Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane atriale Myozyten zu isolieren, die für gleichzeitige Messungen von Kalziumtransienten und Membranströmen geeignet sind. Die rechtsatriale Probe wird von Patienten gewonnen, die sich einer offenen Herzoperation unterziehen, und schnell transportiert, um mit dem Verfahren zu beginnen. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gewebe zu reinigen und in kleine Gewebestücke zu schneiden.

Der zweite Schritt besteht aus einer zweifachen enzymatischen Verdauung des Gewebes mit proteolytischen Enzymen, die zu isolierten atrialen Kardiomyozyten führt. Der letzte Schritt umfasst das Beladen der Kardiomyozyten mit einem kalziumempfindlichen fluoreszierenden Farbstoff. Letztendlich ermöglicht die kombinierte Anwendung der Epi-Fluoreszenzmikroskopie und der Patch-Clamp-Technik gleichzeitige Aufnahmen von Kalziumtransienten zusammen mit Membranströmen oder Aktionspotentialen.

Diese Methode kann dazu beitragen, die molekulare Grundlage von Störungen der zellulären Kalziumhandhabung bei Herzerkrankungen wie Vorhofflimmern zu verstehen. Die Demonstration der Methode erfolgt durch Claudia Lira, die leitende technische Assistentin unseres Labors. Das aus menschlichem Vorhofgewebe gewonnene Material von Patienten, die sich einer offenen Herzoperation zur Koronararterien-Bypass-Transplantation oder zum Ersatz der Mitralklappe unterziehen, sollte umgehend in einem Transportmedium ins Labor gebracht werden. Sobald sich das Gewebe im Labor befindet, überführen Sie die Gewebeprobe zusammen mit der Lösung in eine 10 cm-Dish. Entfernen Sie anschließend mithilfe einer Schere grob das Fettgewebe.

Als Nächstes schwenken Sie die Gewebeprobe. Bewahren Sie zwischen 200 und 600 Milligramm für die Zellisolierung auf und frieren Sie den Rest in flüssigem Stickstoff für die biochemische Analyse ein. Überführen Sie das Gewebe für die Zellisolierung in eine Schale mit kalter calciumfreier Lösung und zerkleinern Sie das Gewebe in Stücke von einem Kubikmillimeter Größe, um das Gewebe zu waschen.

Überführen Sie es zusammen mit der calciumfreien Lösung in den ummantelten Becher. Auf 37 Grad erwärmen. Sauerstoff über eine mit einer Pipettenspitze verschlossene Leitung zuführen, um starkes Blasen zu vermeiden.

Rühren Sie das Gewebe vorsichtig etwa drei Minuten lang mit einem magnetischen Rührstab um. Anschließend lässt man das Gewebe absetzen. Gießen Sie nun vorsichtig das Überstand durch ein Nylonnetz mit 200 Mikron.

Der größte Teil des Gewebes sollte im Becher verbleiben. Füllen Sie den Becher erneut mit erwärmter kalziumfreier Lösung bei 37 Grad auf. Bringen Sie anschließend die durch das Netz gefilterten Gewebestücke mit einer Pinzette in den Becher zurück und wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.

Beginnen Sie diesen Teil des Verfahrens mit der Herstellung von 20 Milliliter erwärmter Enzymlösung E1 bei 37 Grad Celsius, die Kollagenase und Protease enthält. Filtern Sie die kalziumfreie Lösung vorsichtig nach dem letzten Waschschritt und resuspendieren Sie das gewaschene Gewebe in der E1-Lösung. Geben Sie das auf dem Netz gesammelte Gewebe zurück in den Becher.

Rühren Sie die Suspension vorsichtig 10 Minuten lang. Fügen Sie dann 40 Mikroliter 10-Millimolar-Calciumchlorid hinzu und rühren Sie weitere 35 Minuten fort. Danach filtrieren Sie das Überstandsvolumen vorsichtig durch ein Nylonnetz.

Der größte Teil des Gewebes sollte im Becher verbleiben. Bereiten Sie 20 Milliliter Enzymlösung E zwei, die nur Kollagenase eins enthält, vor und verwenden Sie diese, um den Becher erneut zu füllen. Geben Sie das auf dem Netz gesammelte Gewebe zurück in den Becher.

Gegeben Sie dann sofort 40 Mikroliter einer 10-Millimolar-Lösung von Calciumchlorid während der zweiten Verdauung hinzu und zerschneiden Sie gelegentlich mit einer Schere Gewebeklumpen. Nach fünf Minuten entnehmen Sie eine Probe der Suspension, um die Dissoziation der Zellen unter dem Mikroskop zu überprüfen. Entnehmen Sie alle zwei bis drei Minuten weitere Proben, bis deutlich sichtbare, stabförmige quergestreifte Kardiomyozyten erkennbar sind.

Dann die Rührung stoppen und das Gewebe absetzen lassen. Sobald es abgesetzt hat, vorsichtig das Überstand durch ein Nylonnetz in ein 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen abgießen. Anschließend das Gewebe in 20 Milliliter Lagerungslösung suspendieren und die zurückgehaltenen Gewebestückchen vom Netz zurück in das Becherglas geben.

Lösen Sie die Zellen durch schonende mechanische Pipettierung weiter auf. Verwenden Sie eine 20-Milliliter-Pipette und vermeiden Sie die Bildung von Blasen. Danach filtrieren Sie vorsichtig das Überstand durch ein Nylon-Netz, nach der Filtration zentrifugieren Sie beide Überstand-Sammlungen bei 90 5G für 10 Minuten.

Um die Zellen zu pelletieren, entfernen Sie die Überstände durch Absaugen, ohne das Pellet zu stören. Suspendieren Sie jedes Pellet in 1,5 Milliliter Lagerungslösung bei Raumtemperatur. Geben Sie anschließend 7,5 Mikroliter einer 10-Millimolar-Lösung von Calciumchlorid in jedes Röhrchen und warten Sie 10 Minuten.

Fügen Sie dann weitere 7,5 Mikroliter Calciumchlorid hinzu und warten Sie weitere 10 Minuten. Nach der Wartezeit geben Sie ein drittes Volumen von 15 Mikrolitern 10-Millimolar-Calciumchlorid hinzu, um die endgültige Konzentration von Calciumchlorid in der Lösung auf 0,2 Millimolar zu bringen. Der Zweck dieser Isolation besteht darin, Zellen zu erhalten, die für intrazelluläre Calciummessungen geeignet sind.

Daher ist es eine entscheidende Voraussetzung, Kalziumpuffer wie EGTA aus der Lagelösung auszuschließen. Überführen Sie 1,5 Milliliter der Zellsuspension in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Die folgenden Schritte sollten unter Berücksichtigung der Lichtempfindlichkeit des fluoreszierenden Kalziumindikators durchgeführt werden.

Flu O drei. Stellen Sie zunächst eine einmillimolare Flu O 3-Stocklösung her. Diese Lösung kann bis zu einer Woche bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Fügen Sie anschließend 15 µL der Fluoh-3:00-AM-Stammlösung zur 1,5-mL-Zellsuspension hinzu. Vorsichtig mischen und die Suspension 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer lichtundurchlässigen Box inkubieren. Nach der Inkubation die Probe kurz bei etwa 6.000 U/min zentrifugieren.

Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 Milliliter Badelösung. Lassen Sie die Zellsuspension vor Beginn der Experimente etwa 30 Minuten zur Desveresterung stehen. Fahren Sie anschließend mit simultanen Patch-Clamp- und Epi-Fluoreszenz-Kalziummessungen gemäß des beschriebenen Protokolls fort.

Myozyten wurden aus atrialem Gewebe isoliert und auf einem Zählschieber unter dem Mikroskop quantifiziert. Die durchschnittlichen Zellausbeuten zeigen eindeutig eine Tendenz zu niedrigeren Zellausbeuten bei Proben von Patienten mit chronischem Vorhofflimmern. Mit Flu oh drei beladene Myozyten wurden im Strom-Klemm-Modus bei 0,5 Hertz stimuliert, um Aktionspotentiale auszulösen; etwa 90 % der untersuchten Zellen zeigten regelmäßige Kontraktionen.

Als Reaktion auf diese Stimulation ermöglicht der Wechsel zur Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung der Aktionspotentiale auslösenden Kalziumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, die die zelluläre Kontraktion einleitet. Repräsentative Aufzeichnungen von Patienten mit Sinusrhythmus und Vorhofflimmern zeigen, dass sr. Patienten-Aktionspotentiale typischerweise eine Spitz-und-Kuppel-Form aufweisen, während eine Triangulierung und Verkürzung der Aktionspotentiale charakteristische Merkmale des atrialen Remodelings darstellen.

Bei Patienten mit Vorhofflimmern zeigten gleichzeitig aufgezeichnete intrazelluläre Kalziumtransienten erhöhte diastolische Kalziumspiegel und verminderte Amplitude der Kalziumtransienten in Myozyten von Patienten mit Vorhofflimmern zur Aufzeichnung von L-Typ-Kalziumströmen. Kaliumströme wurden unter Verwendung von 4-Aminopyridin und Bariumchlorid blockiert. Die Zellen wurden im Spannungs-klemm-Modus bei 0,5 Hertz mit einem Haltepotential von minus 80 Millivolt stimuliert, wobei ein 100 Millisekunden langer Rampenimpuls auf minus 40 Millivolt und ein 100 Millisekunden langer Testimpuls auf 10 Millivolt appliziert wurden.

Repräsentative Aufnahmen zeigen, dass die Vorhofflimmern mit einem verminderten L-Typ-Calciumstrom assoziiert ist. Auch hier war der diastolische Calciumspiegel erhöht, während die Amplitude des Calciumtransients niedriger war. Bei Vorhofflimmern.

Die Anwendung des nichtselektiven Beta-Adrenozeptor-Agonisten Isopren erhöhte die Amplituden der L-Typ-Calciumströme und der zytosolischen Calciumtransienten. In beiden Gruppen deutet dies darauf hin, dass die Zellen eine intakte beta-adrenerge Signaltransduktionskaskade aufweisen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode hochwertige calciumtolerante Kardiomyozyten liefert, die für simultane Patch-Clamp- und Calciumtransienten-Messungen geeignet sind.

Außerdem können die gewonnenen Myozyten für Messungen der Zellverkürzung, Immunfärbungen oder TTU-Färbungen nützlich sein.