Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca 2 + Transienten und Membrane Currents

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, humane atriale Myozyten zu isolieren, die für die gleichzeitige Messung von Kalzium, Transienten und Membranströmen geeignet sind. Die richtige Vorhofprobe wird von Patienten entnommen, die sich einer Operation am offenen Herzen unterziehen, und schnell transportiert, um mit dem Eingriff zu beginnen. Der erste Schritt des Eingriffs besteht darin, das Gewebe zu reinigen und in kleine Gewebestücke zu schneiden.

Der zweite Schritt ist eine zweifache enzymatische Verdauung des Gewebes mit proteolytischen Enzymen, die zu isolierten Vorhofmyozyten führt. Der letzte Schritt besteht darin, die Myozyten mit einem calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff zu beladen. Letztendlich führt der kombinierte Einsatz der Epi-Fluoreszenzmikroskopie und der Patch-Clamp-Technik zu gleichzeitigen Aufzeichnungen von Kalziumtransienten mit Membranströmen oder Aktionspotentialen.

Diese Methode kann dazu beitragen, die molekularen Grundlagen des zellulären Kalziumumgangs mit Anomalien zu verstehen, die Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern zugrunde liegen, und demonstriert, dass die Methode von Patienten stammt, die sich einer Operation am offenen Herzen für eine koronare Bypass-Transplantation oder einen Mitralklappenersatz unterziehen, sollte schnell in Transportlösung ins Labor transportiert werden. Im Labor angekommen, geben Sie die Gewebeprobe und die Lösung in eine 10-Zentimeter-Schale. Anschließend das Fettgewebe mit einer Schere grob entfernen.

Winken Sie als Nächstes mit der Gewebeprobe. Bewahren Sie zwischen 200 und 600 Milligramm für die Zellisolierung auf und frieren Sie den Rest für die biochemische Analyse in flüssigem Stickstoff ein. Übertragen Sie das Gewebe für die Zellisolierung in eine Schüssel mit kühler kalziumfreier Lösung und hacken Sie das Gewebe in einen Kubikmillimeter, um das Gewebe zu waschen.

Zusammen mit der kalziumfreien Lösung wird es in das ummantelte Becherglas gegeben. Beheizt auf 37 Grad. Geben Sie Sauerstoff aus einer Leitung, die mit einer Pipettenspitze verschlossen ist, um starke Blasenbildung zu verhindern.

Rühren Sie das Taschentuch etwa drei Minuten lang vorsichtig mit einem Magnetrührstab um. Lassen Sie dann das Gewebe absetzen. Siehen Sie nun den Überstand vorsichtig durch ein 200 Mikron Nylonnetz ab.

Der größte Teil des Gewebes sollte im Becherglas verbleiben. Füllen Sie das Becherglas mit erwärmter 37 Grad kalziumfreier Lösung. Führen Sie dann die gespannten Gewebebrocken aus dem Netz mit einer Pinzette in das Becherglas zurück und wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.

Beginnen Sie diesen Teil des Eingriffs, indem Sie 20 Milliliter erwärmte 37 Grad Celsius warme Enzymlösung E vorbereiten, die Kollagenase und Protease enthält. Die kalziumfreie Lösung nach dem letzten Waschschritt vorsichtig abseihen und das gewaschene Tuch wieder in der E one Lösung suspendieren. Geben Sie das auf dem Netz gesammelte Gewebe wieder in das Becherglas zurück.

Rühren Sie die Suspension 10 Minuten lang vorsichtig um. Fügen Sie dann 40 Mikroliter 10 millimolares Calciumchlorid hinzu und rühren Sie 35 Minuten lang weiter. Als nächstes seihen Sie den Überstand vorsichtig durch ein Nylonnetz.

Der größte Teil des Gewebes sollte im Becherglas verbleiben. Bereiten Sie 20 Milliliter Enzymlösung E zwei vor, die nur eine Kollagenase enthält, und verwenden Sie sie, um das Becherglas wieder zu füllen. Geben Sie das auf dem Netz gesammelte Gewebe wieder in das Becherglas zurück.

Fügen Sie dann sofort während der zweiten Verdauung 40 Mikroliter 10 millimolare Calciumchloridlösung hinzu und zerkleinern Sie gelegentlich mit einer Schere Gewebegerinnsel. Entnehmen Sie nach fünf Minuten eine Probe der Suspension, um die Dissoziation der Zellen unter einem Mikroskop zu überprüfen. Entnehmen Sie alle zwei bis drei Minuten Proben, bis stäbchenförmige, quergestreifte Kardiomyozyten deutlich sichtbar sind.

Stoppen Sie dann das Rühren, damit sich das Gewebe absetzen kann. Nach dem Absetzen den Überstand vorsichtig durch ein Nylonnetz in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen abseihen. Hängen Sie dann das Gewebe in 20 Milliliter Aufbewahrungslösung auf und geben Sie die gespannten Gewebestücke aus dem Netz in das Becherglas zurück.

Dissoziieren Sie die Zellen weiter durch sanfte mechanische Titation. Versuchen Sie mit einer 20-Milliliter-Pipette, Blasenbildung zu vermeiden. Als nächstes seihen Sie den Überstand nach dem Siebzentrifugen vorsichtig durch ein Nylonnetz ab, beide Überstandssammlungen bei 90 5G für 10 Minuten.

Um die Zellen zu pelletieren, entsorgen Sie die Überstände durch Aspiration, ohne die Pelletreanimation zu stören. Suspendieren Sie jedes Pellet in 1,5 Millilitern Lagerlösung bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 7,5 Mikroliter 10 millimolare Calciumchloridlösung in jedes Röhrchen und warten Sie 10 Minuten.

Fügen Sie dann weitere 7,5 Mikroliter Calciumchlorid hinzu und warten Sie weitere 10 Minuten. Nach der Wartezeit fügen Sie ein drittes Volumen von 15 Mikrolitern 10 Millimolar Calciumchlorid hinzu, um die Endkonzentration von Calciumchlorid in Lösung auf 0,2 Millimolar zu bringen. Der Zweck dieser Isolierung besteht darin, Zellen zu erhalten, die für intrazelluläre Kalziummessungen geeignet sind.

Daher ist es eine wichtige Anforderung, Calciumpuffer wie EGGA aus der Lagerlösung zu entfernen. Übertragen Sie 1,5 Milliliter der Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die folgenden Schritte sollten unter Berücksichtigung der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Calciumindikators durchgeführt werden.

Grippe O drei. Stellen Sie zuerst eine einmillimolare Grippe oh 3:00 Uhr Standardlösung her. Diese Lösung kann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Fügen Sie als nächstes 15 Mikroliter der Grippe-oh-3:00-AM-Stammlösung zur 1,5-Milliliter-Zellsuspension hinzu. Rühren Sie die Mischung vorsichtig um und inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer undurchsichtigen Box. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Gewebe kurz bei etwa 6.000 U/min.

Entsorgen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1,5 Millilitern Badelösung. Lassen Sie die Zellsuspension etwa 30 Minuten lang verestern, bevor Sie mit den Versuchen beginnen. Fahren Sie dann mit gleichzeitigen Patch-Clamp- und Epi-Fluoreszenz-Kalziummessungen unter Verwendung des beschriebenen Protokolls fort.

Myozyten wurden aus Vorhofgewebe isoliert und auf einem Zellfinder-Objektträger quantifiziert. Die durchschnittlichen Zellausbeuten deuten deutlich darauf hin, dass es in Proben von Patienten mit chronischem Vorhofflimmern eine Tendenz zu niedrigeren Zellausbeuten gibt. Bei Grippe oder drei beladenen Myozyten wurden bei 0,5 Hertz in der aktuellen Clamp-Konfiguration stimuliert, um Aktionspotentiale auszulösen, etwa 90% der untersuchten Zellen zeigten regelmäßige Kontraktionen.

Als Reaktion auf diese Stimulation visualisiert der Wechsel zur Fluoreszenzmikroskopie die durch das Aktionspotential ausgelöste Kalziumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, die die zelluläre Kontraktion einleitet. Repräsentative Befunde von Patienten mit Sinusrhythmus und Vorhofflimmern zeigen, dass sr. Die Aktionspotentiale des Patienten haben typischerweise eine Spike- und Kuppelform, während die Triangulation und Verkürzung des Aktionspotentials typische Kennzeichen des atrialen Umbaus sind.

Bei Patienten mit Vorhofflimmern zeigten gleichzeitig aufgezeichnete intrazelluläre Kalziumtransienten erhöhte diastolische Kalziumspiegel und eine verringerte transiente Kalziumamplitude in Myozyten von Patienten mit Vorhofflimmern, um Kalziumströme vom L-Typ aufzuzeichnen. Die Kaliumströme wurden mit vier Aminosäuren Paridin und Bariumchlorid blockiert. Die Zellen wurden bei 0,5 Hertz in Spannungsklemmenkonfiguration mit einem Haltepotenzial von minus 80 Millivolt stimuliert, mit einem Rampen von 100 Millisekunden auf minus 40 Millivolt und einem Testimpuls von 100 Millisekunden auf 10 Millivolt.

Repräsentative Aufzeichnungen zeigen, dass Vorhofflimmern mit einem reduzierten Kalziumstrom vom Typ L einhergeht. Auch hier war der diastolische Calciumspiegel erhöht, während die transiente Calciumamplitude niedriger war. Bei Vorhofflimmern.

Die Anwendung des nicht-selektiven Beta-Nebennierenrezeptor-Agonisten Isopren erhöhte die Amplituden der L-Typ-Calciumströme und des zytosolischen Calciumtransienten. In beiden Gruppen deutet dies darauf hin, dass die Zellen eine intakte beta-adrenerge Signaltransduktionskaskade aufweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode qualitativ hochwertige Calcium-tolerante Myozyten liefert, die sich für gleichzeitige Patch-Clamp- und Calcium-Transient-Messungen eignen.

Darüber hinaus können die gewonnenen Myozyten für Zellverkürzungsmessungen, Immunfärbungen oder TTU-Färbungen nützlich sein.