Name: Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Lernen Sie die nicht-gerichtete Metabolomik-Profilierung von Serum mittels UPLC-MS für die Biochemie. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung kleiner Moleküle als Biomarker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Das vorgestellte Tutorial wurde im Rahmen der Proteomics and Metabolomics Facility an der Colorado State University durchgeführt und entwickelt, die teilweise von den CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects finanziert wird.

1. Organisation von Beispielen
<ol>
	<li>Um eine Plattenkarte für die Probenvorbereitung in einer Tabelle zu erstellen, geben Sie in der ersten Spalte eine Probenliste in der Reihenfolge des Ladens ein. Geben Sie in einer zweiten Spalte die Positionen der 96-Well-Platten mit der korrekten Nomenklatur für Ihre Autosampler-Software ein.</li>
	<li>Bewahren Sie eine Vertiefung in jeder Platte für QC-Proben auf.</li>
	<li>Wenn Ihr LC-Autosampler mit zwei Platten gleichzeitig umgehen kann, teilen Sie die Probenliste in Chargen von 190 auf und speichern Sie diese Informationen in einem zweiten Arbeitsblatt.</li>
	<li>Verwenden Sie in jedem dieser Stapel die Zufallsfunktion [Hinweis: "=rand()"in Excel], um die Injektionsreihenfolge zu randomisieren. Kopieren Sie nun Ihren Injektionsauftrag und fügen Sie ihn in das LC-MS-Probenwarteschlangen-Softwaresystem ein. Die Randomisierung sollte zwischen Batches und innerhalb von Batches erfolgen und für alle Injektionsreplikate eindeutig sein.</li>
</ol>
2. Verfahren zur Probenvorbereitung im Serum und zur Qualitätskontrolle (QC)
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine 10-ml-Brühe einer QC-Probe vor, die mindestens vier Verbindungen mit bekannter Masse und Retentionszeit enthält, die sich über die chromatographische Elution des Experiments erstrecken. (Hinweis: Koffein, Reserpin, Sulfadimethoxin und Terfenadin in einer Konzentration von jeweils 2 μg/ml).</li>
	<li>Tauen Sie die Serumproben auf Eis auf und wirbeln Sie sie ~5 Sekunden lang leicht vortexen.</li>
	<li>Befeuchten Sie die Spitzen einer 12-Kanal-Pipettierung mit Methanol, um ein Nachtropfen der Spitze während der Probenabgabe zu verhindern. Geben Sie dann 370 μl kaltes Methanol in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 μl jeder Probe an die entsprechende Plattenposition aus den Plattenkarten. Decken Sie die Platten ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei -80 °C, um die Proteine auszufällen.</li>
	<li>Die Platten in einer 4 °C-Zentrifuge bei 3.200 x g für 30 min drehen. 250 μl Überstand in eine neue 96-Well-Zentrifugation umfüllen und die Zentrifugation wiederholen.</li>
	<li>Übertragen Sie nun 60 μl Aliquots des Überstands auf drei 96-Well-Platten, die für den UPLC- oder LC-Autosampler geeignet sind.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl QC-Probenmischung in die reservierte Well-Position auf der Platte.</li>
	<li>Versiegeln Sie jede Platte mit Klebefolie. Lösungsmittel kann nach dem Durchstechen der Vertiefung schnell verdunsten, daher sollten Injektionen nur einmal von jeder Platte durchgeführt werden. Platten in der Probenwarteschlange können kurzfristig bei -20 °C gelagert werden.</li>
</ol>
3. UPLC-MS Datenerfassung
<ol>
	<li>Stellen Sie den Autosampler auf 4 °C ein und legen Sie die ersten beiden Platten in den Autosampler.</li>
	<li>Richten Sie die Erfassungsmethode mit einem der beiden alternativen Umkehrphasengradienten ein. Gradient A ist in Richtung unpolarer Moleküle verzerrt, während Gradient B eine verbesserte Abdeckung von mäßig polaren Molekülen bietet.
	<ol>
		<li>Farbverlauf A: 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Zeit (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>Kurve</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,1</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1,0</td> kg
					<td>60</td>
					<td>40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3,0</td> kg
					<td>30</td>
					<td>70</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11,0</td> kg
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,0</td> kg
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,1</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23,0</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Farbverlauf B 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Zeit (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>Kurve</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16.05</td> Uhr
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stellen Sie das Massenspektrometer so ein, dass es Daten im positiven Modus von 50 bis 1.200 m/z erfasst. Zusätzliche spezifische Gerätebedingungen variieren je nach verwendetem System. Im Folgenden sind die Bedingungen dargestellt, die auf unserem Waters Xevo G2 Q-TOF-Massenspektrometer verwendet werden: Kollisionsenergie = 6 V; Scanzeit = 0,2 Sekunden pro Scan; Kapillarspannung = 2.200 V; Quelltemperatur = 150 °C Desolvationstemperatur = 350 °C Desolvatationsgasfluss (N2) = 800 l/h).</li>
	<li>Injizieren Sie die QC-Proben fünfmal zu Beginn jeder 2-Platten-Probencharge. Nach der Konditionierung des UPLC-MS-Systems mit den ersten beiden Injektionen ist die Peakfläche (<25 % RSD), die Retentionszeit (+/- 0,05 min) und die Massengenauigkeit (+/- 3 ppm) der dritten bis fünften Injektionen zu überwachen. Diese Parameter müssen möglicherweise an die Spezifikationen des Instruments angepasst werden, das für die Datenerfassung verwendet wird.</li>
	<li>Wenn QC-Proben erfolgreich sind, erfassen Sie Daten zu Serumproben für diese beiden Platten. Wenn QC-Proben fehlschlagen, werden die Probendaten erst erfasst, wenn das Problem behoben ist und die QC-Proben erfolgreich sind. In unserem Labor haben wir festgestellt, dass diese Parameter über drei Tage nach Injektionen (d. h. die Injektion von 2 96-Well-Platten) konstant stabil sind. Wenn sich herausstellt, dass Ihr System in diesem Zeitraum instabil ist, können häufigere QC-Injektionen angebracht sein. Die QC-Stichprobe wird nicht verwendet, um Daten von schlechter Qualität zu korrigieren, sondern um zu verhindern, dass Daten von schlechter Qualität jemals gesammelt werden.</li>
</ol>
4. Peak-Erkennung, Integration, Ausrichtung und Normalisierung
Es gibt eine Vielzahl von Optionen, um diese Schritte durchzuführen, einschließlich Freeware und herstellerspezifische Tools. Dieser Schritt wurde im Video-Tutorial übersprungen, aber unser Ansatz wird im Folgenden als Beispiel beschrieben.
Für jede Probe sind die analytischen Daten, die aus dieser Art von Experiment generiert werden, ein Profil von Ionen, wie es durch eine Retentionszeit, einen m/z-Wert und eine spektrale Intensität beschrieben wird. Ein nicht-zielgerichtetes Metaboliten-Profiling-Experiment wird aus vielen Proben bestehen, so dass Peak-Detektion, Retentionszeit-Alignment und Normalisierung durchgeführt werden müssen, um eine anschließende statistische Analyse des Datensatzes zu ermöglichen.
<ol>
	<li>Exportieren Sie Rohdaten in das .cdf-Format mit der Waters DataBridge-Software. Führen Sie die Peak-Erkennung und den Abgleich der Retentionszeit mit dem XCMS-Softwarepaket 10 durch (Freeware verfügbar unter <a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/</a>) und wird in der statistischen R-Umgebung11 ausgeführt). Auf der Website finden Sie Dokumentationen zum Herunterladen und Ausführen der Software.</li>
	<li>Verwenden Sie die Methode "matchedfilter" in XCMS mit den folgenden Parametern: volle Breite bei halbem Maximum = 8 Sekunden, S/N-Verhältnis = 3, maximal 100 Peaks für jedes extrahierte Ionenchromatogramm. Führen Sie die Schritte Feature-Gruppierung, Korrektur der Beibehaltungszeit, Neugruppierung und fillPeaks durch. Die Ausgabe der XCMS-Software ist eine Datenmatrix, in der alle erkennbaren Merkmale als Zeilen aufgelistet sind, jede experimentelle Probe als Spalte, und die Zellen werden mit dem Peakbereich jedes Merkmals in jeder Stichprobe gefüllt. Die Umsetzung dieses Datensatzes kann für die Integration in nachgelagerte statistische Arbeitsabläufe erforderlich sein.</li>
	<li>Normalisieren Sie die Datenmatrix in R, indem Sie die Peakfläche jedes Merkmals in einer gegebenen Probe durch die Summe der extrahierten Ionenpeakfläche dividieren (für diese Probe als Gesamtionenstrom oder TIC bezeichnet (multipliziert mit 100.000, um die Zahlen für die visuelle Dateninterpretation zugänglicher zu machen).</li>
	<li>Entfernen Sie Ausreißer. Ausreißer in den Daten können entweder aus einer fehlerhaften Injektion einer guten Stichprobe oder einer guten Injektion einer fehlerhaften Stichprobe resultieren.
	<ol>
		<li>Führen Sie die Ausreißererkennung in R mithilfe des Ausreißerpakets mit den folgenden Parametern durch: (1) TIC-Werte und (2) PC-Ergebnisse mit einer Konfidenz von 99,9 %.</li>
		<li>Wenn Ausreißer vorhanden sind, werden die entsprechenden Datendateien entfernt und die Peak-Erkennung, -Ausrichtung und -Normalisierung erneut durchgeführt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mittelwerten Sie die normalisierten Peakbereiche nach Probenkennung (um den Durchschnitt mehrerer Injektionen zu erhalten). Dies muss vor der Durchführung einer statistischen Analyse erfolgen (beachten Sie, dass Injektionsreplikate analytische Schwankungen berücksichtigen, aber nicht als echte biologische Replikate verwendet werden können).</li>
</ol>
5. Statistische Analyse
Für Metabolomik-Experimente sind sowohl multivariate als auch univariate statistische Techniken für die Dateninterpretation erforderlich. Zwei Techniken, die häufig verwendet werden, sind die Hauptkomponentenanalyse und die Varianzanalyse (ANOVA). Es gibt mehrere Möglichkeiten, sich der statistischen Analyse der Daten zu nähern, und es stehen sowohl Open-Source- als auch kommerzielle Softwaretools zur Verfügung. Dieser Schritt wurde im Video-Tutorial übersprungen, aber unser Ansatz wird im Folgenden als Beispiel beschrieben.
<ol>
	<li>Führen Sie eine ANOVA durch, indem Sie eine aov-Funktion auf das Dataset in R anwenden.</li>
	<li>Berücksichtigen Sie Fehlalarme mit einer Benjamini-Hochberg-Anpassung (p.adjust-Funktion in R).</li>
	<li>Führen Sie eine PCA mit dem paretoskalierten (Einheitenvarianz kann auch angewendet werden) und dem mittelwertzentrierten Datensatz durch. Sowohl PC-Scores als auch Loadings werden mit dem Paket pcaMethods in R berechnet.</li>
	<li>Verwenden Sie ANOVA-p-Werte, Belastungswerte und Faltungsänderungsparameter, um molekulare Merkmale zu bestimmen, die die mit der experimentellen Behandlung verbundene Variation am besten beschreiben.</li>
	<li>Untersuchen Sie jedes molekulare Merkmal von Interesse manuell, um festzustellen, ob es einem Molekülion, einem Addukt (z. B. Natrium, Kalium oder Dimer) oder einem neutralen Verlust entspricht.</li>
</ol>
6. Identifizierung von Metaboliten
Der hier vorgestellte Arbeitsablauf ist sehr allgemein gehalten und kann auf Ergebnisse von jeder Geräteplattform angewendet werden. Eine alternative Strategie wird im Abschnitt Diskussion vorgestellt.
<ol>
	<li>Überprüfen Sie für alle statistisch signifikanten Merkmale (wie aus der Analyse in Schritt 6 ermittelt) die Rohdaten und bestätigen Sie, dass Elternionen, Natriumaddukte, Isotope und Fragmente im gesamten Datensatz ähnlichen Trends folgen. Zum Beispiel sollte der von der ANOVA abgeleitete p-Wert für ein Mutterion ähnlich wie sein Isotop sein. Dies deutet darauf hin, dass beide molekularen Merkmale dem gleichen Metaboliten entsprechen.</li>
	<li>Durchsuchen Sie genaue Massenmessungen und/oder neutrale Verluste statistisch signifikanter molekularer Merkmale (wählen Sie das C12-Isotop, wenn mehrere Isotope signifikant sind) mit internen (falls verfügbaren) oder öffentlich zugänglichen Metabolitendatenbanken, wie z. B.:
	<ol class="lroman">
		<li>Datenbank für menschliche Metabolome (<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>Metlin (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>Massenbank (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>Lipid-Maps (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>Nationales Institut für Normung und Technologie MS Search (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verwenden Sie Software, um eine Summenformel aus der genauen Massen- und Isotopenverteilung Ihrer signifikanten molekularen Merkmale vorherzusagen. In der Waters-Software wird dies mit dem Elemental Comp-Tool im MassLynx-Paket durchgeführt.</li>
	<li>Filtern Sie die Identifizierung von Metabolitenkandidaten nach: Massenfehler (je nach Eignung für Ihre Geräteplattform), vorhergesagter Summenformel, biologischer Relevanz in den beobachteten Trends in Bezug auf das Versuchsdesign und Retentionszeit (z. B. haben Lipide und andere unpolare Verbindungen längere Retentionszeiten, wenn sie Umkehrphasenchromatographie verwenden).</li>
	<li>Führen Sie nachfolgende Experimente durch, um die MS/MS-Fragmentierung für statistisch signifikante molekulare Merkmale zu erfassen. Wann immer möglich, sollte die Identifizierung von Metaboliten auf dem Abgleich der experimentellen Fragmentierungsspitzen und der Retentionszeit mit denen eines authentischen Standards beruhen, der mit demselben Gerät erfasst wurde. Alternativ kann die experimentelle Fragmentierung mit einer spektralen Datenbank abgeglichen werden.</li>
	<li>Allen gemeldeten Metabolitenidentifikationen sollte auf der Grundlage der Empfehlungen der Metabolomics-Standards-Initiative12. eine Identifizierungssicherheit zugewiesen werden.
	Stufe 1: Sichere molekulare Identifizierung auf der Grundlage orthogonaler analytischer Parameter (genaue Masse, Retentionszeit und MS/MS-Fragmentierung) im Vergleich zu einer authentischen Verbindung. 
	Stufe 2 bezieht sich auf eine mutmaßliche Identifizierung auf der Grundlage physikalisch-chemischer Eigenschaften und/oder spektraler Ähnlichkeit mit Literatur oder Spektralbibliotheken. 
	Stufe 3 bezieht sich auf die vermeintliche Identifizierung einer Verbindungsklasse auf der Grundlage physikalisch-chemischer Eigenschaften oder spektraler Ähnlichkeit. 
	Stufe 4 bezieht sich auf eine unbekannte Verbindung.</li>
</ol>

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
<li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS-based+analysis+of+human+plasma+for+metabonomics+using+solvent+precipitation+or+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li>
<li>Kamburov, A., Cavill, R., Ebbels, T. M., Herwig, R., Keun, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+pathway-level+analysis+of+transcriptomics+and+metabolomics+data+with+IMPaLA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrated pathway-level analysis of transcriptomics and metabolomics data with IMPaLA.</a> Bioinformatics. 27, 2917-2918 (2011).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetPA%3A+a+web-based+metabolomics+tool+for+pathway+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization.</a> Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).</li>
<li>Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of metabolomics.</a> J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).</li>
<li>Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+discovery%3A+Opportunities+and+pitfalls+in+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods.</a> Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).</li>
<li>Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based metabolomics.</a> Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).</li>
<li>Weckwerth, W., Morgenthal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+from+pattern+recognition+to+biological+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation.</a> Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN+-+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN - A metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Culpepper, S. A., Aguinis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+is+for+Revolution%3A+A+Cutting-Edge%2C+Free%2C+Open+Source+Statistical+Package%5BTitle%5D)+AND+%22Organ+Res.+Methods%22%5BJournal%5D)">R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package.</a> Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3, 211-221 (2007).</li>
<li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 1523-1548 (2012).</li>
<li>Garcia-Canaveras, J. C., Donato, M. T., Castell, J. V., Lahoz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+untargeted+metabonomic+analysis+of+human+steatotic+liver+tissue+by+RP+and+HILIC+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+reveals+important+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive untargeted metabonomic analysis of human steatotic liver tissue by RP and HILIC chromatography coupled to mass spectrometry reveals important metabolic alterations.</a> Journal of Proteome Research. 10, 4825-4834 (2011).</li>
<li>Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ionization+mass+spectrometry+strategy+used+to+reveal+the+complexity+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).</li>
<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Advances in metabolite identification.</a> Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).</li>
<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
<li>Kangas, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identification+software+%28ISIS%29%3A+a+machine+learning+approach+to+tandem+mass+spectral+identification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids.</a> Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Tutorial soll als Ausgangspunkt für die Durchführung groß angelegter nicht-zielgerichteter Metaboliten-Profilierung mittels UPLC-MS dienen. Der Arbeitsablauf konzentriert sich auf Metaboliten, die mit einem wässrigen Methanollösungsmittel extrahiert, auf einer C8- oder C18-UPLC-Säule zurückgehalten und als positive Ionen nachgewiesen werden können. In der Situation, in der es keine vorgegebene Verzerrung gegenüber einer bestimmten Metabolitenklasse gibt und eine Hypothese zur Erstellung eines globalen Profils gewü...

Der Begriff "Metabolomik" kann viele Dinge umfassen. Zum Beispiel kann ein Metabolomik-Experiment mit einer Vielzahl von analytischen Plattformen wie NMR und sowohl Gas- und/oder Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie durchgeführt werden. Darüber hinaus können Metabolomik-Experimente gezielt oder nicht zielgerichtet oder in einer Kombination aus beidem durchgeführt werden. Ein gezieltes Metabolomik-Experiment beinhaltet die gerichtete Analyse einer Gruppe von Molekülen, die für die vorliegende biologische Fragestellung wichtig sind (z. B. ermöglichen kleine Moleküle, die am TCA-Zyklus beteiligt sind, eine genaue Quantifizierung dieses Signalwegs). In dieser Situation diktiert die biologische Hypothese die Auswahl der Metaboliten, auf die die Analyse abzielt, und die analytischen Schritte werden für den Nachweis dieser Moleküle optimiert. Alternativ kann auch ein nicht-zielgerichtetes Metabolomik-Experiment zur Hypothesengenerierung verwendet werden. In diesem Fall wird das Experiment breit und unvoreingenommen durchgeführt, um den Nachweis möglichst vieler Metaboliten zu ermöglichen. Die Ergebnisse eines nicht zielgerichteten Experiments werden den nächsten Schritt der Forschung vorantreiben (der in vielen Fällen einen gezielten Metabolomik-Workflow beinhalten kann). Es ist auch möglich, die beiden Ansätze zu kombinieren, wobei in diesem Fall ein Experiment nicht zielgerichtet durchgeführt wird, während gleichzeitig eine Gruppe bekannter Moleküle innerhalb der Daten überwacht wird. 
Das hier vorgestellte Tutorial konzentriert sich speziell auf die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum. Wie oben beschrieben, bietet der nicht-zielgerichtete Ansatz einen unvoreingenommenen Blick auf die nachweisbaren Metaboliten, kann große Mengen an Informationen generieren und letztendlich neue Entdeckungen ermöglichen. Die Anwendung dieses Ansatzes, bei dem speziell die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (UPLC-MS) eingesetzt wird, wird immer häufiger 1, 2, 3 und umfasst die folgenden Schritte: (1) Versuchsplanung (2) Probenentnahme (3) Probenvorbereitung (4) Datenerfassung mittels UPLC-MS (5) Datenvorverarbeitung (Peak-Detektion, Integration, Ausrichtung und Normalisierung) (6) statistische Datenanalyse (sowohl uni- als auch multivariat) (7) Metabolitenidentifikation und (8) biologische Auslegung. 
Derzeit gibt es keine etablierten Standardmethoden für UPLC-MS-basiertes nicht-zielgerichtetes Metaboliten-Profiling und nachfolgende Datenvorverarbeitungsschritte. Dieser Mangel an Standardisierung ist zum Teil auf eine der wichtigsten analytischen Herausforderungen bei der Erstellung von Metabolitenprofilen zurückzuführen. die chemische Vielfalt des Metaboloms. Aufgrund dieser Vielfalt ist es unmöglich, dass eine einzige Extraktionsmethode oder eine Massenspektrometrie-Erfassungsmethode eine umfassende Abdeckung aller Metaboliten in einer einzigen Analyse bietet. Konzeptionell kann die Metabolitenabdeckung durch die Verwendung mehrerer Extraktionen (z. B. wässrig, Methanol, Chloroform:Methanol usw.) in Verbindung mit verschiedenen chromatographischen Bedingungen (z. B. Umkehrphase, HILIC usw.) und verschiedenen Ionisationsmodi (z. B. positives Ion, negatives Ion, chemische Ionisation usw.) maximiert werden.). Oft haben Forscher jedoch keine vorgegebene Voreingenommenheit für eine bestimmte chemische Klasse, so dass die Kosten für die Durchführung mehrerer Extraktionen und Instrumentenbeschaffungen nicht gerechtfertigt sind, insbesondere bei groß angelegten Experimenten. Daher wurde das hier vorgestellte Video-Tutorial entwickelt, um ein allgemeines Verfahren für die groß angelegte nicht-zielgerichtete Metabolitenprofilierung von Serum mittels UPLC-MS bereitzustellen. Es wird neuen und etablierten Laboratorien ermöglichen, diese Art von Experimenten durchzuführen, und die Bausteine, auf denen sie den Ansatz für verschiedene Probentypen, spezifische chemische Klassen oder gezielte Analysen erweitern können. Konkret umfasst dieses Protokoll die folgenden Schritte: Vorbereitung der Serumprobe, Probenorganisation für groß angelegte Studien, UPLC-MS-Datenerfassung, Qualitätskontrollverfahren (QC) und Identifizierung von Metaboliten. Strategien zur Datenvorverarbeitung und statistischen Analyse werden ebenfalls vorgestellt.
Das Protokoll konzentriert sich nicht auf die Schritte der Versuchsplanung, der Probenentnahme oder der Interpretation biologischer Daten, da es außerhalb des Rahmens dieses Tutorials liegt. In der Literatur gibt es jedoch viele Ressourcen zu diesen Themen, und die Autoren ermutigen Forscher, die neu in der Metabolomik sind, diese gründlich zu untersuchen 4, 5, 6, 7, 8, 9. Insbesondere das Versuchsdesign ist äußerst wichtig und entscheidend für den Erfolg eines nicht-zielgerichteten Metabolomik-Experiments. Faktoren wie eine angemessene biologische Replikation und Konsistenz des Probenentnahmeverfahrens (z. B. Zeit auf dem Labortisch, Lagertemperatur, Lagerzeit, Frost-Tau-Zustand usw.) müssen berücksichtigt werden, um eine tragfähige Studie zu gewährleisten und eine angemessene biologische Interpretation der Daten zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platten - 500 &mu; l Wells</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>Diese werden für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet 96 Well Plattenmatten</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>Diese werden für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet 96 Well Platten - 350 &mu; l Brunnen</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT058943</td><td>Diese werden für die Probeninjektion</td></tr> verwendet <tr><td>96 Well Plattenmatten</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>Diese werden für die Probeninjektion verwendet</td></tr><tr><td>96 Well Platten Heißsiegel</td><td>Waters Corporation</td><td>186002789</td><td>Diese können für die Probeninjektion oder Langzeitlagerung verwendet werden</td></tr><tr><td>96 Well Platte Heißsiegel </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>Methanol in LC-MS-Qualität</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril in LC-MS-Qualität</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS-Qualität aater</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure in LC-MS-Qualität</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Mehrkanalpipette</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Eclipse (gekauft über Light Labs)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - Kontakt Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) System</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - Kontakt Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>UPLC C8 Säule (Gradientenoption a)</td><td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UplC T3 Säule (Gradientenoption b) </td><td>Wasser Corporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF Massenspektrometer</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - Kontakt Waters Corporation</td><td></td></tr></tbody></table>

large scale non gezielte metabolomic profiling von serum von ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels. Der Ansatz bietet eine unvoreingenommene und tiefgehende Analyse, die die Entwicklung diagnostischer Tests und neuartiger Therapien ermöglichen und unser Verständnis von Krankheitsprozessen verbessern kann. Die inhärente chemische Vielfalt des Metaboloms stellt erhebliche analytische Herausforderungen dar, und es gibt keinen einzigen experimentellen Ansatz, der alle Metaboliten nachweisen kann. Darüber hinaus erfordert die biologische Variation des individuellen Stoffwechsels und die Abhängigkeit des Stoffwechsels von Umweltfaktoren große Stichprobenzahlen, um die für eine aussagekräftige biologische Interpretation erforderliche statistische Aussagekraft zu erreichen. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, skizziert dieses Tutorial einen analytischen Arbeitsablauf für die groß angelegte nicht-zielgerichtete Metabolitenprofilierung von Serum mittels UPLC-MS. Das Verfahren umfasst Richtlinien für die Probenorganisation und -vorbereitung, die Datenerfassung, die Qualitätskontrolle und die Identifizierung von Metaboliten und wird eine zuverlässige Datenerfassung für große Experimente ermöglichen und einen Ausgangspunkt für Laboratorien bieten, die noch keine Erfahrung mit der Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen durch UPLC-MS haben.

Die grundlegenden analytischen Schritte eines nicht-zielgerichteten Metabolitenprofiling-Experiments mittels UPLC-MS sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Rohdaten jeder Probe können als Basissignal-Chromatogramm visualisiert werden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel eines Basissignal-Chromatogramms einer Serumprobe, analysiert mit dem Gradientenoption (a) aus dem Tutorial. Nach der statistischen Analyse, wie oben beschrieben, wird die Identifizierung aller statistisch signifikanten molekula...

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels. In diesem Artikel wird ein typischer Arbeitsablauf für die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum beschrieben, einschließlich Probenorganisation und -vorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Metabolitenidentifizierung.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine robuste, nicht gezielte Metabolit-Profilierung von Serum im Rahmen eines groß angelegten Experiments durchzuführen. Zuerst werden die Metaboliten im Plattenformat extrahiert. Anschließend wird eine robuste QC-Probe und -Methode etabliert, um die analytische Stabilität über die Zeit hinweg sicherzustellen.Danach massenspektrometrische Daten in QC- und randomisierten Serumproben in technischen Wiederholungen erfassen, anschließend fortfahren mit der Datenpräprozessierung, statistischen Analyse und Metabolitenidentifizierung. Die Ergebnisse der nicht gezielten Metabolitenprofilerstellung mittels U-P-L-C-M-S können zur Identifizierung kleiner Molekül-Biomarker im Serum genutzt werden. Das Protokoll wird hier für die Analyse von Serum präsentiert.Es kann jedoch leicht auf die Analyse anderer biologischer Flüssigkeiten wie Urin, Gewebe und Zellkultur-Extrakte erweitert werden. Um eine Plattenkarte für die Probenvorbereitung zu erstellen, öffnen Sie eine Tabellenkalkulation. Tragen Sie in der ersten Spalte die Probenliste in der Reihenfolge des Beladens ein. Tragen Sie in der zweiten Spalte die Positionen in der 96-Loch-Platte u

large-scale-non-targeted-metabolomic-profiling-serum-ultra

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Metabolite Profiling hat sich in der Studie der Stoffwechsel in Gesundheit und Krankheit ein wertvolles Gut. Verwendung normaler-Phasen-Flüssigkeits-Chromatographie, um hochauflösende Massenspektrometrie mit Polaritätsumschaltung und eine schnelle Arbeitszyklus gekoppelt ist, beschreiben wir ein Protokoll zur Analyse der Stoffwechselpolar Zusammensetzung von biologischem Material mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung.

Eine Strategie für einfühlsam, Large Scale Quantitative Metabolomics

Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse in metabolomics Experimente abhängig von der Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit der Probenvorbereitung. Beschrieben ist eine strenge und gründliche Methode, die Extraktion von Metaboliten aus biologischen Flüssigkeiten können mit der Option, später die Analyse bis zu Tausenden von Verbindungen, oder einfach nur die Verbindungsklassen von Interesse.

Multi-Schritt-Technik zur Vorbereitung mehrere Metabolite Verbindungsklassen für In-Tiefe und Informative Metabolomic Analyse Recover

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll, um präzise quantitate Proteine mit Isobaren Kennzeichnung, umfangreiche Fraktionierung, Bioinformatik und Qualitätskontrolle Schritte in Kombination mit Flüssigkeitschromatographie eine Schnittstelle zu einem hochauflösenden Massenspektrometer.

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Ein detailliertes Protokoll wird für die Trennung, Identifikation und Charakterisierung von Proteoforms in Proteinproben mit Kapillare Zone Elektrophorese-Electrospray Ionisierung-Tandem-Massenspektrometrie (CZE-ESI-MS/MS) beschrieben. Das Protokoll kann für die hochauflösende Charakterisierung von Proteoforms in einfachen Proteinproben und der großen Identifikation von Proteoforms in komplexen Proteom Proben verwendet werden.

Groß angelegte Top-Down-Proteomik mit Kapillare Zone Elektrophorese Tandem-Massenspektrometrie

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Verfahren zur umfassenden Droge-Überwachung, die für die verbesserte Auflösung und Erkennung von großen Platten von Medikamenten, Missbrauch und deren Metabolite mit Qualitätskontrolle auf multisegment-Injektion-Kapillare ermöglicht Elektrophorese-Massenspektrometrie.

High-Throughput und umfassende Droge-Überwachung mittels Massenspektrometrie Multisegment-Injektion-Kapillar-Elektrophorese

Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Die Protokolle beschreiben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methoden, gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Untersuchung von Stoffwechselreaktionen in komplexen lysatbasierten zellfreien Systemen.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, phenolische Metaboliten im Plasma mit einer semi-zielgerichteten Chromatographie-Massenspektrometrie-Methode nachzuweisen.

Semi-zielgerichtete Ultra-Hochleistungschromatographie gekoppelt mit massenspektrometrie Analyse von phenolischen Metaboliten im Plasma älterer Erwachsener

Säugetier-Hülle enthält Lösungsmittel extrahierbaren Lipide, die chemischen Zusammensetzungen der einzelnen Arten charakteristisch bieten kann. Dieser Beitrag stellt eine Routinemethode zur Trennung breiten Lipidklassen aus Integumentary Geweben isoliert mit Dünnschicht-Chromatographie und Bestimmung der Triacylglycerid Profil von Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time-of-Flight-Massenspektrometrie.

Profilierung der Triacylglycerid Inhalt in Bat Integumentary Lipide durch präparative Dünnschicht-Chromatographie und MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Lernen Sie die nicht-gerichtete Metabolomik-Profilierung von Serum mittels UPLC-MS für die Biochemie. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung kleiner Moleküle als Biomarker.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) (Video) | JoVE Journal

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Weitere Videos entdecken