Name: Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca 2 + Transienten und Membrane Currents (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Lernen Sie die Isolierung humaner Vorhofmyozyten für simultane Messungen von Calciumtransienten und Membranströmen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die kardiale Physiologie und Erkrankungen wie Vorhofflimmern.

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Darüber hinaus danken wir den Herzchirurgen an der Universität Heidelberg für die Bereitstellung von menschlichen Vorhofgewebe und Claudia Liebetrau, Katrin Kupser und Ramona Nagel für ihre ausgezeichneten technischen Support. Besonderer Dank gilt auch Andy W. Trafford für seine Anregungen und Ratschläge während der Errichtung der Ca 2 + transiente Messungen. Die Autoren wollen ihre tiefste Dankbarkeit an die Mitglieder der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie (Leitung: Ursula Ravens) Ausdruck der TU Dresden für die Gelegenheit boten sie uns in die grundlegenden Techniken und Fertigkeiten in zelluläre Elektrophysiologie und cardiomyocyte Isolierung zu lernen. Die Autoren Forschung wird von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Do769/1-1-3), das Bundesministerium für Bildung und Forschung im Rahmen des Kompetenznetzes Vorhofflimmern (01Gi0204) und das Deutsche Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, der Europäischen Union unterstützt durch die Euischen Netzwerk für Translationale Forschung bei Vorhofflimmern (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, groß angelegte Projekt Integration, Vorschlag Nr. 261057) und der europäisch-nordamerikanischen Vorhofflimmern Research Alliance (ENAFRA) Erteilung Fondation Leducq (07CVD03). Die schematische Übersicht in der Videodatei gezeigt wurde mit Hilfe von Servier ärztlichen Kunst.

Experimentelle Protokolle müssen von der lokalen Ethikkommission genehmigt werden und alle Patienten müssen eine schriftliche Einverständniserklärung geben. Unsere Forschung wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg (# 2011-216N-MA) zugelassen und wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung. 0. Gewinnung von menschlichem Vorhofgewebe Im Routinebetrieb Kanülierung Verfahren bei Patienten mit Operationen am offenen Herzen für Herz-Lungen-Bypass-Operation, wird die Spitze des rechten Herzohr Regel entfernt und zur Isolierung von atrialen Kardiomyozyten verwendet werden. Nach Exzision der Gewebeprobe wird sofort in einem 50 ml Falcon-Röhrchen mit sterilem Ca 2 +-freien übertragen Transportlösung mit 2,3-butanedione Monoxim (Tabelle I; BDM, kontraktilen Inhibitor, verhindert myocyte contracture). Mit Transportzeiten zwischen 30 und 45 min, haben wir nicht erkennen, einen klaren Vorteil von Kühl-oder Sauerstoffversorgung sowohl in Bezug auf Anzahl und Qualität der isolierten atrialen Kardiomyozyten. Im allgemeinen Transport zum Labor sollte so schnell wie möglich. Allerdings, wenn längere Transportzeit nicht vermieden werden kann, Transport bei 4 ° C in sauerstoffhaltigen Lösung könnte von Vorteil sein. 1. Prearrangements <ol><li> Schalten Sie den Thermostatenkreislauf, der die Temperatur der ummantelten Becherglas (Tabelle II) steuert. Achten Sie darauf, die Temperatur innerhalb des Bechers beträgt 37 ° C. Das Becherglas wird mit einem Glasdeckel, um eine konstante Temperatur im Becherglas während der gesamten Trennung aufrechtzuerhalten. </li><li> Wiegen Sie die Collagenase I und Protease XXIV in drei Bechergläser und speichern Sie es bei Raumtemperatur. Die Enzyme werden unmittelbar vor der Anwendung verdünnt werden. </li><li> Shop 20 ml Ca 2 + freier Lösung in einer Petrischale bei 4 ° C. </li><li>Shop 250 ml von Ca 2 + freier Lösung in einem Wasserbad bei 37 ° C </li></ol> 2. Reinigung des Tissue <ol><li> Übertragen Sie die Gewebeprobe zusammen mit dem Transport-Lösung in eine Petrischale (~ 10 cm Durchmesser) und entfernen Fettgewebe grob mit einer Schere. </li><li> Wiegen Sie die Gewebeprobe. Zwischen 200 und 600 mg sind für die Zell-Isolierung verwendet. Der verbleibende Gewebe in flüssigem Stickstoff für eine spätere biochemische Analyse eingefroren. </li><li> Übertragen Sie die Gewebeprobe in die Petrischale mit 20 ml Ca 2 + kostenlose Lösung bei 4 ° C (siehe Schritt 1.3) und hacken die Gewebeprobe in kleine Stücke von etwa 1 mm 3 in der Größe. </li><li> Die folgenden Schritte sollten bei 37 ° C und unter ständiger Begasung mit 100% O 2 ausgeführt werden. Eine Pipettenspitze auf die Sauerstoff-Schlauch gelegt werden, um starke Blasenbildung zu vermeiden und kontinuierliche Luftstrom erzeugen. </li><li> Übertragen Sie die Gewebe Stücke zusammen mit dem Ca 2 +-freie Lösung inder ummantelten Becherglas und rühren Sie vorsichtig für etwa 3 min mit einem magnetischen Rührstab. </li><li> Stoppen Rühren und lassen Sie die Stücke Gewebe niederlassen für ein paar Sekunden. Vorsichtig belasten den Überstand durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas mit einer Pinzette. </li><li> Refill das Becherglas mit Ca 2 + kostenlose Lösung und wiederholen Sie den Waschschritt 2.4 und 2.5 zwei mal. </li></ol> 3. Erste enzymatische Verdauung <ol><li> Re-suspend die Gewebe Brocken mit 20 ml Enzymlösung E1 (Tabelle I), die Kollagenase und Protease und vorsichtig umrühren für 10 min. </li><li> In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20 &amp;mgr; M Ca 2 + erhalten. </li><li> Nach 35 min Belastung der Überstand vorsichtig durch ein Nylonnetz (200 um, Tabelle II) in einer Weise, dass die meisten der Stücke Gewebe im Becherglas verbleiben. Zurück Restregnete Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas. </li></ol> 4. Second enzymatische Verdauung <ol><li> Resuspendieren der Gewebe Brocken wieder mit 20 ml Enzymlösung E2 mit Kollagenase ich nur (Tabelle I). In 40 ul 10 mM CaCl 2-Lösung sofort, um eine Endkonzentration von 20 &amp;mgr; M Ca 2 + erhalten. </li><li> Während der zweiten Verdauung Verwendung Schere weiter zu hacken Gewebe Blutgerinnsel gelegentlich. </li><li> Nach 5 min eine Probe mit einer Pasteurpipette auf die Dissoziation von Zellen zu überprüfen. Wiederholen Sie diese alle 2-3 min bis stabförmigen, gestreift Kardiomyozyten erscheinen. </li><li> Stoppen Rühren und damit die Gewebe Brocken, um sich niederzulassen für ca. 20-30 sek. </li><li> Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube A). Bringen Sie die verhaltene Gewebe Brocken aus dem Netz in das Becherglas. </li><li> Re-suspend die Gewebe Brocken im Becherglas mit 20 ml storage Lösung (Tabelle I) und 10 weitere distanzieren die Zellen durch vorsichtiges mechanisches Verreiben mit 20 ml serologische Pipette mit Spender. Versuchen Sie, Blasenbildung zu vermeiden, da Blasen nachteilig auf das Überleben der Zelle und Qualität sind. </li><li> Der Stamm der Überstand vorsichtig durch ein feinmaschiges (200 um, Tabelle II) in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (Tube B). </li></ol> 5. Abschließende Vorbereitung und Einstellung von Final Ca 2 +-Konzentration <ol><li> Zentrifuge sowohl Falcon-Röhrchen A und B (siehe Schritt 4.5 und 4.7) bei 95 g für 10 min. </li><li> Entfernen Sie den Überstand von beiden Rohre sorgfältig durch Aspiration. Achten Sie darauf, das Pellet stören. Überstand verwerfen. </li><li> Re-suspend sowohl Pellets in 1,5 ml-Storage-Lösung (Tabelle I) jede (Raumtemperatur). </li><li> Fügen Sie zwei mal 7,5 ul 10 mM CaCl 2-Lösung in jedes Falcon und vorsichtig umrühren. Inkubieren für 10 min nach jedem Schritt. </li><li>In 15 ul 10 mM CaCl 2-Lösung, um eine endgültige Ca 2 +-Konzentration von 0,2 mM zu erhalten. </li></ol> 6. Laden von Myozyten mit dem fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 AM (Abbildung 1) <ol><li> Übertragen 1,5 ml Zellsuspension (Röhrchen A und / oder das Rohr B) in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Röhrchen). </li><li> Die folgenden Schritte sollten unter Berücksichtigung der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Ca 2 +-Indikator Fluo-3 ausgeführt. </li><li> Lösen Sie 50 ug der Membran durchlässig Acetoxymethylester Derivat Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabelle III) in 44 ul der Pluronic F-127 (Tabelle III) stock Lösung (20% w / v in wasserfreiem DMSO) zu erhalten eine 1 mM Fluo-03.00 Lager-Lösung, die bei -20 ° C für höchstens 1 Woche gelagert werden können. </li><li> In 15 ul der Fluo-03.00 Stammlösung der Mikrozentrifugenröhrchens mit 1,5 ml Zellsuspension (siehe Schritt 6.1) und agitierensorgfältig. </li><li> Inkubation der Zellsuspension für 10 min in einem optisch undurchsichtige Box. </li><li> Kurz bei etwa 6.000 rpm zentrifugiert. </li><li> Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 ml Badlösung (Tabelle IV). </li><li> Verlassen Sie die Zellsuspension für etwa 30 min für Entesterung vor Beginn mit Experimenten. </li></ol> 7. Gleichzeitige Patch-Clamp-und Epifluoreszenz Ca 2 + Messungen Seit dem Patch-Clamp-Messungen sind nicht das große Thema dieser Bewertung verweisen wir den interessierten Leser auf andere Publikationen Bereitstellung eines genauere Beschreibung dieser Technik. 11-14 Aus Gründen der Vollständigkeit stellen wir eine kurze Zusammenfassung eines Protokolls zu messen Aktionspotentiale oder L-Typ-Ca 2 +-Ströme, die beide bei gleichzeitiger Ca 2 +-Transienten-Aufnahmen. Bei Versuchen Myozyten werden bei 37 ° C mit Bad Lö superfundiertauf (Tabelle IV) mit einem schnellen Perfusion System (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Für Voltage-Clamp-Experimente, K +-Ströme durch Zugabe von 4-Aminopyridin (5 mmol / l) und BaCl 2 (0,1 mmol / L) der Badlösung blockiert. Borosilikatglas Mikroelektroden verwendet werden und sollte kippen Widerstände von 2-5 MOhm haben, wenn sie mit Pipette Lösung (Tabelle V) gefüllt. Neben der Fluo-3 AM des Myozyten Laden (siehe Schritt 6) wird Fluo-3 auch in der Pipette Lösung (Tabelle V) enthalten. Fluoreszenz wird bei 488 nm angeregt und emittiert Licht (&lt;520 nm) auf [Ca 2 +] i vorausgesetzt umgewandelt <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> wo k d = Dissoziationskonstante von Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3-Fluoreszenz;. F max = Ca 2 +-gesättigten Fluoreszenz am Ende jedes Experiments 12 erhaltenen beiden elektrischen Signalen und epifluoreszenten Ca 2 +-Signale werden gleichzeitig erfasst. Aktionspotentiale werden in 0,5 Hz in Current-Clamp-Modus mit 1 ms Stromimpulse 1.2x Schwelle Stärke stimuliert. L-Typ-Ca 2 +-Ströme werden in Voltage-Clamp-Modus mit einem Haltepotential von -80 mV und eine 100-ms-Impulses Rampe bis -40 mV, die schnellen Na +-Strom, gefolgt von einer 100-ms gemessen inaktivieren Test-Impuls auf +10 mV bei 0,5 Hz liegt.

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</ol>

Worthington Biochemical Corp unterstützte diese Veröffentlichung durch Abdecken Herstellungskosten Videodatei. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerhebung und-analyse, Entscheidung zu veröffentlichen, oder Vorbereitung des Manuskripts.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung von humanen atrialen Myozyten von rechts Herzohren von Patienten mit Operationen am offenen Herzen erhalten. Um diese Myozyten für Messungen von zytosolischen Ca 2 + verwenden wir angepasst ein zuvor beschriebenes Verfahren 4-11 durch Weglassen EGTA aus der Aufbewahrungslösung. Bereits im Jahr 1970 wurde beobachtet, dass, obwohl Myozyten in Gegenwart von Ca 2 + während der Verdauung zerfallen, alle von ihnen in Kontraktur und nicht lebensfähig. 16,17 Daher waren, wird Zellisolation in Ca 2 +-freie Lösung durchgeführt. Allerdings ist die Wiedereinführung von physiologischen Konzentrationen von Ca 2 + in Folge rasch Ca 2 +-Einstrom und Zelltod. Dies wurde als die Ca 2 + Paradox Phänomen, das ursprünglich in perfundierten Herzen von Zimmerman und Hulsman beobachtet wurde beschrieben worden. 18 Änderungen der Isolation Medien einschließlich der Verringerung des pH-Wertes auf 7,0, &lt;sup&gt; 19 Zusatz von Taurin 20 oder kleiner Mengen von Ca 2 + (siehe Schritt 3.2 und 4.1), 21 sowie die Lagerung von isolierten Myozyten in EGTA enthält storage-Lösung 22 vorgeschlagen worden, um die Ca 2 + Paradox. 17 zu verhindern Es ist jedoch bekannt, daß Ca 2 + Pufferung durch EGTA verringert die Amplitude des L-Typ-Ca 2 +-induzierte Ca 2 + Transienten Amplituden und die Ergebnisse in einem zweiphasigen Zerfall der Ca 2 + Transienten ist. 23 Daher verzichtet man EGTA während des gesamten Prozesses in Isolation, um Ca 2 +-Transienten mit typischen Eigenschaften und monophasischen zerfällt zu erhalten. Um die Zellen von der Ca 2 + schützen Paradoxon erhöhten wir die endgültige Ca 2 +-Konzentration der Aufbewahrungslösung schrittweise bis 0,2 mM. Die Wahl von Kollagenase ist wahrscheinlich der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche myocyte Isolation. Konventionelle collagenases sind Rohpräparaten von Clostridium histolyticum erhalten und enthält Kollagenase zusätzlich zu einer Reihe von anderen Proteinasen Polysaccharidasen und Lipasen. Auf der Grundlage ihrer allgemeinen Zusammensetzung Kollagenasen sind in verschiedene Typen unterteilt. Worthington 24 Kollagenase Typ I und II wurden erfolgreich für die Isolierung von menschlichen Vorhofmyozyten. 4-10,15,25-30 In unserem vorliegend beschriebenen Protokoll verwendet, empfehlen wir die Verwendung von Kollagenase Typ I, obwohl wir waren auch in der Lage, akzeptable Mengen an lebenden Zellen mittels Collagenase Typ II zu erhalten. Selbst innerhalb eines einzelnen Collagenase Typ gibt es einen signifikanten Charge zu Charge Schwankungen in Bezug auf die Enzymaktivitäten. Diese Variationen erfordern eine sorgfältige Batch Auswahl und Prüfung der verschiedenen Chargen zu Isolation Verfahren zu optimieren. Die Online verfügbar Batch-Werkzeug aus Worthington Biochemical Corp ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) kann verwendet werden, um verfügbaren Chargen mit einer Zusammensetzung, die gezeigt hat, dass für die Isolierung der menschlichen Vorhofmyozyten finden werden. Derzeit verwenden wir Kollagenase Typ I mit 250 U / mg Kollagenase-Aktivität, 345 U / mg Caseinase Aktivität, 2,16 U / mg Clostripainaktivität und 0,48 U / mg Trypsin-Aktivität (lot # 49H11338). Die erhaltenen Zellen unter Verwendung des in diesem Manuskript beschrieben innerhalb von 8 Stunden kann für Patch-Clamp-Technik, Ca 2 + Transienten Messungen und einer Kombination von beiden. 15 zusätzlich verwendet werden, können diese Zellen Messungen der zellulären Kontraktion als Reaktion auf ein elektrisches Feld Stimulation oder elektrische Stimulation mit der Patch-Clamp-Pipette (unveröffentlichte Beobachtungen).

Studieren elektrophysiologischen Eigenschaften von kardialen Ionenkanälen mit der Patch-Clamp-Technik und der Erforschung der zellulären Ca 2 + Handhabung Anomalien erfordern isolierten Herzmuskelzellen. Diese werden in der Regel im Anschluss an die in vitro Exposition von Herzgewebe Proben Verdauungsenzyme (Kollagenase, Hyaluronidase, Peptidase usw.) erhalten. Seit dem ersten Bericht der Isolation von lebensfähigen Herzmuskelzellen 1955 2 eine große Menge von Protokollen entwickelt worden, um einzelnen atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus verschiedenen Arten, darunter Maus, Ratte, Kaninchen, Hund, Meerschweinchen und Menschen ernten. In diesem Beitrag werden wir auf Isolierung von humanen Vorhofmyozyten konzentrieren. In Bezug auf Verfahren zur Isolierung von Myozyten aus anderen Spezies verweisen wir auf die &quot;Worthington Gewebedissoziation guide&quot; von Worthington Biochemical Corp, USA (vorausgesetzt <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al. 3 beschrieben Hier haben wir einen Schritt-für-Schritt-Beschreibung einer Technik, die von einer zuvor veröffentlichten Verfahren geeignet ist, bereitzustellen, um abgeleitet erhalten Vorhofmyozyten eignet sich nicht nur für die Patch-Clamp-Experimente als auch für die gleichzeitige intrazellulären Ca 2 +-Messungen. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Kollagenase I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Protease XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 7,40</td></tr><tr><td>angepasst mit</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transportlösung&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-freie Lösung&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymlösung E1 und E2&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Lagerungslösung&lt;/em&gt;: 1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">Konzentrationen in mM, sofern nicht anders angegeben. BDM, 2,3-Butandionmonoxim. *Protease XXIV ist nur in der Enzymlösung E1 enthalten.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle I. Lösungen.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylongewebe (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Deutschland</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Gewärmter Reaktionskolben</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle II. Spezifische Ausrüstung.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (spezielle Verpackung)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle III. Substanzen zur Beladung der Kardiomyozyten mit Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-Aminopyridin*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 7,35</td></tr><tr><td>angepasst mit</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Badelösung&lt;/em&gt;: 1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle IV. Badelösung für das Patch-Clamp-Verfahren.&lt;/strong&gt; *4-Aminopyridin und BaCl wurden nur für Spannungs-Clamp-Experimente verwendet.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-Aspartat-K+-Salz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Pipettensolution&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Pipettensolution&lt;/em&gt;: 0,02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Pipettensolution&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Pipettensolution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Pipettensolution&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Pipettensolution&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Pipettensolution&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Pipettensolution&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7,20</td></tr><tr><td>angepasst mit</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabelle V. Pipettensolution für das Patch-Clamp-Verfahren*. &lt;/strong&gt;*An den Experimenttagen wird die Pipettensolution bis zur Verwendung auf Eis gelagert. **Fluo-3 wird an den Experimenttagen aus einer 1 mM Stammlösung zugegeben.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung humaner vorhofmyozyten für gleichzeitige messungen von ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; transienten und membrane currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Das Studium der elektrophysiologischen Eigenschaften von kardialen Ionenkanälen mit der Patch-Clamp-Technik und der Erforschung von Herz-zellulären Ca 2 + Umgang mit Anomalien erfordert isolierten Herzmuskelzellen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, Myozyten von Patienten mit diesen Techniken zu untersuchen eine wertvolle Voraussetzung, um die molekulare Basis von Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern (AF) aufzuklären. 1 Hier ein Verfahren zur Isolierung von humanen atrialen Myozyten, die für beide beschreiben Patch-Clamp-Technik und gleichzeitige Messungen der intrazellulären Ca 2 +-Konzentrationen. Zuerst werden das rechte atriale Anhängsel von Patienten Operation am offenen Herzen erhalten in kleine Stücke Gewebe (&quot;Chunk-Methode&quot;) zerkleinert und gewaschen in Ca 2 +-freien Lösung. Dann werden die Gewebe Brocken werden in Kollagenase und Protease verdaut haltigen Lösungen mit 20 uM Ca 2 +. Danach werden die isolierten Myozyten harvested durch Filtration und Zentrifugation des Gewebes Suspension. Schließlich wird der Ca 2 +-Konzentration in der Zelle Aufbewahrungslösung angepasst schrittweise bis 0,2 mm. Diskutieren wir kurz die Bedeutung Ca 2 + und Ca 2 + Pufferung bei der Isolierung Verfahren und auch Vertreter Aufnahmen von Aktionspotentialen und Membranströme sowohl bei gleichzeitiger Ca 2 + Transienten Messungen in diesen isolierten Myozyten durchgeführt.

2A zeigt drei repräsentative Beispiele aus isolierten Menschenrecht Vorhofmyozyten. Um die Zellausbeute wir Pipette 10 ul Zellsuspension (Schritt 5.5) auf einem Objektträger CellFinder (quantifizieren <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Gemittelte Zellausbeuten in 2B zeigen deutlich, dass es eine Tendenz zu niedrigeren Zellausbeuten bei chronischen AF (CAF) Patientenproben (Röhre A: 16,5 ± 3,1 Zellen/10 ul (n = 29) vs 5,1 ± 2,3 Zellen/10 ul (n = 10) in SR und CAF, p &lt;0,05; Rohr B: 17,9 ± 3,9 Zellen/10 ul (n = 29) im Vergleich zu 5,9 ± 2,0 Zellen/10 ul (n = 9) in SR und CAF, , p = 0,107). Repräsentative Beispiele für Action-Potential-Messungen und gleichzeitige Aufnahmen von zytosolischen Ca 2 + Transienten in Abbildung 3 dargestellt. In etwa 90% der untersuchten Zellen, ter Action-Potential ausgelöste Ca 2 +-Freisetzung verursacht klare und regelmäßige Kontraktionen Zelle. Wie bereits berichtet, lag die Ruhemembranpotenzial, die ein akzeptierter Indikator für die Integrität der Zelle ist, etwa -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 Myozyten / Patienten) und -77.7 ± 1,8 mV (n = 19/8 Myozyten / Patienten ) in SR und CAF (p&gt; 0,05). 15 Abbildung 4 zeigt repräsentative gleichzeitige Aufnahmen von spannungsabhängigen L-Typ-Ca 2 +-Ströme und cytosolischen Ca 2 +-Transienten. Verwendung des nicht-selektiven β-Adrenozeptor-Agonisten Isoprenalin (1 uM) erhöht Amplituden der beiden I Ca, L und zytosolischen Ca 2 + Transienten, was intakte β-adrenergen Signaltransduktion. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Fild 1. Flussdiagramm der Myozyten Fluo-03.00 Be-Protokoll (siehe Schritt 6.1-6.5). m / v, Masse / Volumen. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Abbildung 2. A, Isoliert Menschenrecht Vorhofmyozyten nach einer Stunde in Storage-Lösung. B, Mittelwert ± SEM der Zelle Ausbeute in 10 ul Zellen in Storage-Lösung gezählt (siehe Schritt 5.5). n bezeichnet die Anzahl der Vorbereitung innerhalb jeder Gruppe. * P &lt;0,05. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Aufnahmen von Action-Potential ausgelöste Ca 2 +-Transienten (CAT) in einer atrialen Myozyten von einem Sinusrhythmus und chronic Vorhofflimmern Patienten. Top: Injected Membran Strom (I M) zur Stimulation (0,5 Hz) verwendet. Unten: Gleichzeitige Aufnahme von Membran-Potential (V M), und löste Katze (unten). (Neu gezeichnet mit Erlaubnis von Voigt et al. 2012) 15 <img alt="Fig. 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Aufnahmen der Isoprenalin (1 uM) Wirkung auf L-Typ-Ca 2 +-Strom ausgelöste Ca 2 +-Transienten (CAT) in einer atrialen Myozyten von einem Sinusrhythmus und einer chronischen Vorhofflimmern Patienten. Top: Voltage-Clamp-Protokoll (0,5 Hz). Unten: Gleichzeitige Aufnahme des Netto-Membran (I M), überwiegend aufgrund einer L-Typ-Ca 2 +-Strom (Mitte) und ausgelöst Katze (unten). (Neu gezeichnet mit Erlaubnis von Voigt,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabelle 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tabelle I. Lösungen. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabelle 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tabelle II. Ausstattung. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabelle 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tabelle III. Stoffe für das Laden von Myozyten mit Fluo-3 Uhr. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabelle 4" fo:content-width = &quot;2,5 Zoll&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tabelle IV. Bath Lösung für Patch-Clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabelle 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Tabelle V. Pipette Lösung für Patch-Clamp *.

Wir beschreiben die Isolierung von humanen Vorhofmyozyten die für die intrazelluläre Ca verwendet werden kann<sup&gt; 2 +</sup&gt; Messungen in Kombination mit elektrophysiologischen Patch-Clamp-Studien.

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienten und Membrane Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane atriale Myozyten zu isolieren, die für gleichzeitige Messungen von Kalziumtransienten und Membranströmen geeignet sind. Die rechtsatriale Probe wird von Patienten gewonnen, die sich einer offenen Herzoperation unterziehen, und schnell transportiert, um mit dem Verfahren zu beginnen. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gewebe zu reinigen und in kleine Gewebestücke zu schneiden.Der zweite Schritt besteht aus einer zweifachen enzymatischen Verdauung des Gewebes mit proteolytischen Enzymen, die zu isolierten atrialen Kardiomyozyten führt. Der letzte Schritt umfasst das Beladen der Kardiomyozyten mit einem kalziumempfindlichen fluoreszierenden Farbstoff. Letztendlich ermöglicht die kombinierte Anwendung der Epi-Fluoreszenzmikroskopie und der Patch-Clamp-Technik gleichzeitige Aufnahmen von Kalziumtransienten zusammen mit Membranströmen oder Aktionspotentialen.Diese Methode kann dazu beitragen, die molekulare Grundlage von Störungen der zellulären Kalziumhandhabung bei Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern zu verstehen. Die Demonstration der Methode erfolgt durch Claudia Lira, die leitende technische Assistentin unseres Labors. Das aus menschlichem Vorhofgewebe gewonnene Material von Patienten, die sich einer offenen Herzoperation zur Koronararterien-Bypass-Transplantation oder zum Ersatz der Mitralklappe unterziehen, sollte umgehend in einem Transportmedium ins Labor gebracht werden. Sobald sich das Gewebe im Labor befindet, überführen Sie die Gewebeprobe zusammen mit der Lösung in eine 10 cm-Dish. Entfernen Sie anschließend mithilfe einer Schere grob das Fettgewebe.Als Nächstes schwenken Sie die Gewebeprobe. Bewahren Sie zwischen 200 und 600 Milligramm für die Zellisolierung auf und frieren Sie den Rest in flüssigem Stickstoff für die biochemische Analyse ein. Überführen Sie das Gewebe für die Zellisolierung in eine Schale mit kalter calciumfreier Lösung und zerkleinern Sie das Gewebe in Stücke von einem Kubikmillimeter Größe, um das Gewebe zu waschen.Überführen Sie es zusammen mit der calciumfreien Lösung in den ummantelten Becher. Auf 37 Grad erwärmen. Sauerstoff über eine mit einer Pipettenspitze verschlossene Leitung zuführen, um starkes Blasen zu vermeiden.Rühren Sie das Gewebe vorsichtig etwa drei Minuten lang mit einem magnetischen Rührstab um. Anschließend lässt man das Gewebe absetzen. Gießen Sie nun vorsichtig das Überstand durch ein Nylonnetz mit 200 Mikron. Der größte Teil des Gewebes sollte im Becher verbleiben. Füllen Sie den Becher erneut mit erwärmter kalziumfreier Lösung bei 37 Grad auf. Bringen Sie anschließend die durch das Netz gefilterten Gewebestücke mit einer Pinzette in den Becher zurück und wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.Beginnen Sie diesen Teil des Verfahrens mit der Herstellung von 20 Milliliter erwärmter Enzymlösung E1 bei 37 Grad Celsius, die Kollagenase und Protease enthält. Filtern Sie die kalziumfreie Lösung vorsichtig nach dem letzten Waschschritt und resuspendieren Sie das gewaschene Gewebe in der E1-Lösung. Geben Sie das auf dem Netz gesammelte Gewebe zurück in den Becher.Rühren Sie die Suspension vorsichtig 10 Minuten lang. Fügen Sie dann 40 Mikroliter 10-Millimolar-Calciumchlorid hinzu und rühren Sie weitere 35 Minuten fort. Danach filtrieren Sie das Überstandsvolumen vorsichtig durch ein Nylonnetz.Der größte Teil des Gewebes sollte im Becher verbleiben. Bereiten Sie 20 Milliliter Enzymlösung E zwei, die nur Kollagenase eins enthält, vor und verwenden Sie diese, um den Becher erneut zu füllen. Geben Sie das auf dem Netz gesammelte Gewebe zurück in den Becher. Gegeben Sie dann sofort 40 Mikroliter einer 10-Millimolar-Lösung von Calciumchlorid während der zweiten Verdauung hinzu und zerschneiden Sie gelegentlich mit einer Schere Gewebeklumpen. Nach fünf Minuten entnehmen Sie eine Probe der Suspension, um die Dissoziation der Zellen unter dem Mikroskop zu überprüfen. Entnehmen Sie alle zwei bis drei Minuten weitere Proben, bis deutlich sichtbare, stabförmige quergestreifte Kardiomyozyten erkennbar sind.Dann die R&uuml;hrung stoppen und das Gewebe absetzen lassen. Sobald es abgesetzt hat, vorsichtig das &Uuml;berstand durch ein Nylonnetz in ein 50-Milliliter-Kunststoffr&ouml;hrchen abgie&szlig;en. Anschlie&szlig;end das Gewebe in 20 Milliliter Lagerungsl&ouml;sung suspendieren und die zur&uuml;ckgehaltenen Gewebest&uuml;ckchen vom Netz zur&uuml;ck in das Becherglas geben.Lösen Sie die Zellen durch schonende mechanische Pipettierung weiter auf. Verwenden Sie eine 20-Milliliter-Pipette und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Danach filtrieren Sie vorsichtig das Überstand durch ein Nylon-Netz, nach der Filtration zentrifugieren Sie beide Überstand-Sammlungen bei 90 5G für 10 Minuten.Um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie die Überstände durch Absaugen, ohne das Pellet zu stören. Suspendieren Sie jedes Pellet in 1,5 Milliliter Lagerungslösung bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 7,5 Mikroliter einer 10-Millimolar-Lösung von Calciumchlorid in jedes Röhrchen und warten Sie 10 Minuten.Fügen Sie dann weitere 7,5 Mikroliter Calciumchlorid hinzu und warten Sie weitere 10 Minuten. Nach der Wartezeit geben Sie ein drittes Volumen von 15 Mikrolitern 10-Millimolar-Calciumchlorid hinzu, um die endgültige Konzentration von Calciumchlorid in der Lösung auf 0,2 Millimolar zu bringen. Der Zweck dieser Isolation besteht darin, Zellen zu erhalten, die für intrazelluläre Calciummessungen geeignet sind.Daher ist es eine entscheidende Voraussetzung, Kalziumpuffer wie EGTA aus der Lagelösung auszuschließen. Überführen Sie 1,5 Milliliter der Zellsuspension in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die folgenden Schritte sollten unter Berücksichtigung der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Kalziumindikators durchgeführt werden.Flu O drei. Stellen Sie zunächst eine einmillimolare Flu O 3-Stocklösung her. Diese Lösung kann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.Fügen Sie anschließend 15 µL der Fluoh-3:00-AM-Stammlösung zur 1,5-mL-Zellsuspension hinzu. Vorsichtig mischen und die Suspension 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer lichtundurchlässigen Box inkubieren. Nach der Inkubation die Probe kurz bei etwa 6.000 U/min zentrifugieren.Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 Milliliter Badelösung. Lassen Sie die Zellsuspension vor Beginn der Experimente etwa 30 Minuten zur Desveresterung stehen. Fahren Sie anschließend mit simultanen Patch-Clamp- und Epi-Fluoreszenz-Kalziummessungen gemäß des beschriebenen Protokolls fort.Myozyten wurden aus atrialem Gewebe isoliert und auf einem Zählschieber unter dem Mikroskop quantifiziert. Die durchschnittlichen Zellausbeuten zeigen eindeutig eine Tendenz zu niedrigeren Zellausbeuten bei Proben von Patienten mit chronischem Vorhofflimmern. Mit Flu oh drei beladene Myozyten wurden im Strom-Klemm-Modus bei 0,5 Hertz stimuliert, um Aktionspotentiale auszulösen; etwa 90 % der untersuchten Zellen zeigten regelmäßige Kontraktionen.Als Reaktion auf diese Stimulation ermöglicht der Wechsel zur Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung der Aktionspotentiale auslösenden Kalziumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, die die zelluläre Kontraktion einleitet. Repräsentative Aufzeichnungen von Patienten mit Sinusrhythmus und Vorhofflimmern zeigen, dass sr. Patienten-Aktionspotentiale typischerweise eine Spitz-und-Kuppel-Form aufweisen, während eine Triangulierung und Verkürzung der Aktionspotentiale charakteristische Merkmale des atrialen Remodelings darstellen.Bei Patienten mit Vorhofflimmern zeigten gleichzeitig aufgezeichnete intrazelluläre Kalziumtransienten erhöhte diastolische Kalziumspiegel und verminderte Amplitude der Kalziumtransienten in Myozyten von Patienten mit Vorhofflimmern zur Aufzeichnung von L-Typ-Kalziumströmen. Kaliumströme wurden unter Verwendung von 4-Aminopyridin und Bariumchlorid blockiert. Die Zellen wurden im Spannungs-klemm-Modus bei 0,5 Hertz mit einem Haltepotential von minus 80 Millivolt stimuliert, wobei ein 100 Millisekunden langer Rampenimpuls auf minus 40 Millivolt und ein 100 Millisekunden langer Testimpuls auf 10 Millivolt appliziert wurden.Repräsentative Aufnahmen zeigen, dass die Vorhofflimmern mit einem verminderten L-Typ-Calciumstrom assoziiert ist. Auch hier war der diastolische Calciumspiegel erhöht, während die Amplitude des Calciumtransients niedriger war. Bei Vorhofflimmern.Die Anwendung des nichtselektiven Beta-Adrenozeptor-Agonisten Isopren erhöhte die Amplituden der L-Typ-Calciumströme und der zytosolischen Calciumtransienten. In beiden Gruppen deutet dies darauf hin, dass die Zellen eine intakte beta-adrenerge Signaltransduktionskaskade aufweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode hochwertige calciumtolerante Kardiomyozyten liefert, die für simultane Patch-Clamp- und Calciumtransienten-Messungen geeignet sind.Außerdem können die gewonnenen Myozyten für Messungen der Zellverkürzung, Immunfärbungen oder TTU-Färbungen nützlich sein.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kv-Kanal Dysfunktion ist mit Herzrhythmusstörungen verbunden. Um zu untersuchen, die molekularen Mechanismen, die zu solchen Arrhythmien nutzen wir eine systematische Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus Kv Kanal Nebenleistungen Untereinheit Knockout-Mäusen führen. Isolierte Herzmuskelzellen kann dann sofort für zellulare elektrophysiologische Studien, biochemischen oder Immunfluoreszenz (IF)-Assays verwendet werden.

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

Aktuelle Erkenntnisse über die zellulären Grundlagen von Herzerkrankungen meist stützt sich auf Studien an Tiermodellen. Hier beschreiben wir und Validierung einer neuen Methode, um einzelne lebende Herzmuskelzellen von kleinen chirurgischen Proben menschlichen Myokard zu erhalten. Menschen Kardiomyozyten können für elektrophysiologische Studien-und Drogentests verwendet werden.

Isolierung und funktionelle Charakterisierung der Menschen ventrikuläre Kardiomyozyten von Fresh Chirurgische Proben

Es sind Verfahren zur Isolierung von Sinusknoten Myozyten (SAMs) von erwachsenen Mäusen für Patch-Clamp-Elektrophysiologie oder Bildgebungsstudien demonstriert. Isolierte Zellen können direkt oder aufrechterhalten werden kann in Kultur zu ermöglichen, die Expression von Proteinen von Interesse, beispielsweise genetisch codierten Reporter verwendet.

Verfahren zur Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung von Sinoatrialknoten Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Hier beschreiben wir eine optimierte, Langendorff-basierte Verfahren zur Isolierung von einzelligen Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion. Eine manuelle Regelung der Intraluminal Druck von kardialen Hohlräumen wird implementiert, um funktionell intakt Myozyten geeignet für Erregung-Kontraktion-Kupplung Studien ergeben.

Isolierung von Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion

Dieses Protokoll wird verwendet, um einzelne vorhofflische Kardiomyozyten aus dem erwachsenen Mausherz mit einem Chunk-Verdauungsansatz zu isolieren. Dieser Ansatz wird verwendet, um rechte oder linke Vorhoffleine myozyten zu isolieren, die verwendet werden können, um Vorhoffleine Myozytenelektrophysiologie in Patch-Clamp-Studien zu charakterisieren.

Isolierung von Atrial Myozyten von erwachsenen Mäusen

Präsentiert wird ein Protokoll zur Isolierung von humanen und tierischen ventrikulären Kardiomyozyten aus vibratomegeschnittenen Myokardscheiben. Hohe Erträge von kalziumtoleranten Zellen (bis zu 200 Zellen/mg) können aus kleinen Gewebemengen (&lt;50 mg) gewonnen werden. Das Protokoll gilt für Myokard, das bis zu 36 h kalten Ischämien ausgesetzt ist.

Isolierung menschlicher ventrikulärer Kardiomyozyten aus Vibratome-Cut Myokardscheiben

Eine Methode wird beschrieben, um Myozyten und Nicht-Myozyten gleichzeitig von den Vorhöfen und Ventrikeln eines einzelnen erwachsenen Mausherzens zu isolieren. Dieses Protokoll führt zu konsistenten Erträgen von hochlebensfähigen Herzmyozyten und Nicht-Myozyten und beschreibt optimale zellspezifische Kulturbedingungen für Phänotypisierung und In-vitro-Analyse.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Dieses Protokoll beschreibt Modifikationen der Langendorff-Methode einschließlich der Tiefe der Aortenkanülierung zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen.

Modifikationen der Langendorff-Methode zur gleichzeitigen Isolierung von atrialen und ventrikulären Myozyten aus erwachsenen Mäusen

Lernen Sie die Isolierung humaner Vorhofmyozyten für simultane Messungen von Calciumtransienten und Membranströmen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die kardiale Physiologie und Erkrankungen wie Vorhofflimmern.

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca

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