Ein Zebrafisch Modell des Diabetes mellitus und Stoffwechselkrankheiten Speicher

Metabolic Speicher ist das Phänomen, mit dem diabetischen Komplikationen fortbestehen und Fortschritte ungehinderten auch nach euglycemia pharmazeutisch erreicht. Hier beschreiben wir eine Diabetes mellitus Zebrafisch Modell, das einzigartig ist, dass es ermöglicht die Prüfung der mitotisch übertragbare epigenetische Komponenten des metabolischen Speicher

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Typ-1-Zebrafischmodell für Diabetes mellitus zu generieren, das zur Entdeckung der molekularen Grundlagen von Diabetes mellitus-Komplikationen und vor allem zur Bestimmung der genetischen Basis für deren Persistenz verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Hyperglykämie mit einer Reihe von Injektionen des diabetogenen Medikaments STZ induziert und der Fisch bei reduzierter Temperatur inkubiert wird. Als nächstes wird nach drei Wochen der Nüchternblutzuckerspiegel bestimmt, um sicherzustellen, dass der hyperglykämische Zustand induziert wurde, und das Medikament wird abgesetzt, um die Erholung der Betazellen einzuleiten.

Dann wird die Schwanzflosse amputiert und kann sich regenerieren, um genetisch übertragbare Bestandteile des metabolischen Gedächtnisses zu isolieren und potenziell komplizierende Faktoren des vorherigen hyperglykämischen Milieus zu entfernen. Schließlich wird ein Flossenregenerationsassay durchgeführt, um eine anhaltende Verringerung der Flossenregeneration zu dokumentieren und induzierte Veränderungen im durchtrennten Gewebe über einen interessierenden Assay zu identifizieren. Der Hauptvorteil des diabetischen Zebrafischmodells gegenüber bestehenden besteht darin, dass das metabolische Gedächtnis in einem echten U-glykämischen Umgebungssommer untersucht werden kann, wie es bei Patienten nach einer Bauchspeicheldrüsentransplantation der Fall wäre.

Wir gehen davon aus, dass das Modell für die Entdeckung der epigenetischen Modifikationen verwendet wird, die dem metabolischen Gedächtnis und der Persistenz von diabetischen Komplikationen zugrunde liegen. Um Zebrafische mit Diabetes mellitus zu erzeugen, bereiten Sie ein Auffangbecken mit normalem Fischwasser und ein Anästhesiebecken mit Fischwasser mit einer Verdünnung von zwei Phenoxyethanol von eins bis 1000 unter einem Abzug vor. Bereiten Sie eine 0,3%ige Lösung von STREPTOZOTOCIN oder STZ vor, indem Sie sechs Milligramm STZ zu zwei Millilitern 0,09% Natriumchlorid hinzufügen und die Lösung sofort in einem separaten Röhrchen auf Eis legen. Aliquot Sie genügend Kochsalzlösung zur Kontrolle.

Die Fische füllen eine halbe CC-Spritze, die mit einer 27-1/2-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit der STZ- oder Kontrolllösung, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Betäuben Sie einen einzelnen Fisch, indem Sie ihn in Narkosewasser legen und etwa ein bis zwei Minuten warten, bis die Schwimmbewegung aufhört. Sobald der Fisch betäubt ist, legen Sie ihn kurz auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser aufzunehmen, setzen Sie den Fisch dann in ein Ausweichboot und wiegen Sie ihn.

Legen Sie den Fisch anschließend auf eine feste Unterlage. Führen Sie dann die Nadel über die Fase hinaus in die hintere Seite des ventralen Peritoneums ein und injizieren Sie nach der Injektion entweder 0,35 Milligramm pro Gramm TZ oder eine gleichwertige Menge Kontrolllösung in die Bauchhöhle des Fisches. Setzen Sie den Fisch in den Auffangwassertank und überwachen Sie ihn auf normale Schwimmaktivität.

Nachdem Sie genügend Fische für das Experiment injiziert haben, setzen Sie sie in normale Lebensbecken um und halten Sie sie auf einer Temperatur von 22 bis 24 Grad Celsius. Die reduzierte Temperatur ist entscheidend für eine effiziente Induktion von Hyperglykämie, um einen anhaltenden Zustand sehr hoher Hyperglykämie zu induzieren, befolgen Sie einen Zeitplan mit häufigen Injektionen während der Induktionsphase, gefolgt von wöchentlichen Erhaltungsinjektionen, wie hier gezeigt, um Blut zu sammeln. Zur Bestimmung der FBGL ist für jede Blutprobe, die fünf Mikroliter normale Kochsalzlösung enthält, ein markiertes PCR-Röhrchen vorzubereiten.

Nachdem Sie den Fisch betäubt haben, tupfen Sie das überschüssige Wasser ab, legen Sie den Fisch auf einen Objektträger und entfernen Sie mit einem Skalpell den Kopf an der Basis des Operculoms, sammeln Sie das Blut, das auf dem Objektträger freigesetzt wird, und geben Sie es schnell in das PCR-Röhrchen mit steriler, normaler Kochsalzlösung, pipettieren Sie auf und ab, um sicherzustellen, dass das Blut nicht sofort gerinnt, legen Sie die Probe auf Eis. Bestimmen Sie das Volumen der Blutprobe, indem Sie das Gesamtvolumen der Flüssigkeit im Röhrchen messen und die fünf Mikroliter Kochsalzlösung abziehen. Übertragen Sie fünf Mikroliter des verdünnten Blutes aus jedem PCR-Röhrchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen und verwenden Sie das Quantenchrom-Glukose-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers, um die Blutzuckerkonzentration zu bestimmen.

Nachdem Sie einen Fisch betäubt haben, legen Sie ihn in eine Petrischale und verwenden Sie unter einem Präparierskop ein steriles Skalpell der Größe 10, um die Coddle Flosse zu amputieren, indem Sie eine gerade Linie proximal zum ersten Verzweigungspunkt der Lipidluftröhre für die regenerative Wachstumsphase des Assays schneiden. Setzen Sie den Fisch bei 33 Grad Celsius in ein Auffangbecken, um die regenerierenden Flossen abzubilden. Nachdem Sie einen Fisch betäubt haben, spreizen Sie die Flosse so, dass sie vollständig ausgefahren ist, und verwenden Sie ein Präparierfernrohr, das mit einer Kamera und der NIS-Element-Software ausgestattet ist.

Sammeln Sie Bilder mit einer vergrößerungsfachen Vergrößerung, um das regenerative Wachstum zu messen. Drucken Sie die Bilder aus und verwenden Sie die Image J-Software und einen Zeichenblock, um den gesamten Bereich des neuen Wachstums zu verfolgen, um die Genauigkeit der Nachzeichnung zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass keine Schatten oder Wassertröpfchen vorhanden sind, und führen Sie jede Messung fünfmal durch, um den Durchschnitt zu berechnen.

Um die Messungen zu normalisieren, messen Sie die Länge der Amputationsstelle entlang der dorsalen ventralen Achse und dividieren Sie die zuvor bestimmte Fläche durch diese Messung. Nachdem Sie eine Gruppe von DM-FISCHEN und deren Kontrollen nach 21 Tagen generiert haben, bestimmen Sie den FBGL für eine Teilmenge der Gruppe und teilen Sie die DM-Fische für die Dauer des Experiments in zwei Untergruppen auf. Setzen Sie die wöchentlichen STZ-Injektionen für eine der Gruppen fort, während die DM-Kontrollen für die zweite Gruppe die STZ-Injektionen beenden und den Fisch bei normaler Temperatur inkubieren.

Innerhalb von 14 Tagen stellen diese Zebrafische durch die Regeneration der Bauchspeicheldrüse die normale Insulin- und Glukosekontrolle im Blut wieder her. Diese Fische werden jetzt als metabolisches Gedächtnis oder MM bezeichnet, Fische amputieren am Tag 30 nach der Entfernung des Medikaments die Futterflossen von Kontroll-DM- und MM-Fischen, wie weiter oben in diesem Video gezeigt, um das Wachstum von metabolischem Gedächtnisgewebe zu ermöglichen. Bringen Sie den Fisch an Tag 60 für 30 Tage zur Flossenregeneration in den normalen Wasserzustand zurück.

Führen Sie eine zweite Amputation innerhalb des Gewebes durch, das im Zeitraum von 30 bis 60 Tagen regeneriert wurde, und führen Sie einen Hautflossen-Regenerationstest durch, isolieren Sie das Gewebe und führen Sie einen Assay von Interesse durch. Diabetische Zebrafische vom Typ 1 zeigen nicht nur die bekannten Nebenkomplikationen der Retinopathie und Nephropathie, sondern weisen auch eine zusätzliche Komplikation auf: eine beeinträchtigte Kotschelfenregeneration, wie hier 72 Stunden nach der Amputation zu sehen ist. Diese Komplikation besteht aufgrund des metabolischen Gedächtnisses bei Fischen, die nach einer hyperglykämischen Periode die normale Glukosekontrolle wiederhergestellt haben, wie hier gezeigt, zeigen die mm-Zebrafische ein Defizit in der Flossenregeneration von etwa 40% im Vergleich zu Kontrollfischen, und die Beeinträchtigung wurde bereits 150 Tage nach der Amputation beobachtet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den hyperglykämischen Zustand beim Zebrafisch initiieren, den Nüchternblutzuckerspiegel messen, Flossenregenerationsstudien durchführen und letztendlich metabolische Gedächtnisfische generieren können.