Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

So unterstützte die membranbasierte Elektrophysiologie, abgekürzt als SSM-basierte Elektrophysiologie. Es ist ein neuer elektrophysiologischer Ansatz. Es bietet für eine Reihe von Anwendungen eine deutliche Verbesserung gegenüber den herkömmlichen Methoden.

Das Hauptwerkzeug der konventionellen Elektrophysiologie ist die elektrolytgefüllte Mikropartikelelektrode, während die M-basierte Elektrophysiologie die Ladungstranslokation über eine fest getragene Membranelektrode detektiert. Sie ist äußerst nützlich in Fällen, in denen die konventionelle Elektrophysiologie nicht eingesetzt werden kann, wie z. B. bei bakteriellen Transportern, die bis auf wenige Ausnahmen nicht mit Voltage-Clamp- oder Patch-Cam-Methoden untersucht werden können. In solchen Fällen hat sich die SSM-basierte Elektrophysiologie als sehr erfolgreich erwiesen.

Es kann auch zur Untersuchung physiologisch relevanter eukaryotischer Transporter in intrazellulären Membranen eingesetzt werden. Es gibt viele Möglichkeiten, SSM-basierte elektrophysiologische Experimente durchzuführen. In der Grundlagenforschung kann es zur Bestimmung kinetischer Parameter und zur Aufklärung des Transportmechanismus eingesetzt werden, aber seine Robustheit und sein Automatisierungspotenzial machen es ideal für Screening-Anwendungen in der Spurerkennung.

Die SSM-Elektrode trägt ein Verbundmembransystem, das aus dem zugrunde liegenden SSM und den adoptierten Proteasomen oder Membranfragmenten besteht, die das gewünschte Transportprotein enthalten. Die elektrischen Eigenschaften der Verbundmembran können durch eine Ersatzschaltung beschrieben werden, in der die Membranen ein kapazitiv gekoppeltes System bilden. Es ist zu beachten, dass das elektrische Verhalten des Systems im Wesentlichen das gleiche ist, unabhängig davon, ob Membranfragmente oder Protea-Liposomen verwendet werden.

Die Ladungsverschiebung im Transportprotein wird über die Kapazität der Blasenmembran an den Messkreis übertragen. Ein Detektionsprinzip, das als kapazitive Kopplung bezeichnet wird. In einem typischen Experiment liefert der schnelle Lösungsaustausch am VSSM das Substrat für das Transportprotein V, woraufhin die elektrogene Transportaktivität des Proteins einen Strom erzeugt, der über die SSM-Kapazität an das Messsystem gekoppelt ist.

Gleichzeitig lädt die elektrogene Proteinaktivität die liposomale Membran allmählich auf, was zu einer Hemmung des Transportproteins und dem abnehmenden Strom in der Aufzeichnungsschaltung führt, der gemessene Strom ist das Ergebnis gleichzeitiger Transportreaktionen von Millionen von Protea-Liposomen, die an den Enzo absorbiert werden. Jeder enthält ca. 100 Transporter. Der Aufbau besteht aus einem Faradayschen Käfig mit Lösungspfad, externen Schaltkreisen für die Ventilsteuerung, der Signalverstärkung sowie der Datenerfassung und -analyse.

Der EC-Käfig enthält Behälter, Ventile und Schläuche, die für die Durchflussregelung der Lösung erforderlich sind, sowie eine Elle mit einem XOR-Chip. Der XOR-Chip trägt die SSM-Elektrode und die absorbierten Prot-Liposomen. Der Vete wird an den Verstärker und Funktionsgenerator des externen Stromkreises angeschlossen.

SSM-Messungen richten einen Brand aus, zwei Lösungen, eine aktivierende und eine nicht aktivierende, abgesehen von dem Substrat, das nur in der aktivierenden Lösung vorhanden ist. Beide Lösungen haben die gleiche Zusammensetzung in der Single-Exchange-Konfiguration. Zwei Zweiwegeventile steuern den Durchfluss der nicht reaktivierenden und der aktivierenden Lösung.

Das Endventil, ein mechanisch gekoppeltes Dreifach-Dreiwegeventil, wird verwendet, um zwischen der nicht aktivierenden und der aktivierenden Lösung zu wechseln, wobei eine der Lösungen zum Abfallbehälter und die andere Lösung zum QVE geleitet wird. Wenn das Endventil geschaltet wird, wird der Fluss der nicht aktivierenden Lösung zum Abfall umgeleitet und die aktivierende Lösung fließt zum qve. Diese Konfiguration ermöglicht einen gleichzeitigen kontinuierlichen Fluss beider Lösungen.

Während des Flow-Protokolls kann der Flow-Pfad jederzeit je nach Bedarf optimiert werden. Es ist jedoch zu beachten, dass der Abstand zwischen dem SSM und der Verbindungsstelle zwischen der nicht aktivierenden und der aktivierenden Lösung so kurz wie möglich gehalten werden sollte. Da sie die Timerlösung des Lösungsaustauschs bestimmt.

Der Stromverstärker außerhalb des Power-Deck-Käfigs ist mit einem Sensorchip verbunden. Typischerweise ist diese auf eine Verstärkung von 10 hoch acht bis 10, auf eine Leistung von neun Volt pro Ampere und eine Ruhezeit von ein bis 10 Millisekunden eingestellt. An die Referenzelektrode ist ein Funktionsgenerator angeschlossen und ein Rechner mit Ventilsteuerungs- und Datenerfassungssoftware sowie eine Interface-Box runden das System ab.

Die Interface-Box enthält die Ventiltreiber, die Datenerfassung und den digitalen Ausgang der Hardwarelösung, der Durchfluss wird durch Druckluft von oh 0,22 aufrechterhalten. Ein bar Druck wird mit einem digitalen Millimeter überwacht. Es kann aufrechterhalten werden, indem ein Stahlbehälter befüllt wird, der über ein Nadelventil zwischen dem Luftzufuhr- und dem Lösungsbehälter im EC-Käfig installiert ist.

Der CVIC besteht aus vier Teilen. Der Zen-Chip wird zwischen der Tierarztbasis und dem Tierarztkopf eingeklemmt. Ein zylindrischer Auslassverbinder wird mit dem Prüfkopf verschraubt und trägt die Referenzelektrodenbaugruppe.

Die Referenzelektrode besteht aus einem chlorierten Silberdraht mit einem Miniatur-SMC-Stecker und ist durch eine Polyacryl-Gel-Salzbrücke vom Strömungsweg isoliert. Die nicht in Gebrauch befindliche Gelbrückenanordnung wird in einer 100 Millimolare Kaliumphosphat-pH-7-Lösung gelagert, die 100 Millimolare Kaliumchlorid enthält. Zuerst muss die Referenzelektrode in die Referenzelektrodenanordnung eingebaut werden, die die Geobrücke enthält.

Es ist wichtig, Luftblasen bei der Installation der Referenzelektrode zu vermeiden. Nun wird dieser Teil des Vetes an den Auslassanschluss angeschlossen, der mit Pufferlösung vorgefüllt wurde. Alle Anschlüsse müssen mit O-Ringen abgedichtet werden.

Dieses SM wird auf einem Zor-Chip gebildet, einer strukturierten, mit Ziegen beschichteten Glasleuchte. Diese ist eine sematische Straße mit einem Durchmesser von einem Millimeter und wird über eine oh 0,2 Millimeter weiße Kontaktleiste mit dem Kontaktpad verbunden. Ein Federkontaktstift stellt einen Kontakt zum Verstärker her.

Der Zen-Chip wird im Dunkeln in einer 10 LAR Okta Deccan Thiol-Ethanol-Lösung gelagert. Um ihre arkane Schicht zu erhalten, um die nicht absorbierten Okta Deccan Virusmoleküle zu entfernen, wird die Elektrode mit reinem Ethanol gespült und die Elektrode in Stickstoffgas getrocknet. Nun kann die Phosphocholin-Monoschicht montiert werden.

Die Lipidlösung enthält 15 Milligramm pro Milliliter DFI-Cholin und 250 Mikrogramm pro Milliliter. Okta zwei Eine Mine befindet sich im Zerfall und wird bei minus 20 Grad gelagert. Die Elektrode wird nun genau auf der Basis der SA-Elle platziert.

Ein Mikroliter der Lösung wird der SSM-Elektrode zugesetzt, ohne die Goldschicht zu berühren. Unmittelbar nach der Zugabe der Lipidlösung kann der Vete zusammengebaut werden. Das durch einen O-Ring abgedichtete Vete-Volumen ist zylindrisch mit einem Innenvolumen von 17 Mikrolitern im montierten Zustand.

Das SSM sollte unter der Einlassbohrung zentriert werden. Vor dem Anschluss des Tierarztes muss das Fluidsystem mit 100 millimolar Kaliumphosphat-Pufferlösung vorgefüllt werden. Es ist darauf zu achten, dass sich keine Luftblasen in den Schläuchen und den Ventilen befinden.

Nun kann der Tierarzt in den Schilddrüsen-Tageskäfig eingebaut werden, den Verstärker, den Ein- und Auslass des Lösungsflussweges und den Funktionsgenerator anschließen. Zum Schluss kann die Elle mit einem 100 Millimeter Kaliumphosphatpuffer gespült werden. Dies führt zur spontanen SSM-Bildung, um die Qualität des SSM zu überprüfen.

Kapazität und Leitwert werden mit Hilfe des Funktionsgenerators gemessen, zur Messung des Leitwerts werden 100 Millivolt Gleichspannung verwendet. Der Stromabfall zeigt die Ladung des Membrankondensators, nachdem der Kondensator vollständig geladen ist. Der gemessene Strom ergibt die Membranleitfähigkeit nach dem M'schen Gesetz.

Hier beobachten wir einen Leitwert von oh 0,17 nano Siemens. Die Kapazität kann mit einer dreieckigen Wechselspannung von 50 Millivolt Spitze-Spitze-Amplitude und einer Frequenz von oh 0,5 Hertz gemessen werden. Die Amplitude des resultierenden Rechteckstroms stellt den Richtstrom des Kondensators dar.

Die Kapazität ist gleich der übertragenen Ladung geteilt durch die angelegte Spannung. Diese Membran weist eine Kapazität von 2,3 nano auf, eine hohe Leitfähigkeit und eine niedrige Kapazität deuten darauf hin, dass das SSM nicht korrekt ausgebildet ist. In diesen Fällen sollte die Membran verworfen und ein anderes SSM mit einem neuen Elektrodenchip hergestellt werden.

Normalerweise werden Prot-Liposomen gefroren bei minus 80 gelagert. Die Probe bei der Eisbeschallung ist unerlässlich, da eine aggregierte Probe die Riemenscheibe zum SSM absorbiert, um eine homogene Prot-Liposomensuspension zu erhalten. Drei Zehn-Sekunden-Beschallungszyklen wechseln sich mit Zehn-Sekunden-Abkühlintervallen auf dem Eis ab.

Spülen Sie das SSM mit einer nicht aktivierenden Lösung aus. Schrauben Sie dann den Ausgangsstecker zusammen mit der Referenzelektrodenprobe ab. Injizieren Sie mit einer Pipette 30 Mikroliter der Proteinprobe durch den Auslass der Vete in das Ette-Volumen.

Montieren Sie zunächst die Pipettenspitze an der Auslassbohrung. Öffnen Sie dann das obige Handbuch im nicht-aktivierenden Weg und injizieren Sie die Protea-Liposomen. Vor dem Degradieren der Pipettenspitze.

Schließen Sie das obige Handbuch, um einen weiteren Lösungsfluss zu verhindern. Lassen Sie die Protea-Liposomen für eine Inkubationszeit von ein bis zwei Stunden in das SSM einziehen. Verwenden Sie das Fenster Durchflussprotokoll der Ventilsteuerungs- und Datenerfassungssoftware, um Ihr Durchflussprotokoll zu definieren.

Wenn Sie unter symmetrischen Bedingungen messen möchten, z. B. zur Bestimmung der Substratspezifität, des KM-Werts oder der pH-Abhängigkeit, wählen Sie das Protokoll für den Austausch einer einzigen Lösung. Legen Sie die Flussdauer für jede Lösung auf oh 0,5 bis eine Sekunde fest. Der Strom wird über das gesamte Durchflussprotokoll aufgezeichnet.

Die Verstärkung ist in der Regel auf 10 hoch neun eingestellt, und für die Abtastrate wählen wir 2000 Datenpunkte pro Sekunde. Speichern Sie abschließend Ihr neues Protokoll unter dem Titel NA a und a. Beim zweiten Tippen auf das Fenster des Durchflussprotokolls können Sie den offenen oder geschlossenen Zustand bestimmter Ventile definieren, um den Durchfluss von nicht aktivierenden oder aktivierenden Lösungen durch das Qubit zu steuern.

Hier zeigen wir die Messung von Protea-Liposomen, dem Zuckerprotonenimport wie Y aus E. coli. Die aktivierende Lösung enthält das transportierte Substrat Laktose, während die nicht aktivierende Lösung die gleiche Menge der nicht transportierten Glukose wie eine kompensatorische Verbindung enthält. Zusätzlich zu den Zuckern enthalten die Lösungen 100 millimolares Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 7,6 und ein millimolares DTT.

Verwenden Sie nach dem Wechseln der Lösung das manuelle Ventil, um sicherzustellen, dass die Luftblasen entfernt werden. Bevor Sie ein Durchflussprotokoll starten, stellen Sie den Druck kurz vor Beginn der Messung ein. Wir verwenden routinemäßig einen Druck von Ø 0,6 bar, was bei unserer spezifischen Ventil- und Rohrkonfiguration eine Durchflussrate von etwa einem Milliliter pro Sekunde ergibt.

Wählen Sie dann hier ein sicheres Durchflussprotokoll aus, das NAA-Protokoll, und drücken Sie die Start-Taste, um jede Messung zu starten. Bei den ersten Messungen werden die Protea-Liposomen locker absorbiert und daher kann der Spitzenstrom abnehmen. Wiederholen Sie die Messung, bis der Spitzenstrom konstant bleibt.

Während der ersten Phase des nicht aktivierenden Lösungsflusses ist der Strom Null. Durch den Austausch von nicht-aktivierender zu aktivierender Lösung, die Laktose enthält, wird die elektrogene Transportaktivität der Membran induziert. Die positive Ladung des Proteins sammelt sich in den Prote-Liposomen an und der Verstärker erkennt einen positiven transienten Strom aufgrund der positiven Kopplung über das SSM.

Dieser positiv positiv gekoppelte Strom wird als Ein-Signal-V-Austausch von der aktivierenden Lösung bezeichnet. Zurück zur nicht-aktivierenden Lösung induziert der Transport des Protonenzuckercodes aus den Liposomen. In diesem Fall wird ein negativer LY-gekoppelter Strom angezeigt, das sogenannte Off-Signal für die proteinkinetische Analyse.

Es wird nur das Ein-Signal verwendet, da das Aus-Signal aufgrund des Ladungszustands des Membranventilschaltens zu mechanischen und elektrischen Artefakten führt. Glücklicherweise sind diese auf einen Zeitraum beschränkt, bevor die proteininduzierten Signale beobachtet werden. Beachten Sie, dass die Verzögerung von 50 Millisekunden zwischen Ventilschaltartefakten und Transportersignalen die Zeit ist, die die Lösung benötigt, um sich vom Endventil auf die Oberfläche des SSM auszubreiten. Rapid Solution Exchange, wie er am SSM durchgeführt wird, stellt ein typisches Relaxationsexperiment dar.

In solchen Experimenten entspannt sich der Strom durch eine zeitabhängige Vorstationärphase in einen konstanten stationären Zustand. Die aktuellen kinetischen Details des Reaktionszyklus können aus der Form und Größe des vorstationären Stroms abgeleitet werden. Während der stationäre Strom Informationen über den kontinuierlichen Membranproteinumsatz liefert.

In dem ly-gekoppelten System, in dem Protea-Liposomen zu ihrem SSM absorbiert werden, sind die Pre-Steady-State-Ströme praktisch unverändert. Während nie ein konstanter stationärer Strom erreicht wird, nimmt der gemessene Strom durch die Aufladung der Liposomen allmählich ab. Der Transporterstrom kann aus dem gemessenen Einkopplungsstrom mittels Schaltungsanalyse berechnet werden.

Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse mit dem Zuckerprotonen-Co-Transporter, wie Y im PA-Bereich zwischen 8,5 und 7,6. Der Transporterstrom wird von einer elektrogenen Reaktion gegen Ende des Reaktionszyklus dominiert. Unter diesen Bedingungen besteht die prestationäre Fläche aus einem einfachen Stromanstieg auf ihren stationären Wert.

Diese zerfällt dann durch kapazitive Kopplung. Wir interessieren uns für den stationären Transportstrom. In Ermangelung eines Membranpotentials wird dies in guter Näherung durch den Spitzenstrom dargestellt.

Die Ali-Mein-Kinetik kann daher analysiert werden, indem die Spitzenströme für verschiedene Substratkonzentrationen geplottet werden, aber bedenken Sie, dass Spitzenstromamplituden nur dann rigoros verglichen werden können, wenn sie von einem einzigen Sensor in einem Experiment erhalten werden. Ein Grund dafür ist die Variabilität der Absorptionseffizienz. Wenn der pH-Wert weiter gesenkt wird, wird das monophasische Signal biphasisch.

Und schließlich bleibt eine schnelle Transiente für die Transportmangel-Lag-Y-Mutante übrig. Auf die schnelle Transiente folgt eine kleine, langsamere negative Komponente. Die negative Komponente ist charakteristisch für schnelle transiente Ströme, die in ly-gekoppelten Systemen gemessen werden, und wird durch Membrankapazitätsentladung verursacht.

Hier stellt der Spitzenstrom keinen stationären Transport dar, sondern eine elektrogene Bestätigung des Übergangs zu Beginn des Ionenzyklus, was sich dadurch zeigt, dass eine la y Mutante keinen stationären Transport zeigt, und bei Wildtyp-Verzögerung wird der y stationäre Transport durch einen niedrigen pH-Wert gehemmt. Die experimentelle Evidenz liefert eine mechanistische Interpretation der Ladungstranslokation im Reaktionszyklus von lag y, die im kinetischen Modell gezeigt wird. Die schnelle Transiente, die für die transportdefiziente Mutante oder im Falle des Wildtyp-Lags Y bei sauren Bedingungen beobachtet wurde, ist auf eine schnelle wöchentliche elektrogene Reaktion nach Laktosebindung bei höheren pH-Werten zurückzuführen, das Signal wird von der elektrogenen Hauptreaktion gegen Ende des Reaktionszyklus dominiert, die als pseudoplasmatische Protonenfreisetzung im kapazitiv gekoppelten System vorgeschlagen wurde.

Dies führt aufgrund der starken Wechselwirkung der Utes zu transienten Strömen, die den stationären Transport von Lag y darstellen. Mit dem SSM werden elektrische Artefakte erzeugt, wenn Lösungen unterschiedlicher Zusammensetzung ausgetauscht werden. Achten Sie darauf, dass sich nicht-aktivierende und aktivierende Lösungen so ähnlich wie möglich sind, insbesondere in Bezug auf ihren pH-Wert und ihre Ionenstärke.

Eine Kontrolle sollte durchgeführt werden, da Substrate auch Artefakte erzeugen können. Testen Sie Ihr spezifisches Puffersystem und Flussprotokoll immer mit dem bloßen SSM auf Artefakte, bevor die Proteinprobe hinzugefügt wird. Nach der Zugabe der Proteinprobe können Kontrollmessungen mit Lösungen durchgeführt werden, die Nichtsubstrate enthalten, die strukturell dem Substrat ähnlich sind.

Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, das Substrat mit Hilfe von Liposomen oder Membranfragmenten ohne das interessierende Protein auf Artefakte zu testen. Sie können Ihren Lösungen auch Inhibitoren hinzufügen oder sie pipettieren. Nach dem Experiment direkt zum Ausgang des Vete zur Messung der Transportersignalhemmung verschwinden die proteinspezifischen Signale, so dass nur noch Lösungsaustauschartefakte übrig bleiben.

Das Proteinsignal kann dann leicht korrigiert werden. Stellen Sie sicher, dass der Verlust von absorbiertem Prot, Liposomen oder Proteinabbau Ihre Messung nicht beeinflusst. Durch wiederholte Kontrollmessungen unter identischen Bedingungen ist ein Signaldurchlauf von bis zu 20% akzeptabel und kann durch Annahme einer linearen Zeitabhängigkeit des Rundlaufs korrigiert werden.

Dieser Aufbau ist das Ergebnis von 20 Jahren technischer Entwicklung in unserem Labor. Darüber hinaus sind spezialisierte Systeme mit höherer Timer-Lösung für die kinetische Analyse und geringerem Lösungsverbrauch für teure Substrate erhältlich. Für das Wirkstoffscreening setzen wir vollautomatische Setups mit höherem Durchsatz ein.

Bisher wurden mehr als 20 Transporter mit dieser Methode charakterisiert. Dazu gehören Transport-APAs, Atmungskettenkomplexe, Kühltransporter, Wärmetauscher und sogar Eisenkanäle. Wenn Sie also nicht in der Lage sind, Ihr Problem mit der Standard-Elektrophysiologie zu lösen, sollten Sie stattdessen die Elektrophysiologie von SS Mase in Betracht ziehen.