Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in einem groß angelegten Experiment ein robustes, nicht zielgerichtetes Metaboliten-Profiling von Serum durchzuführen. Extrahieren Sie zunächst die Metaboliten in einem Plattenformat. Etablieren Sie eine robuste QC-Probe und -Methode, um die analytische Stabilität im Laufe der Zeit zu gewährleisten.

Erfassen Sie dann massenspektrale Massendaten von QC- und randomisierten Serumproben in der Replikation, fahren Sie mit den Daten, der Vorverarbeitung, der statistischen Analyse und der Identifizierung von Metaboliten fort. Die Ergebnisse der nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilierung mittels U-P-L-C-M-S können zur Identifizierung von niedermolekularen Biomarkern im Serum genutzt werden. Hier wird das Protokoll für die Analyse von Serum vorgestellt.

Es kann jedoch leicht auf die Analyse anderer biologischer Flüssigkeiten wie Urin, Gewebe und Zellkulturextrakte ausgeweitet werden. Um eine Plattenkarte für die Probenvorbereitung zu erstellen, öffnen Sie eine Tabelle Geben Sie in der ersten Spalte die Probenliste in der Reihenfolge des Ladens ein. Geben Sie in der zweiten Spalte die Positionen der 96-Well-Platten mit der korrekten Nomenklatur für Ihre Auto-Sampler-Software ein.

Bewahren Sie eine Vertiefung in jeder Platte für die QC-Probe auf. Wenn Ihr lc autos Probenehmer zwei Platten gleichzeitig verarbeiten kann, teilen Sie die Probenliste in Chargen von 190 auf und speichern Sie diese Informationen in einem zweiten Arbeitsblatt. Randomisieren Sie innerhalb jeder dieser Chargen die Injektionsreihenfolge.

Kopieren Sie nun Ihren Injektionsauftrag und fügen Sie ihn in das LCMS-Probenwarteschlangen-Softwaresystem ein. Reservieren Sie die ersten drei Zeilen der Probenwarteschlange für Säulenkonditionierungsinjektionen. Bereiten Sie eine 10-Milliliter-Probe mit QC-Probe vor, die mindestens vier Verbindungen mit bekannter Masse und Retentionszeit enthält, die sich über die chromatographische Elution des Experiments erstrecken.

Tauen Sie die Serumproben auf Eis auf und wirbeln Sie sie etwa fünf Sekunden lang sanft ein. Befeuchten Sie die Spitzen einer 12-Kanal-Pipettiermaschine mit Methanol, um ein Nachtropfen der Spitze während der Probenabgabe zu verhindern. Geben Sie dann 370 Mikroliter kaltes Methanol in jede Vertiefung eines 96-Well-Plattentransfers und 100 Mikroliter jeder Probe in die entsprechende Plattenposition aus den Plattenkarten.

Die Platten abdecken und bei minus 80 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren. Um die Proteine auszufällen, zentrifugieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 3.200 g und vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann 250 Mikroliter des Überstands auf eine neue 96-Well-Platte und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt.

Übertragen Sie nun 60 Mikroliter Aliquots des Snats auf 3 96-Well-Platten, die für den UPLC- oder lc autos-Sampler geeignet sind. Geben Sie 100 Mikroliter QC-Probenmischung in die reservierte Well-Position auf der Platte. Versiegeln Sie jede Platte mit Klebefolie.

Stellen Sie den Autos-Sampler auf vier Grad Celsius ein. Lege die ersten beiden Platten in den Autos-Sampler. Richten Sie die Erfassungsmethode mit einem der beiden alternativen Umkehrphasengradienten ein.

Gradient A ist in Richtung unpolarer Moleküle verzerrt. Während Gradient B eine verbesserte Abdeckung von mäßig polaren Molekülen bietet. Stellen Sie das Massenspektrometer so ein, dass es Daten im positiven Modus sammelt und von einem Massenladungsverhältnis von 50 bis 1200 scannt.

Zusätzliche spezifische Gerätebedingungen variieren je nach dem System, das zu Beginn der beiden Geräte verwendet wird. Platten-Patch der Proben Injizieren Sie die QC-Proben fünfmal manuell. Verwenden Sie die dritte bis fünfte QC-Injektion, um die Spitzenfläche von weniger als 25 %, die RSD-Retentionszeit von plus/minus 0,05 Minuten und eine Massengenauigkeit von plus/minus drei Teilen pro Million zu überwachen.

Diese Parameter müssen möglicherweise an die Spezifikationen des Instruments angepasst werden, das für die Datenerfassung verwendet wird. Wenn die QC-Proben erfolgreich sind, erfassen Sie Daten zu Serumproben für diese beiden Platten, wenn die Erfassung des gesamten Datensatzes abgeschlossen ist. Führen Sie die Merkmalserkennung, Ausrichtung und Normalisierung der Massenspektrometriedaten für den gesamten Datensatz durch.

Führen Sie dann statistische Analysen durch, um molekulare Merkmale von biologischem Interesse zu bestimmen. Diese Schritte sind im Textprotokoll beschrieben. Der folgende Arbeitsablauf gibt einen konzeptionellen Überblick über den Prozess der Metabolitenidentifizierung.

Eine alternative Strategie ist im Textprotokoll vorgesehen. Verwenden Sie Software, um eine Summenformel aus der genauen Massen- und Isotopenverteilung der signifikanten molekularen Merkmale vorherzusagen. Suchen Sie als Nächstes nach genauen Massenmessungen im Vergleich zu internen oder öffentlichen Metaboliten.

Datenbanken filtern den Kandidatenmetaboliten, die Identifizierung nach Massenfehler, die vorhergesagte Summenformel, die Retentionszeit, die Insource-Fragmentierung und die biologische Relevanz in den beobachteten Trends in Bezug auf das Versuchsdesign. Dies wird zu einer mutmaßlichen Identifizierung der Metaboliten führen. Die absolute Identifizierung erfordert den Abgleich der genauen Massenretention, der Zeit und der Fragmentierung für die experimentelle Verbindung mit einem authentischen Standard des mutmaßlichen Metaboliten.

Weisen Sie schließlich allen gemeldeten Metabolitenidentifikationen auf der Grundlage der Empfehlungen der Initiative für metabolomische Standards eine Identifizierungssicherheit zu. Dieser Arbeitsablauf zeigt die grundlegenden analytischen Schritte der Durchführung eines nicht-zielgerichteten Metaboliten-Profiling-Experiments mit U-P-L-C-M-S. Die Rohdaten können als Basis-Peak-Chromatogramm visualisiert werden.

Dieses Beispiel zeigt eine Serumprobe, die im Anschluss an die statistische Analyse mittels Gradient a analysiert wurde. Es wird versucht, alle biologisch wichtigen und statistisch signifikanten molekularen Merkmale mit Metaboliten zu identifizieren. Hier. Koffein wurde im Humanserum identifiziert, indem die chromatographische Retentionszeit, die genaue Masse und das Fragmentierungsmuster zwischen dem experimentellen molekularen Merkmal und einem authentischen Standard des mutmaßlichen Metaboliten abgeglichen wurden.

Dies ist ein Beispiel für die Identifizierung von Metaboliten der ersten Stufe Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die analytische Stabilität bei der großflächigen, nicht zielgerichteten Metabolitenprofilierung von Serumen mit UPLC ms sicherstellen können. Die analytische Stabilität ist jedoch nur ein wichtiger Aspekt eines erfolgreichen Metabolitenprofilierungsexperiments. Das experimentelle Design und die nachgelagerte Datenanalyse und -interpretation sind ebenfalls von entscheidender Bedeutung.

Aber außerhalb des Rahmens dieses Video-Tutorials werden diese Themen im Textprotokoll vorgestellt und diskutiert.