Name: の生細胞サイクル分析ショウジョウバエ組織 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶショウジョウバエ組織の生細胞サイクル解析法。フローサイトメトリーと蛍光タンパク質標識を用いて細胞サイズとDNA含量を同時測定し、遺伝子操作の影響を定量的に評価する。

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私たちは、このバージョンは10基になっているオリジナルのプロトコルを開発し、教えるためアイーダ·デ·ラ·クルスに感謝します。 Buttittaラボでの仕事は、NIHの助成金GM086517によってサポートされています。

1。畜産を飛ばす<ol><li>クロスは10ミリリットル酵母グルコース培地3または任意の他のタンパク質が豊富なメディアとの狭いプラスチックバイアルで目的遺伝子型のハエ。 生体蛍光タンパク質発現に使用したトレースの組織特異的発現と系統で利用広範ショウジョウバエ遺伝子導入のツールは他の場所で4,5詳細に記載されている。 24時間子孫コレクションのシリーズを得るために毎日新鮮なバイアルに両親を転送したり、より正確なステージングのために、寒天プレート上胚を収集し、10は、上記のようにバイアルに孵化幼虫を移す。実験全体で均一な条件を確保し、過密回避するために、単一バイアル中F1子孫の総数は100を超えてはならない。実験の遺伝的設計に応じて、必要な発達段階になるまで適切なインキュベーターにバイアルを保つ。 </li><li>実験動物を収集：あなたが第 3幼虫で成熟した幼虫が必要となります正確蛹ステージング用幼虫の解剖や白前蛹（WPP）の開発のための110-120時間程度で齢（L3）。非増殖状態にスイッチを含む劇的な細胞周期の変化は、変態12,13間に異なる時点で発生します。したがって蛹（開発の1時間以内）の正しいステージングは​​変態時の再現性の細胞周期のデータのために不可欠です。 WPPは、 図1、パネルIに示す蛹形成（0時間APF）の後に0時間に対応していますいくつかの湿度を維持するために水を2.5mlで濡れ折らキムワイプで35ミリメートルペトリ皿にWPPを収集します。適当な温度で所望の段階（時間APF）まで年齢蛹。開発は29℃で、18時よりゆっくりと2.2倍°C標準の25℃よりも14°Cを 1.2倍速く進行することに注意してください。 </li><li> 9,11を必要に応じて、クローンを系譜トレース用熱ショックflipase（HS-FLP）誘発組換えを活性化する熱ショック動物。幼虫の熱ショック、浸すための水浴（37℃に設定）と幼虫を確実にバイアルは完全に水没しています。蛹のヒートショックは、パラフィルムでシャーレを密封し、完全に水槽に沈めるそれを。動物の生存のために十分な酸素交換を可能にするために、熱ショック後にパラフィルムを除去してください。熱ショックの期間はflipaseの使用導入遺伝子と、目的のクローンの数の活性に依存する。我々は日常的にHS-FLP導入遺伝子間に、HS-FLP最初の染色体上に導入遺伝子と35ミリ皿に蛹のヒートショックのために2-4分で幼虫にクローン15をトレースした系列&quot;FLIPOUT&quot;を誘導するための7-8分を使用第二染色体は20分を必要とします。熱はショッククローンの類似の番号を取得する。 </li></ol>解剖の細胞分裂とタイミングの割合は、各組織でのクローンのサイズを決定します。通常の条件下では、我々はクローンが20分の熱ショック（第2染色体上にHS-FLP導入遺伝子を使用して）dissecと幼虫の翼に誘導されることがわかりテッド48時間後に、クローンごとに4つのセルの周りの平均は、クローンあたり10細胞からのクローンごとに2つのセルに及ぶサイズで約20〜30良好に分離クローンが含まれています。これとは対照的に、0時間APFでシャーレに蛹の同じHS-FLP導入遺伝子で7分の熱ショックは36時間後に解剖し、歩留まり良く平均で1から4セルまでの範囲（約15〜25）クローン分離クローン当たり2.2細胞の。このようなデータは調査中の組織の平均細胞倍加時間を決定するために使用することができる。 2。解剖<ol><li>優しく1X PBSを含む透明なガラス解剖皿に幼虫/蛹を転送します。 </li><li>解剖顕微鏡と十分な光を利用して、優しく鋭いイノックス＃5鉗子と腹部で幼虫を把握し、幼虫を保持しながら、マイクロはさみで前方の三分の一をカットし、後方に向かって口領域を内側に押して、前方の三分の一を反転キューティクル着実（ 図1A）。注意深くopaquを削除電子体脂肪や、翼、目や脳など希望する組織の可視性を高めるために、残りの腸。目的の組織を解剖、きれいに口フック、または目（ 図1G）から脳から鉗子、目で気管とキューティクルから翼を取り外す。 </li><li>蛹を解剖するため、気泡がある場合蛹内側（ 図1C）を損傷しないように、そっと蛹ケースの前方先端で蛹を把握するために鉗子を使用しています。反対の手で鉗子またはマイクロハサミは、適切な把握のために位置フローティング蛹を助けるために使用することができます。きれいマイクロハサミで蛹の後方先端をカット。この断面カットは胸部と頭の中で希望する組織にhistolyzed脂肪を強制することなく、内部の圧力を解放するために、動物の背の部分に向かってわずかな角度で行う必要があります。翼と前眼 - 脳の複雑なを避けて、背側正中に沿って慎重にカットします。慎重に蛹から蛹を取り除く蛹表皮の後部エッジをつかみ、蛹ケース（ 図1D）からそれを引いてケース。ピンセットで目脳複合体にキューティクル前方に小さな穴を突く。ゴム球のガラスパスツールピペットを用いて、優しくhistolyzed脂肪、残り腸組織を除去するために部分的に解剖蛹を通してPBS郭清ソリューションを洗う。これはまた、効果的に保存ガラスピペットの内側に付着解剖組織の発生率を低下させる脂質およびタンパク質、を有するガラスピペットを潤滑する。 </li><li>蛹の翼を入手するには、翼と翼自体を包むキューティクルは蛹（ 図1E）からこじ開けなければなりません。これはの側からそれを取り除く前にどちらかの翼キューティクルの最も後部先端を把握するために、別の鉗子を使用していて、引き出したり、ヒンジ近くの翼の下に鉗子を操縦しながら1鉗子で頭で蛹​​を押したまま行うことができます死骸（Figure 1E）。翼はその後カットまたは身体からそれを削除して、離れて死体や他の物質からの山に入れてヒンジで引き裂かれることができます。 </li><li>目脳複合体は外れと蛹（ 図1F、1H）から無料になるまで蛹目や脳を入手するには、蛹を洗う。鉗子を使用して、静かに離れて脳から蛹の目を引いて、所望の組織を保存します。 </li><li>結果は長い細胞が動物を開いた後、PBSに残っているより少なく正確になるように、それぞれのサンプルを分析するために45分より長く服用しないでください。 </li></ol> 3。組織解離とDNA染色<ol><li>潤滑パスツールピペットを使用して、慎重に5ミリリットルのポリスチレンチューブ（ 図1G）でライブDNA染色液を0.5mlに解剖組織を移す。 DNA染色液にできるだけPBSとして転送（未満300μl）を、トリプシンの希釈として組織解離を阻害する。 </li><li>シャキとチューブをインキュベートNG 23で500回転（我々はエッペンドルフサーモを使用します）℃で。 </li><li>中速（5の設定）で5秒間軽くボルテックス後、70分間インキュベートする。アンダーボルテックスは細胞塊につながる一方、過度ボルテックスは、細胞破壊やフォーム破片が発生します。速度は5で5秒間もう一度彼らをボルテックスする前に追加、15〜20分間、500 rpmで23℃で振盪にサンプルを返します。 </li><li>脳と36hAPFより古い蛹の目の場合は、修正されたプロトコルが必要です。 1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに45-60分間、500 rpmで23℃でDNA染色液で組織を解離する。その後、一つずつ手作業で約50μlのDNA染色液と迅速に手動で描かパスツールピペット16（約100-150μmの開口部の）で上下にピと一緒に解剖皿に転送することによって、組織の大きな塊を解離。 5ミリリットルチューブにDNA染色液0.5mlの残りの部分と各解離標本を転送します。さらに45をインキュベート23℃-30分（総インキュベーション時間の最大90分）°塊が見えなくなるまで500rpmで振盪しながらC。 </li><li>音符無細胞透明蛹翼キューティクルが解離しないことが完全に解離サンプルは、組織の非常に少数の大きな目に見える塊を持っている必要があります。 </li></ol> 4。フローサイトメトリー<ol><li>同調メーターの電源をオンにし、同調ソフトウェアを開きます。メーターレーザーは起動メニューからオンにする必要があり、毎日の性能試験は、データ収集の各曜日の前に十分なスコアを持つパフォーマンス追跡ビーズを用いて実施されるべきである。流体レベルは少なくとも半分と性能試験の前に空になった廃棄物であるべきである。同調させるの起動、適切なキャリブレーションおよび操作の詳細は同調ユーザーガイド（に記載されています<a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf" target="_blank">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf</a> ） </li><li>新しいTEを設計4.3に示されているパラメータを持つ空白のワークスペースに4ドットプロットと2ヒストグラムを作成することによってmplate、または実験に適し以前に設計されたテンプレートを選択し、収集するサンプル数を示す。私たちは、付録IでのライブVybrant DyeCycleバイオレットとGFPとショウジョウバエの細胞周期解析やRFP発現に同調させるテンプレート（。得る形式のファイル）を提供してきた</li><li>提供されるテンプレートは、4つのドットプロットと図2に示されているパラメータを持つ2つのヒストグラムが含まれています。検出のためのチャンネルが含まれます：FSCとSSC - セルサイズおよび膜の複雑さ、VL1高さ（H）、幅（W）と面積（）を示す前方散乱と側方散乱 - DyeCycleバイオレット染色の示すバイオレットレーザー励起DNAおよびBL1を- - GFP蛍光を示すブルーレーザーチャンネル1エリア、。 RFP解析のため提供されているテンプレートは、それがoptimiあるブルーレーザーチャネル3（BL3-）、使用することを除けば、GFP分析のためのテンプレートと同じですRFPを検出するためにアルファベットのゼット。 </li><li>テンプレートのドットプロットは、所望の集団を分析を制限すると解析（ 図2）から破片や細胞塊を限定するゲートを有している。ゲート1はSSC対FSC（ 図2A）に基づいて破片や塊を除外します。ゲート2は、シングレット（VL1Area対VL1Width）（ 図2B）の識別に基づいて染色されていない細胞は、サブG1アポトーシス細胞と細胞塊を除外。ゲート3は、ゲート1と2内の細胞を包含、派生ゲートであり、GFP（あるいはRFP）陰性細胞対VL1Height（ 図2C）に基づいてDNA含量を識別します。ゲート4は、ゲート1と2内のセルを包含、派生ゲートであり、GFP（あるいはRFP）DNA含量（ 図2C）対陽性細胞を識別します。 GFP（またはRFP）対前方散乱（FSC）によって測定されるセルサイズのドットプロットは、ゲート5および6（ 図2D）を生成するために使用される。 Y-軸対称にX軸及び細胞数の2つのヒストグラムのプロットDNA含量ゲート3とゲート4で定義された集団のための。所望であれば（ 図2Eおよび2F）ヒストグラムもまた（図示せず）は、セルサイズを含めることができる。セルサイズのヒストグラムについては、集団はX軸とy軸上のカウントにFSCをプロットし、ゲート5及び6に設定されるべきである。 </li><li> 10,000 GFPまたはRFP陽性のイベント（これはゲート4になり、ゲート1、ゲート2およびGFPまたはRFP正のゲートの派生門）で停止する録画を設定します。 6,000の範囲で- 10,000 GFP陽性のイベントは、伝統的に出版品質プロファイル9,11の目標であった。私たちは高品質のプロファイル用の4つのイベント10十分なゲートを得るために正の約50％のGFPである15羽や目の最小値を、使用することをお勧め。しかし、我々が正常に6羽（ 図3A）と同じくらい少ないから予備細胞周期解析のための明確なデータを取得しています。 300μLの取得音量を設定し、これは全体の0.5ミリリットルのサンプルの約460μLを使用します。 タBLE 2は、 図2の例のためにテンプレートで提供、適切なしきい値と電圧設定を示しています。 </li><li>標準感度や高感度を100μl/分とレコードでサンプルを実行します。我々は、異なる感度レベルを持つ我々の分析では差はほとんどを見つける。細胞を集束音響のために、このサイトメーターは、正確に、非常に高い流量で試料を測定することができる。従来のメーターとは異なり、我々は毎秒1,500イベントの速度で、最大取得することによって、データの妥協点を見つけることはありません。同調ソフトウェアによって生成される記録されたデータファイルは、ほとんどの細胞周期モデリングソフトウェアと互換性がある。FCS形式である。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li> GFPのセルサイズおよびDNA含有量のヒストグラム（又はRFP）正および負の集団を比較することができる。これらは手動でコピーしてAdobe Photoshopのソフトウェアを使用して貼り付けて階層化することができます。 y軸が自動に設定されている場合は、Y軸は時間をスケールする各サンプルのighestカウント。オートスケールのY軸が設定された二つのグラフを重ねると、各集団のグローバル最大値に設定された軸を持つヒストグラムのオーバーレイを作成します。これは、（ 図3Bの例）GFP陽性およびGFP陰性集団の合計細胞数が等しくない場合であっても、フェージング細胞周期の相対的変化を容易に視覚的な比較を可能にする。あるいは、カスタムy軸（y軸の手動オプション）ヒストグラムの固定値に設定することができる。この場合、2つの母集団の相対細胞数を比較することができる。 図3Fにワークスペース（この例では、実行時 ​​に自動的に生成された統計表から得られる同調は、総人口の割合と各ゲートで、ランあたりのサンプル、各実行のための細胞の絶対定量化の定義されたボリュームを使用するように）。ドットプロットとヒストグラムも簡単に、単純に目の異なるサンプルをドラッグ＆ドロップすることで、同調させるソフトウェアで積層することができます比較のために開いているサンプルの所望のグラフの上に右の電子サンプルファイルメニュー。しかし単一のサンプル（同一サンプル内の負すなわち GFP陽性およびGFP） の中から集団をオーバーレイする、我々は、Photoshopを使用しています。 </li><li>二つの方法は、母集団のための細胞周期の異なる段階での相対的な割合を見つけるために使用することができる。近似​​法は、G1、S、G2と&gt; G2ピークの境界を線引きするためにユーザ定義された領域に依存している。このメソッドは、ユーザーが定義した領域内の割合（ 図3E）の迅速かつ容易に推定することができます。我々は、エチニル-デオキシウリジン（EDU）の取り込みを使用してS期ために標識ショウジョウバエ Kcの細胞との直接テストに基づいて私たちの地域を設定します。第二の方法は、細胞周期分布の推定のために第三者のモデリングソフトウェアを使用する。我々は、 図3Fに、例えばModFitLT（Verityのソフトウェアハウス）ソフトウェアを使用していました。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明するプロトコルは、細胞周期、相対的なセルサイズおよび様々な発生段階でのライブショウジョウバエ組織の相対的な細胞数の分析を可能にする。この分析は、細胞型特異的蛍光タンパク質の発現またはトレースの系統に結合されると、詳細情報が目立たない細胞周期または成長摂動に対する細胞応答について得ることができる。原理の証明として、我々は、脳細胞が逮捕された90％のG1（ 図3D）にわたって正常にあるときに発生段階で異常なDNA複製につながる、GFP標識した細胞クローンでG1-S細胞周期調節因子を発現させることにより、蛹ハエ脳の休止を中断。 しかし、この生細胞周期分析方法にはいくつかの重要な制限がある。まず、人はここに記述されたプロトコルを使用して有糸分裂の様々な段階における細胞を区別することはできません。したがって、ここで説明する分析がimmのを補充されるべきである興味のある組織に分裂指数を定量化するなどのSer10リン酸化ヒストンH3 18として分裂マーカーのunofluorescence染色。両...

フローサイトメトリーは、細胞生存率、相対的なセルサイズ、DNA含量および生細胞集団における蛍光タンパク質発現の測定に用いることができる。 S相細胞の集団におけるDNAの内容に関する情報中の核DNAの複製のためには、異なる細胞周期相1-3の相対的な割合を推測するために使用することができる。この方法は、酵母から哺乳動物モデル系における細胞周期分析の基礎となっている。 ショウジョウバエでは、細胞周期調節のin vivo解析で遺伝するための優れたモデルシステムとなっています。ハエで利用可能な大規模な遺伝的なツールは、in vivo蛍光タンパク質ベースの系統で 4-6トレースとともに細胞周期調節因子の優雅な組織特異的かつ時間的に調節操作が可能になります。フローサイトメトリーendorepl含む、 ショウジョウバエの細胞の種類の数にDNA含量を研究するために使用されている細胞と培養有糸分裂細胞7,8 icating。 in vivoでの細胞周期の研究における重要な進歩のためには、ライブ二倍ショウジョウバエ成虫ディスク9,10、多くのラボで使用され、適応されていたプロトコルのフローサイトメトリー分析のためのプロトコルの開発、デ·ラ·クルスとエドガーによって作られた。誘導性蛍光タンパク質の発現および組織特異的標識を介してトレースをインビボ系統の遺伝子と結合この技術は、 インビボ 9 のいずれかの全体的な細胞倍加時間、セルサイズに遺伝子操作への影響に関する情報を取得し、細胞周期相の正確なタイミングを決定することができ、11。しかし、この方法では、これまでユーザーがエキサイティングヘキスト染料のできるUVレーザーでメーターを流れるように制限されている生きた細胞内でDNAを染色し、定量化するための細胞透過性ヘキスト33342-DNA挿入色素の使用に依存してきました。これらは一般のみソーター（ つまり BD FACS Vantaで発見されていGE、BD FACSAria）や高価な多色ベンチトップシステム（ つまり BD LSR）、通常の機関流れ中核施設でサポートを必要とする。 私たちは、インビトロジェン、Vybrant DyeCycleバイオレットから新しい生細胞のDNA染料を使用するヘキストベースのプロトコルを変更した。この染料は、小さな自己完結型のベンチトップ·アナライザ、同調させるアコースティックフォーカシングサイトメーターより小さい卓上型アナライザーに共通および利用可能なバイオレット405 nmのレーザー、互換性があります。ここでは、DyeCycleバイオレットと同調を用いた開発のさまざまな段階でショウジョウバエ組織の様々な細胞型、セルサイズ、セル数および系統解析と結合することができる細胞周期分析のための詳細なプロトコルを提示する。このプロトコルは、 ショウジョウバエ組織を有するそのような分析に適したメーターの数を拡大し、生細胞周期分析のこのタイプは、追加の組織の種類および発達段階のために変更することができる方法の例を提供する。

<table><tbody><tr><td>12x75 mm ポリスチレン丸底 5 ml 試験管 </td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td>5 ml チューブ</td></tr><tr><td>Attune Acoustic Focusing Cytometer Life</td><td>Technologies/ Applied Biosystems</td><td>4445315</td><td>Blue / Violet configuration</td></tr><tr><td>Attune Cytometer Software (version 1.2.5)</td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>Free</td><td>PC のみ</td></tr><tr><td>Attune Performance Tracking ビーズ (5 x 106 beads/ml) </td><td>Life Technologies/ Applied Biosystems</td><td>4449754</td><td>毎日のパフォーマンステスト用</td></tr><tr><td>Dumont #5 Inox 鉗子 </td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>胚皿 30 mm x 12mm </td><td>電子顕微鏡科学</td><td>70543-30</td><td>ガラス解剖皿 </td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>022670051</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液 (10x)</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&#252;bingen 春はさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15003-08</td><td>ストレート 5mm カッティングエッジ </td></tr><tr><td>Vybrant DyeCycle バイオレット ステイン</td><td>ライフ テクノロジーズ/ Invitrogen</td><td>V35003</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">表 1.必要な試薬と機器.</td></tr><tr><td colspan="4">Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ 遊離PBS (pH7.2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 &mu;l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet(これは哺乳動物細胞の推奨濃度の0.25倍であることに注意してください。高濃度はショウジョウバエ細胞に対して毒性があることがわかった。 10X Ca2+ Mg2+遊離PBS(pH7.2):1.37M NaCl、27 mM KCl、100mM Na2HPO4(二塩基性)、20mM KH2PO4(モノ塩基性)pHに調整7.2 </td></tr><tr><td colspan="4"><table border="1"> <tbody> <tr> <td> </td> <td>FSC</td> <td>SSC</td> <td>BL1</td> <td>VL1</td></tr> <tr> <td>しきい値(x1000)</td> <td>100</td> <td>10</td> <td>10</td> <td>10</td> </tr> <tr> <td>電圧(mV)</td> <td>2950</td> <td>4250</td> <td>1800</td> <td>1150</td> </tr> </tbody> </table> Table 2.図2.</pの解析のしきい値と電圧設定></td></tr></tbody></table>

の生細胞サイクル分析<em&gt;ショウジョウバエ</em同調させるアコースティック·フォーカスサイトメーターとvybrant dyecycleバイオレットdna染色を使用して&gt;組織

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

フローサイトメトリーは、広く異なる細胞周期の段階で相対的な割合を推測する、細胞集団におけるDNAの内容に関する情報を取得するために使用されている。この技術は、正常インビボにおける細胞周期調節の遺伝学的研究のためのモデル生物キイロショウジョウバエの細胞分裂組織に拡張されている。細胞型特異的蛍光タンパク質の発現および遺伝子操作と結合するとき、いずれかのセル数、セルサイズおよびインビボでフェージング細胞周期に対する影響についての詳細な情報を得ることができる。しかしこの生細胞の方法は、UVレーザーを搭載したフローサイトメーターにユーザーを制限すること、細胞透過性ヘキスト33342-DNA挿入色素の使用に依存してきた。我々は、より一般的なバイオレット405nmのレーザーとの互換性が、新しい生細胞のDNA染料、Vybrant DyeCycleバイオレットを使用するには、このプロトコルを変更した。ここで紹介するプロトコルは、細胞と結合効率よく細胞周期分析を可能にするショウジョウバエ組織の様々なタイプの相対的なセルサイズとセル番号情報。このプロトコルは、単一実験室規模で実行し、維持することができ、小さなベンチトップ·アナライザへのライブショウジョウバエの組織のために有用な細胞周期解析手法、同調させるアコースティックフォーカシングサイトメーターを拡張。

図2に設けられたGFPテンプレートを使用して、組織の後半でGFPを発現し、幼虫の翼サンプルの代表的な結果を示す。同様の結果は、同じ組織型および未RFPテンプレート（ 図3A）を用いてRFPの発現パターンが得られる。提供されるテンプレートおよび電圧（表2）幼虫の眼（ 図3B）、脳および翼、ならびに蛹目、脳（ 図3D）と翼の分析に適している。ゲート5と6の集団のためのFSCをプロットすることによって提供される相対的なセルサイズのヒストグラムも（ 図3C）を生成することができる。ゲイツが原因異なる組織または異なるGFPまたはRFP導入遺伝子のための蛍光強度の違いのためにセルサイズの違いに少し調整する必要があります。サンプルの小テストボリューム（50μL）を実行しながら、これは、レコードを押す前に、行うことができます。 A各集団のグローバル最大値を示すヒストグラムで結果、同調させるソフトウェアで自動スケール（自動に設定...

生きた細胞周期分析のためのプロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em同調アコースティックフォーカシングサイトメーターを用い&gt;組織が記載されている。このプロトコルは、同時に系統トレースまたは蛍光タンパク質の組織特異的発現を介して相対セルサイズに関する情報を、細胞数、DNA含量および細胞型を提供する<em生体内で&gt;</em&gt;。

の生細胞サイクル分析<em&gt;ショウジョウバエ</em同調させるアコースティック·フォーカスサイトメーターとVybrant DyeCycleバイオレットDNA染色を使用して&gt;組織

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエのGFPまたはRFPで遺伝子操作され、GFPまたはRFPで標識された細胞集団を使用して、組織の相対的な細胞周期の位相と細胞サイズを測定することです。まず、遺伝子交配を設定して、特定の組織または細胞集団において、所望の蛍光タンパク質および所望の遺伝子操作で標識された細胞を含む子孫を生成します。研究中の適切な発生段階の子孫から目的の組織をきれいに分離し、次に組織を単一の細胞懸濁液に解離し、生存可能なDNA色素で染色してDNA含有量を測定します。染色された解離サンプルをフローサイトメトリーで分析します。最終的に、in vivoの結果は、研究中の遺伝子操作によって引き起こされた細胞サイズと細胞周期期の変化を測定します。紫外線色素を用いた生ショウジョウバエ組織上の既存のフローサイトメトリー法に対するこの手法の主な利点は、バイオレット色素サイクルが、バイオレット4 0 5レーザーを含む安価なベンチトップサイトメーターと互換性があり、低予算で購入でき、単一のラボスケールで維持できることです。この方法は、単に組織全体のサイズと増殖速度を測定するだけでなく、より詳細な細胞周期の段階と細胞サイズに関する情報を提供することにより、細胞周期分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるKagelとDan Sun、そしてOlga Gukoです。私たちの技術者は、幼虫の解剖のために産卵後約110〜120時間で、3番目の幼虫Instarで成熟した幼虫を収集します。正確な瞳孔のステージングは、この収穫のための変態中の研究に不可欠です 白い前蛹 必要に応じて、私はメサ 37°Cの水浴で蛹または幼虫のバイアルのペトリ皿を密封して熱を活性化します。リネージュトレースクローン用のチャックフリップベース。ペトリ皿の封印を解いた後、インキュベーターに入れて、瞳孔解剖のための所望の発達段階まで老化させます。蛹の損傷を防ぐために気泡がある瞳孔ケースの前端で蛹をそっとつかみ、浮いている蛹を内側に配置して適切につかみます。次に、マイクロハサミで蛹の後端を動物の背側部分に向かってわずかな角度できれいに切り取り、胸部と背側中央部にヒスト脂肪を押し込むことなく内圧を解放し、背側中央に沿って慎重に頭を切り取り、翼と前眼の脳複合体の損傷を避けて脂肪を除去します。次に、鉗子で瞳孔表皮の後縁をつかみ、瞳孔ケースから引き抜くことにより、瞳孔ケースから瞳孔を取り出します。解剖した蛹を清潔な解剖皿に移します。鉗子で眼の脳複合体の前方のキューティクルに小さな穴をあけます。ゴム球付きのガラスパスティピペットを使用。部分的に解剖した蛹を通してPBS解剖液を優しく洗い、残っている彼の化した脂肪と腸組織を取り除きます。瞳孔の翼を得るには、2番目の鉗子を使用して、1つの鉗子で蛹の頭を押さえます。翼のキューティクルの最も後部の先端をつかみ、カーカスの側面から引っ張って外します。次に、ヒンジで翼を切断または引き抜いて体から取り外し、死骸やその他の材料から離れた山に入れて、瞳孔の目または脳を取得します。目の脳複合体が外れて蛹から解放されるまで、蛹を洗います。鉗子を使用して、瞳孔の目を脳からそっと引き離し、目的の組織を保存します 潤滑された過去のピペットを使用して、解剖した組織を慎重に移します。チューブを摂氏23度、500 RPMで70分間振とうしながらインキュベートします。次に、中速で5秒間穏やかにボルテックスし、サンプルをさらに15〜20分間シェーカーに戻します。Vortexは、脳と瞳孔の目のために中速で5秒間もう一度サンプリングします。36時間以上経過している。PFは、500 RPMで摂氏23度のDNA染色溶液中で組織を45〜60分間解離します。次に、組織の大きな塊を、約50マイクロリットルのDNA染色液とともに解剖皿に移すことにより、1つずつ手動で解離します。手動で引いたピペットを約100〜150マイクロメートルの開口部で素早く上下させることができます。解離した標本を5ミリリットルのチューブにプールします。500 RPMで振とうしながら、摂氏23度でさらに30分間インキュベートします。サンプルが完全に解離していることを目視で確認します。無細胞の透明な瞳孔の翼のキューティクルが関連しないことに注意してください。サンプルをサイトメーターにロードして、ファックス分析を開始します。次に、前方散乱と側方散乱を検出するチャンネルを選択し、細胞サイズと膜の複雑さを示します。DNAのDサイクルバイオレット染色を検出するには、バイオレットレーザー励起からVL1つの高さ、幅、面積を測定する必要があります。また、青色レーザーチャネルの1つの領域を選択して、GFP蛍光を測定します。RFP解析には、青色レーザーチャネル3を使用します。attune のこのチャネルは、RFP 検出用に最適化されています。ゲート1を使用してストッププロットを生成する分析からデブリと塊を販売し、SSC対FSCのプロットでデブリと凝集物を除外するためにゲートを設定します。VLの1つの領域とVLの1つの領域のプロットでSSCとFSCのプロットでデブリと凝集物を除外し、GA 2を使用して、未染色の細胞サブG1のアポトーシス細胞と細胞塊を除外します一重項の同定に基づいて。GA 3 は、ゲート 1 と 2 内の細胞を含み、VE L 1 の高さに基づく蛍光と DNA 含量のプロットで GFP 陰性です。次に、歩行 4 は、蛍光対 DNA 含有量のプロットで GFP 陽性であるゲート 1 と 2 内の細胞を包含します。また、GFPと前方散乱で測定したセルサイズのドットプロットからゲート5と6を生成することもできます。細胞周期の位相を調べるには、ゲート 3 とゲート 4 で定義された集団の x 軸に DNA 含有量、Y ais に細胞数をプロットする 2 つのヒストグラムを使用します。セルサイズについては、ヒストグラムはゲート5と6に母集団を設定し、X軸にFSCをプロットし、実行中のサンプルは10, 000で停止するようにY軸にカウントを設定します。GFPの陽性イベントも300マイクロリットルの獲得量を設定しました。適切なしきい値と電圧の設定は、提供されているテンプレートに含まれています。サンプルを標準または高感度の100マイクロリットル/分で分析し、記録します。Attuneソフトウェアによって生成された記録データファイルはFCS形式であり、ほとんどの細胞周期モデリングソフトウェアと互換性があります。4つのドットプロットと2つのヒストグラムを含むこの代表的なワークスペースは、Grailed gal 4導入遺伝子によって駆動される、後翼でGFPとCyclin Dを発現する幼虫の翼サンプルを示しています。歩行 1 のセル サイズの最初のドット プロットは、破片と凝集体を除外しています。2番目のドットプロットは、GSPとDNAのプロットで未染色の細胞、サブG、1D、NA含量、および凝集を除外するために、歩行2でシングレットを区別します。GFP陰性細胞と陽性細胞は区別でき、x軸に沿った位置に基づいて2つのNと4つのNDNA含有量が明らかになります。このグラフは、GFPと前方散乱光で測定したセルサイズのプロットを使用して、ゲート5とゲート6を生成します。結果として得られた解析により、GFPまたはRFP陰性集団、ならびにGFPまたはRFP陽性細胞のDNA含有量とカウントのヒストグラムが得られます。提供されているRFPテンプレートを使用します。同じ組織タイプと発現パターンで同様の結果が得られます。RFP の場合、提供されているテンプレートと電圧は、幼虫の目、脳、翅、瞳孔の目、脳、翅の分析に適しています。attuned ソフトウェアで。細胞周期ヒストグラムまたは細胞サイズヒストグラムの自動スケール機能を使用すると、各集団のグローバル最大値を決定できます。これらの細胞周期プロファイルは、後部でGFPを発現する幼虫の眼のGFP陽性細胞と陰性細胞を表しています。GMR GAL 4 U-A-S-G-F-P 導入遺伝子を用いて、GFP 発現後部細胞の細胞周期の位相差を明らかにします。GFP陽性細胞と陰性細胞の間の細胞サイズの相対的な変化もプロットできます。この細胞周期プロファイルは、46時間A PFの瞳孔脳から導き出されました。GFP陽性細胞は、G one S調節因子、サイクリンDおよびE two Fを発現する系統追跡クローンであり、静止を妨害してS期の侵入につながります。これは、この段階で通常停止する非発現GFP陰性細胞とは対照的です。G 1では、attuneソフトウェアがヒストグラム上にユーザー定義の領域を生成し、G one sとG twoのフェーズを描きます。各実行の統計テーブルは、ユーザー定義の領域とパーセンテージ内のセルの絶対数を決定します。あるいは、mod fitなどのモデリングソフトウェアを使用して、各フェーズおよびアポトーシス細胞の割合を推定することもできます。このビデオを見れば、細胞周期解析のためにショウジョウバエからいくつかの組織を単離し、標識する方法を十分に理解できるはずです。

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生物学

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哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

SACは、姉妹染色分体の有糸分裂分離を監視し、その信号を開始する場所を動原体である。方法は、染色体の動きと動原体タンパク質とその調整のいずれかの採用と離職率を可視化するために記述されている...

リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;合胞体胚

本論文では、直接蛹殻を介して画像細胞挙動への高速走査型共焦点顕微鏡を使用する方法を示します。そのまま蛹ケースを残すことによって、このメソッドを直接学ぶことは困難であるショウジョウバエの発生段階で動的な細胞プロセスの観察と測定を可能にします。...

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

細胞分裂は、蛍光タグ付きタンパク質とタイムラプス顕微鏡を使用してリアルタイムで可視化することができます。ここで提示されるプロトコルを使用して、ユーザーは細胞分裂タイミングダイナミクス、ミトチックスピンドルアセンブリ、および染色体の議会と分離を分析することができます。RNA干渉(RNAi)媒介遺伝子ノックダウン後のこれらの事象の欠陥を評価し、定量することができる。...

細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。...

プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエの精細細胞を用いた細胞顕微鏡と固定細胞顕微鏡法により、無傷組織における細胞分裂を解析することである。このプロトコルは、ショウジョウバエ幼虫と初期の子犬から全体の無傷の精巣を分離する方法と、顕微鏡検査のためにそれらを処理し、マウントする方法を示しています。...

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。...

5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

学ぶショウジョウバエ組織の生細胞サイクル解析法。フローサイトメトリーと蛍光タンパク質標識を用いて細胞サイズとDNA含量を同時測定し、遺伝子操作の影響を定量的に評価する。

の生細胞サイクル分析

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