erfolgreich erwiesen.

Es kann auch zur Untersuchung physiologisch relevanter eukaryotischer Transporter in intrazellulären Membranen eingesetzt werden. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, elektrophysiologische Experimente mit der SSM-Methode durchzuführen. In der Grundlagenforschung kann sie zur Bestimmung kinetischer Parameter und zur Aufklärung des Transportmechanismus angewendet werden, doch ihre Robustheit und Automatisierungsfähigkeit machen sie ideal für Screening-Anwendungen in der Wirkstoffforschung.

Die SSM-Elektrode trägt ein zusammengesetztes Membransystem, das aus der zugrundeliegenden SSM und den aufgenommenen Proteasomen oder Membranfragmenten mit Ihrem Transportprotein der Wahl besteht. Die elektrischen Eigenschaften des zusammengesetzten Membransystems können durch eine Ersatzschaltung beschrieben werden, bei der die Membranen ein kapazitiv gekoppeltes System bilden. Beachten Sie, dass das elektrische Verhalten des Systems im Wesentlichen gleich ist, unabhängig davon, ob Membranfragmente oder Protea-Liposomen verwendet werden.

Die Ladungsverschiebung im Transportprotein wird über die Kapazität der Blasenmembran an die Messschaltung weitergeleitet. Ein Detektionsprinzip, das als kapazitive Kopplung bezeichnet wird. In einem typischen Experiment liefert der schnelle Lösungsaustausch am VSSM das Substrat für das Transportprotein V; die daraus resultierende elektrogenen Transportaktivität des Proteins erzeugt einen Strom, der kapazitiv über die SSM-Kapazität an das Messsystem gekoppelt wird.

Gleichzeitig lädt die elektrogene Proteintätigkeit schrittweise die liposomale Membran auf, was zur Hemmung des Transportproteins und einem abnehmenden Strom im Aufnahmekreis führt. Der gemessene Strom resultiert aus simultanen Transportsreaktionen von Millionen proteahaltiger Liposomen, die an das Enzo adsorbiert sind, wobei jedes etwa 100 Transporter enthält. Der Aufbau besteht aus einer Faraday-Käfiganordnung mit einem Lösungsweg, externen Schaltkreisen zur Ventilsteuerung, Signalverstärkung sowie Datenerfassung und -analyse.

Der EC-Käfig umfasst Behälter, Ventile und Schläuche zur Steuerung des Lösungsdurchflusses sowie einen Cubit mit einem XOR-Chip. Der XOR-Chip trägt die SSM-Elektrode und die adsorbierten Proteoliposomen. Die Vete ist mit dem Verstärker und dem Funktionsgenerator des externen elektrischen Schaltkreises verbunden.

SSM-Messungen, erzeugen Feuer, zwei Lösungen, eine aktivierende und eine nicht aktivierende neben dem Substrat, das nur in der aktivierenden Lösung vorhanden ist. Beide Lösungen haben die gleiche Zusammensetzung in der Einzelaustauschkonfiguration. Zwei Zwei-Wege-Ventile steuern den Fluss der nicht reaktivierenden und der aktivierenden Lösung.

Das Endventil, ein mechanisch gekoppeltes 3×3-Wegeventil, wird verwendet, um zwischen der nicht aktivierenden und der aktivierenden Lösung umzuschalten, wobei eine der Lösungen in den Abfallbehälter und die andere Lösung zur qve geleitet wird. Wenn das Endventil umgeschaltet wird, wird der Fluss der nicht aktivierenden Lösung in den Abfall umgeleitet und die aktivierende Lösung strömt zur qve. Diese Konfiguration ermöglicht einen gleichzeitigen kontinuierlichen Fluss beider Lösungen.

Zu jedem Zeitpunkt während des Flussprotokolls kann der Flussweg je nach Bedarf optimiert werden. Allerdings muss beachtet werden, dass der Abstand zwischen der SSM und der Verbindungsstelle der nicht aktivierenden und der aktivierenden Lösungen so kurz wie möglich gehalten werden sollte, da er die Zeitspanne des Lösungsaustauschs bestimmt.

Der Stromverstärker außerhalb des Abschirmgehäuses der Leistungseinheit ist mit einem Sensorchip verbunden. Typischerweise wird eine Verstärkung von 10 hoch acht bis 10 hoch neun Volt pro Ampere und eine Ruhezeit von ein bis zehn Millisekunden eingestellt. Ein Funktionsgenerator ist an die Referenzelektrode angeschlossen, und ein Computer mit Ventilsteuerungs- und Datenerfassungssoftware sowie eine Interface-Box vervollständigen das System.

Die Schnittstellenbox enthält die Ventilansteuerung, Datenerfassung und die Hardwarelösung für digitale Ausgänge; der Fluss wird durch Druckluft mit einem Druck von 0,22 bar aufrechterhalten. Ein Druck von einem Bar wird mithilfe eines digitalen Manometers überwacht. Er kann durch Befüllen eines Stahlbehälters, der über ein Nadelventil zwischen der Luftzufuhr und den Lösungsmittelbehältern im EC-Cage installiert ist, aufrechterhalten werden.

Der CVIC besteht aus vier Teilen. Der Zen-Chip ist zwischen der Vet-Basis und dem Vet-Kopf eingeschlossen. Ein zylindrischer Auslassanschluss ist mit dem Vet-Kopf verschraubt und trägt die Referenzelektrodenanordnung.

Die Referenzelektrode besteht aus einem chlorierten Silberdraht mit einem Miniatur-SMC-Stecker und ist durch eine Polyacryl-Gel-Salzbrücke von der Durchflussstrecke isoliert. Wenn die Elektrode nicht verwendet wird, wird die Gelbrückenbaugruppe in einer 100 Millimolar Kaliumphosphat-pH-7-Lösung aufbewahrt, die 100 Millimolar Kaliumchlorid enthält. Zunächst muss die Referenzelektrode in die Referenzelektrodenbaugruppe eingebaut werden, die die Gelbrücke enthält.

Es ist wichtig, Luftblasen zu vermeiden, während die Referenzelektrode installiert wird. Nun wird dieser Teil der Vete mit dem Auslassanschluss verbunden, der bereits mit Pufferlösung vorgefüllt wurde. Alle Verbindungen müssen mit O-Ringen abgedichtet werden.

Dieses SM wird auf einem Zor-Chip gebildet, einem strukturierten Ziegenbeschichteten Glaslicht. Diese sematische Leiterbahn ist einen Millimeter breit und hat einen Durchmesser und ist über einen 0,2-Millimeter-breiten weißen Kontaktstreifen mit dem Kontaktfeld verbunden. Ein Federkontaktstift stellt die Verbindung zum Verstärker her.

Der Zen-Chip wird im Dunkeln in einer 10 LAR Okta-Deccan-Thiol-Ethanol-Lösung aufbewahrt. Um die arkane Thi-Schicht aufrechtzuerhalten und die Okta-Deccan-Virusmoleküle, die nicht absorbiert wurden, zu entfernen, wird die Elektrode mit reinem Ethanol gespült und anschließend in Stickstoffgas getrocknet. Nun kann die Phosphocholin-Monoschicht aufgebaut werden.

Die Lipidlösung enthält 15 Milligramm pro Milliliter DFI-Cholin und 250 Mikrogramm pro Milliliter Okta zwei A-Min in Deca und wird bei minus 20 Grad gelagert. Die Elektrode wird nun genau auf der Basis des SA-Cubits platziert.

Ein Mikroliter der Lösung wird zur SSM-Elektrode hinzugefügt, ohne die Goldschicht zu berühren. Unmittelbar nach dem Hinzufügen der Lipidlösung kann die vete montiert werden. Das von einem O-Ring abgedichtete vete-Volumen ist zylindrisch und weist ein inneres Volumen von 17 Mikroliter auf, wenn es montiert ist.

Der SSM sollte mittig unter der Einlassbohrung positioniert sein. Vor dem Anschließen des Vet muss das Flüssigkeitssystem mit einer 100 Millimolar Kaliumphosphatpufferlösung vorgefüllt werden. Es ist wichtig sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen in den Schläuchen und Ventilen befinden.

Nun kann der Vet in den Schilddrüsentageskäfig eingebaut, der Verstärker sowie der Einlass und Auslass des Lösungsflusswegs und der Funktionsgenerator angeschlossen werden. Abschließend kann der Cubit mit einem 100 Millimeter Kaliumphosphatpuffer gespült werden. Dies führt zur spontanen SSM-Bildung, um die Qualität des SSM zu überprüfen.

Kapazität und Leitfähigkeit werden mithilfe des Funktionsgenerators gemessen, wobei eine Gleichspannung von 100 Millivolt verwendet wird. Der Stromabfall zeigt das Aufladen des Membrankondensators an, nachdem der Kondensator vollständig geladen ist. Der gemessene Strom ergibt die Membranleitfähigkeit unter Anwendung des Ohmschen Gesetzes.

Hier beobachten wir eine Leitfähigkeit von 0,17 Nano-Siemens. Die Kapazität kann mit einer dreieckförmigen Wechselspannung von 50 Millivolt Spitze-zu-Spitze-Amplitude und einer Frequenz von 0,5 Hertz gemessen werden. Die Amplitude des resultierenden Rechteckstroms stellt den Beurteilungsstrom des Kondensators dar.

Die Kapazität entspricht der übertragenen Ladung dividiert durch die angelegte Spannung. Diese Membran weist eine Kapazität von 2,3 Nano auf, eine hohe Leitfähigkeit und eine niedrige Kapazität deuten darauf hin, dass die SSM nicht korrekt gebildet ist. In diesen Fällen sollte die Membran verworfen und eine neue SSM unter Verwendung eines neuen Elektrodenchips hergestellt werden.

Prototyp-Liposomen werden normalerweise bei Minus 80 eingefroren gelagert. TRE th die Probe auf Eis zu sonifizieren, ist entscheidend, da eine aggregierte Probe Sehne am SSM absorbiert, um eine homogene Prototyp-Liposomen-Suspension zu erhalten. Drei zehnsekündige Sonifikationszyklen werden abwechselnd mit zehnsekündigen Kühlphasen auf Eis durchgeführt.

Spülen Sie das SSM mit einer nicht aktivierenden Lösung. Dann schrauben Sie den Auslassanschluss zusammen mit der Referenzelektrodenprobe ab. Injizieren Sie mithilfe einer Pipette 30 Mikroliter der Proteinstichprobe durch den Auslass des Vete in das Ette-Volumen.

Befestigen Sie zuerst die Pipettenspitze am Auslassbohrloch. Öffnen Sie dann das manuelle Gerät oben im nicht aktivierenden Weg und injizieren Sie die Protealiposomen. Vor dem Entfernen der Pipettenspitze.

Schließen Sie die manuelle Steuerung oben, um einen weiteren Lösungsfluss zu verhindern. Lassen Sie die Protea-Liposomen für eine Inkubationszeit von einer bis zwei Stunden an die SSM adsorbieren. Verwenden Sie das Flussprotokoll-Fenster der Ventilsteuerungs- und Datenerfassungssoftware, um Ihr Flussprotokoll festzulegen.

Wenn Sie unter symmetrischen Bedingungen messen möchten, beispielsweise zur Bestimmung der Substratspezifität, des KM-Werts oder der pH-Abhängigkeit, wählen Sie das Protokoll für den Einzel-Lösungsaustausch. Stellen Sie die Flussdauer für jede Lösung auf 0,5 bis eine Sekunde ein. Der Strom wird während des gesamten Flussprotokolls aufgezeichnet.

Die Verstärkung wird typischerweise auf 10 hoch neun eingestellt, und für die Abtastrate wählen wir 2000 Datenpunkte pro Sekunde. Speichern Sie abschließend Ihr neues Protokoll unter dem Titel NA a und a. Auf der zweiten Registerkarte des Durchflussprotokoll-Fensters können Sie den geöffneten oder geschlossenen Zustand bestimmter Ventile definieren, um den Durchfluss von nicht aktivierender oder aktivierender Lösung durch Qubit zu steuern.

Hier zeigen wir die Messung von Protea-Liposomen, dem zuckerabhängigen Protonenimport wie Y aus E. coli. Die aktivierende Lösung enthält das transportierte Substrat Lactose, während die nicht aktivierende Lösung die gleiche Menge des nicht transportierten Glucose als Ausgleichsverbindung enthält. Zusätzlich zu den Zuckern enthalten die Lösungen 100 Millimolar Kaliumphosphat bei pH 7,6 und ein Millimolar DTT.

Nach dem Wechseln der Lösungen verwenden Sie das manuelle Ventil, um sicherzustellen, dass Luftblasen entfernt werden. Stellen Sie den Druck kurz vor Beginn der Messung ein, bevor Sie ein Durchflussprotokoll starten. Üblicherweise verwenden wir einen Druck von 0,6 bar, der bei unserer spezifischen Ventil- und Schlauchkonfiguration eine Durchflussgeschwindigkeit von etwa einem Milliliter pro Sekunde ergibt.

Danach hier ein sicheres Fluss-Protokoll auswählen, das NAA-Protokoll, und die Starttaste drücken, um jede Messung zu beginnen. Während der ersten Messungen werden locker gebundene Protea-Liposomen entfernt, weshalb der Spitzenstrom abnehmen kann. Die Messung wiederholen, bis der Spitzenstrom konstant bleibt.

Während der ersten Phase des Durchflusses der nicht aktivierenden Lösung beträgt der Strom null. Der Austausch von der nicht aktivierenden zur aktivierenden Lösung, die Lactose enthält, induziert die elektrogenen Transportaktivität der Membran. Positive Ladungen des Proteins sammeln sich im Inneren der Proteoliposomen an, und der Verstärker detektiert einen positiven transienten Strom aufgrund einer positiven Kopplung über das SSM.

Dieser positive, positiv gekoppelte Strom wird als Einschalt-Signal V-Austausch aus der aktivierenden Lösung bezeichnet. Die Rückkehr zur nicht aktivierenden Lösung induziert den Protonenzucker-Transportcode aus den Liposomen heraus. In diesem Fall wird ein negativer, LY-gekoppelter Strom angezeigt, das sogenannte Ausschalt-Signal für die proteinkinetische Analyse.

Nur das Eins-Signal wird verwendet, da das Aussignal aufgrund des Ladungszustands, den der Schaltvorgang des Membranventils erzeugt, schlecht definiert ist und mechanische sowie elektrische Artefakte verursacht. Glücklicherweise beschränken sich diese auf einen Zeitbereich vor dem Auftreten der proteininduzierten Signale. Beachten Sie, dass die 50 Millisekunden Verzögerung zwischen den durch das Ventilschalten verursachten Artefakten und den Transportsignalen die Zeit angibt, die die Lösung benötigt, um sich vom Endventil bis zur Oberfläche des SSM auszubreiten. Eine solche schnelle Lösungsumspülung, wie sie am SSM durchgeführt wird, stellt einen typischen Relaxationsversuch dar.

Bei solchen Experimenten relaxiert der Strom über eine zeitabhängige, vor der stationären Phase liegende Vorzustandsphase in einen konstanten stationären Zustand. Kinetische Details des Reaktionszyklus können aus der Form und der Größe des Vorzustandsstroms abgeleitet werden. Während der stationäre Strom Aufschluss über die kontinuierliche Umsatzrate des Membranproteins gibt.

In dem lose gekoppelten System, bei dem Protea-Liposomen an ihren SSM adsorbiert sind, sind die vorherigen stationären Ströme praktisch unverändert. Während ein konstanter stationärer Strom niemals erreicht wird, nimmt der gemessene Strom aufgrund der Aufladung der Liposomen allmählich ab. Der Transportstrom kann aus dem gemessenen lose gekoppelten Strom mittels Schaltungsanalyse berechnet werden.

Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse unter Verwendung des Zucker-Protonen-Cotransporters, wie Y, im pH-Bereich zwischen 8,5 und 7,6. Der Transportstrom wird durch eine elektrogenische Reaktion in einem späten Stadium des Reaktionszyklus dominiert. Unter diesen Bedingungen besteht die vorgeschaltete stationäre Phase aus einem einfachen Anstieg des Stroms bis zu seinem stationären Wert.

Dieser zerfällt dann aufgrund kapazitiver Kopplung. Von Interesse ist der stationäre Transportstrom. In Abwesenheit eines Membranpotentials wird dieser durch den Spitzenstrom hinreichend gut approximiert.

Die Ali Mein-Kinetik kann daher analysiert werden, indem die Spitzeströme für verschiedene Substratkonzentrationen aufgetragen werden. Beachten Sie jedoch, dass Spitzestromamplituden nur dann streng miteinander verglichen werden können, wenn sie aus einem einzelnen Sensor innerhalb eines Experiments stammen. Ein Grund hierfür ist die Variabilität der Absorptionseffizienz. Wenn der pH-Wert weiter gesenkt wird, verwandelt sich das monophasische Signal in ein biphasisches.

Und schließlich bleibt ein schneller transiente für den transportdefizienten lag-Y-Mutanten bestehen. Dem schnellen Transienten folgt eine kleine, langsamere negative Komponente. Die negative Komponente ist charakteristisch für schnelle Transientenströme, die in ly-gekoppelten Systemen gemessen werden, und wird durch die Entladung der Membrankapazität verursacht.

Hier repräsentiert der Spitzenstrom keinen stationären Transport, sondern vielmehr eine elektrogenische Bestätigung eines frühen Übergangs im Ionenzyklus. Dies wird deutlich, da ein lagY-Mutant keinen stationären Transport zeigt und beim Wildtyp lagY der stationäre Transport durch einen niedrigen pH-Wert gehemmt wird. Die experimentellen Befunde liefern eine mechanistische Interpretation der Ladungstranslokation im Reaktionszyklus von lagY, wie sie im kinetischen Modell dargestellt ist. Die schnelle transiente Erscheinung, die beim transportdefizienten Mutanten beobachtet wird oder im Fall des Wildtyps lagY unter sauren Bedingungen, beruht auf einer schnellen, wöchentlich elektrogenen Reaktion nach Lactosbindung bei höheren pH-Werten. Bei höheren pH-Werten wird das Signal dominiert durch die Hauptreaktion, eine späte elektrogene Reaktion im Reaktionszyklus, die als pseudo-plasmische Protonenfreisetzung in einem kapazitiv gekoppelten System vorgeschlagen wurde.

Dies führt zu transienten Strömen, die den stationären Transport von Lag y aufgrund der starken Wechselwirkung der Utes darstellen. Bei Verwendung der SSM entstehen elektrische Artefakte, wenn Lösungen unterschiedlicher Zusammensetzung ausgetauscht werden. Stellen Sie sicher, dass nichtaktivierende und aktivierende Lösungen bezüglich ihres pH-Werts und ihrer ionischen Stärken so ähnlich wie möglich sind.

Die Kontrolle sollte durchgeführt werden, da Substrate ebenfalls Artefakte erzeugen können. Testen Sie immer Ihr spezifisches Puffersystem und Flussprotokoll auf Artefakte, indem Sie die bloße SSM verwenden, bevor die Proteinstichprobe hinzugefügt wird. Nach Zugabe der Proteinstichprobe können Kontrollmessungen mit Lösungen durchgeführt werden, die strukturell ähnliche, aber keine Substrate enthalten.

Außerdem besteht die Möglichkeit, Substrate auf Artefakte mithilfe von Liposomen oder Membranfragmenten ohne das Protein von Interesse zu testen. Sie können auch Inhibitoren zu Ihren Lösungen hinzufügen oder sie per Pipette aufbringen. Nach dem Experiment direkt an den Auslass des Vete, um die Hemmung des Transportersignals zu messen, verschwinden die proteinspezifischen Signale, sodass nur noch Artefakte durch Lösungsaustausch übrig bleiben.

Das Proteinsignal kann dann leicht korrigiert werden. Stellen Sie sicher, dass der Verlust an gebundenem Prot, Liposomen oder Proteindegradierung Ihre Messung nicht beeinflusst. Durch wiederholte Kontrollmessungen unter identischen Bedingungen ist ein Signalabfall von bis zu 20 % akzeptabel und kann durch Annahme einer linearen zeitlichen Abhängigkeit des Abfalls korrigiert werden.

Dieser Aufbau ist das Ergebnis von 20 Jahren technischer Entwicklung in unserem Labor. Außerdem sind spezialisierte Systeme mit höherer Zeitauflösung für die kinetische Analyse und geringerem Lösungsmittelverbrauch für teure Substrate verfügbar. Für die Wirkstoffscreening verwenden wir vollautomatische Aufbauten mit höherer Durchsatzleistung.

Bis heute wurden mit dieser Methode mehr als 20 Transporter charakterisiert. Dazu gehören Transport-APAs, Komplexe der Atmungskette, Kool-Transporter, Austauscher und sogar Eisenkanäle. Wenn Sie Ihr Problem daher nicht mit der Standard-Elektrophysiologie lösen können, erwägen Sie den Einsatz der SS-Mase-Elektrophysiologie.