Name: Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Lernen Sie die nicht-gerichtete Metabolomik-Profilierung von Serum mittels UPLC-MS für die Biochemie. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Identifizierung kleiner Moleküle als Biomarker.

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Das vorgestellte Tutorial wurde im Rahmen der Proteomics and Metabolomics Facility an der Colorado State University durchgeführt und entwickelt, die teilweise von den CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects finanziert wird.

1. Organisation von Beispielen
<ol>
	<li>Um eine Plattenkarte für die Probenvorbereitung in einer Tabelle zu erstellen, geben Sie in der ersten Spalte eine Probenliste in der Reihenfolge des Ladens ein. Geben Sie in einer zweiten Spalte die Positionen der 96-Well-Platten mit der korrekten Nomenklatur für Ihre Autosampler-Software ein.</li>
	<li>Bewahren Sie eine Vertiefung in jeder Platte für QC-Proben auf.</li>
	<li>Wenn Ihr LC-Autosampler mit zwei Platten gleichzeitig umgehen kann, teilen Sie die Probenliste in Chargen von 190 auf und speichern Sie diese Informationen in einem zweiten Arbeitsblatt.</li>
	<li>Verwenden Sie in jedem dieser Stapel die Zufallsfunktion [Hinweis: "=rand()"in Excel], um die Injektionsreihenfolge zu randomisieren. Kopieren Sie nun Ihren Injektionsauftrag und fügen Sie ihn in das LC-MS-Probenwarteschlangen-Softwaresystem ein. Die Randomisierung sollte zwischen Batches und innerhalb von Batches erfolgen und für alle Injektionsreplikate eindeutig sein.</li>
</ol>
2. Verfahren zur Probenvorbereitung im Serum und zur Qualitätskontrolle (QC)
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine 10-ml-Brühe einer QC-Probe vor, die mindestens vier Verbindungen mit bekannter Masse und Retentionszeit enthält, die sich über die chromatographische Elution des Experiments erstrecken. (Hinweis: Koffein, Reserpin, Sulfadimethoxin und Terfenadin in einer Konzentration von jeweils 2 μg/ml).</li>
	<li>Tauen Sie die Serumproben auf Eis auf und wirbeln Sie sie ~5 Sekunden lang leicht vortexen.</li>
	<li>Befeuchten Sie die Spitzen einer 12-Kanal-Pipettierung mit Methanol, um ein Nachtropfen der Spitze während der Probenabgabe zu verhindern. Geben Sie dann 370 μl kaltes Methanol in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Übertragen Sie 100 μl jeder Probe an die entsprechende Plattenposition aus den Plattenkarten. Decken Sie die Platten ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei -80 °C, um die Proteine auszufällen.</li>
	<li>Die Platten in einer 4 °C-Zentrifuge bei 3.200 x g für 30 min drehen. 250 μl Überstand in eine neue 96-Well-Zentrifugation umfüllen und die Zentrifugation wiederholen.</li>
	<li>Übertragen Sie nun 60 μl Aliquots des Überstands auf drei 96-Well-Platten, die für den UPLC- oder LC-Autosampler geeignet sind.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl QC-Probenmischung in die reservierte Well-Position auf der Platte.</li>
	<li>Versiegeln Sie jede Platte mit Klebefolie. Lösungsmittel kann nach dem Durchstechen der Vertiefung schnell verdunsten, daher sollten Injektionen nur einmal von jeder Platte durchgeführt werden. Platten in der Probenwarteschlange können kurzfristig bei -20 °C gelagert werden.</li>
</ol>
3. UPLC-MS Datenerfassung
<ol>
	<li>Stellen Sie den Autosampler auf 4 °C ein und legen Sie die ersten beiden Platten in den Autosampler.</li>
	<li>Richten Sie die Erfassungsmethode mit einem der beiden alternativen Umkehrphasengradienten ein. Gradient A ist in Richtung unpolarer Moleküle verzerrt, während Gradient B eine verbesserte Abdeckung von mäßig polaren Molekülen bietet.
	<ol>
		<li>Farbverlauf A: 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Zeit (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>Kurve</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,1</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1,0</td> kg
					<td>60</td>
					<td>40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3,0</td> kg
					<td>30</td>
					<td>70</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11,0</td> kg
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,0</td> kg
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,1</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23,0</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Farbverlauf B 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Zeit (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>Kurve</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td> kg
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16.05</td> Uhr
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stellen Sie das Massenspektrometer so ein, dass es Daten im positiven Modus von 50 bis 1.200 m/z erfasst. Zusätzliche spezifische Gerätebedingungen variieren je nach verwendetem System. Im Folgenden sind die Bedingungen dargestellt, die auf unserem Waters Xevo G2 Q-TOF-Massenspektrometer verwendet werden: Kollisionsenergie = 6 V; Scanzeit = 0,2 Sekunden pro Scan; Kapillarspannung = 2.200 V; Quelltemperatur = 150 °C Desolvationstemperatur = 350 °C Desolvatationsgasfluss (N2) = 800 l/h).</li>
	<li>Injizieren Sie die QC-Proben fünfmal zu Beginn jeder 2-Platten-Probencharge. Nach der Konditionierung des UPLC-MS-Systems mit den ersten beiden Injektionen ist die Peakfläche (<25 % RSD), die Retentionszeit (+/- 0,05 min) und die Massengenauigkeit (+/- 3 ppm) der dritten bis fünften Injektionen zu überwachen. Diese Parameter müssen möglicherweise an die Spezifikationen des Instruments angepasst werden, das für die Datenerfassung verwendet wird.</li>
	<li>Wenn QC-Proben erfolgreich sind, erfassen Sie Daten zu Serumproben für diese beiden Platten. Wenn QC-Proben fehlschlagen, werden die Probendaten erst erfasst, wenn das Problem behoben ist und die QC-Proben erfolgreich sind. In unserem Labor haben wir festgestellt, dass diese Parameter über drei Tage nach Injektionen (d. h. die Injektion von 2 96-Well-Platten) konstant stabil sind. Wenn sich herausstellt, dass Ihr System in diesem Zeitraum instabil ist, können häufigere QC-Injektionen angebracht sein. Die QC-Stichprobe wird nicht verwendet, um Daten von schlechter Qualität zu korrigieren, sondern um zu verhindern, dass Daten von schlechter Qualität jemals gesammelt werden.</li>
</ol>
4. Peak-Erkennung, Integration, Ausrichtung und Normalisierung
Es gibt eine Vielzahl von Optionen, um diese Schritte durchzuführen, einschließlich Freeware und herstellerspezifische Tools. Dieser Schritt wurde im Video-Tutorial übersprungen, aber unser Ansatz wird im Folgenden als Beispiel beschrieben.
Für jede Probe sind die analytischen Daten, die aus dieser Art von Experiment generiert werden, ein Profil von Ionen, wie es durch eine Retentionszeit, einen m/z-Wert und eine spektrale Intensität beschrieben wird. Ein nicht-zielgerichtetes Metaboliten-Profiling-Experiment wird aus vielen Proben bestehen, so dass Peak-Detektion, Retentionszeit-Alignment und Normalisierung durchgeführt werden müssen, um eine anschließende statistische Analyse des Datensatzes zu ermöglichen.
<ol>
	<li>Exportieren Sie Rohdaten in das .cdf-Format mit der Waters DataBridge-Software. Führen Sie die Peak-Erkennung und den Abgleich der Retentionszeit mit dem XCMS-Softwarepaket 10 durch (Freeware verfügbar unter <a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/</a>) und wird in der statistischen R-Umgebung11 ausgeführt). Auf der Website finden Sie Dokumentationen zum Herunterladen und Ausführen der Software.</li>
	<li>Verwenden Sie die Methode "matchedfilter" in XCMS mit den folgenden Parametern: volle Breite bei halbem Maximum = 8 Sekunden, S/N-Verhältnis = 3, maximal 100 Peaks für jedes extrahierte Ionenchromatogramm. Führen Sie die Schritte Feature-Gruppierung, Korrektur der Beibehaltungszeit, Neugruppierung und fillPeaks durch. Die Ausgabe der XCMS-Software ist eine Datenmatrix, in der alle erkennbaren Merkmale als Zeilen aufgelistet sind, jede experimentelle Probe als Spalte, und die Zellen werden mit dem Peakbereich jedes Merkmals in jeder Stichprobe gefüllt. Die Umsetzung dieses Datensatzes kann für die Integration in nachgelagerte statistische Arbeitsabläufe erforderlich sein.</li>
	<li>Normalisieren Sie die Datenmatrix in R, indem Sie die Peakfläche jedes Merkmals in einer gegebenen Probe durch die Summe der extrahierten Ionenpeakfläche dividieren (für diese Probe als Gesamtionenstrom oder TIC bezeichnet (multipliziert mit 100.000, um die Zahlen für die visuelle Dateninterpretation zugänglicher zu machen).</li>
	<li>Entfernen Sie Ausreißer. Ausreißer in den Daten können entweder aus einer fehlerhaften Injektion einer guten Stichprobe oder einer guten Injektion einer fehlerhaften Stichprobe resultieren.
	<ol>
		<li>Führen Sie die Ausreißererkennung in R mithilfe des Ausreißerpakets mit den folgenden Parametern durch: (1) TIC-Werte und (2) PC-Ergebnisse mit einer Konfidenz von 99,9 %.</li>
		<li>Wenn Ausreißer vorhanden sind, werden die entsprechenden Datendateien entfernt und die Peak-Erkennung, -Ausrichtung und -Normalisierung erneut durchgeführt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mittelwerten Sie die normalisierten Peakbereiche nach Probenkennung (um den Durchschnitt mehrerer Injektionen zu erhalten). Dies muss vor der Durchführung einer statistischen Analyse erfolgen (beachten Sie, dass Injektionsreplikate analytische Schwankungen berücksichtigen, aber nicht als echte biologische Replikate verwendet werden können).</li>
</ol>
5. Statistische Analyse
Für Metabolomik-Experimente sind sowohl multivariate als auch univariate statistische Techniken für die Dateninterpretation erforderlich. Zwei Techniken, die häufig verwendet werden, sind die Hauptkomponentenanalyse und die Varianzanalyse (ANOVA). Es gibt mehrere Möglichkeiten, sich der statistischen Analyse der Daten zu nähern, und es stehen sowohl Open-Source- als auch kommerzielle Softwaretools zur Verfügung. Dieser Schritt wurde im Video-Tutorial übersprungen, aber unser Ansatz wird im Folgenden als Beispiel beschrieben.
<ol>
	<li>Führen Sie eine ANOVA durch, indem Sie eine aov-Funktion auf das Dataset in R anwenden.</li>
	<li>Berücksichtigen Sie Fehlalarme mit einer Benjamini-Hochberg-Anpassung (p.adjust-Funktion in R).</li>
	<li>Führen Sie eine PCA mit dem paretoskalierten (Einheitenvarianz kann auch angewendet werden) und dem mittelwertzentrierten Datensatz durch. Sowohl PC-Scores als auch Loadings werden mit dem Paket pcaMethods in R berechnet.</li>
	<li>Verwenden Sie ANOVA-p-Werte, Belastungswerte und Faltungsänderungsparameter, um molekulare Merkmale zu bestimmen, die die mit der experimentellen Behandlung verbundene Variation am besten beschreiben.</li>
	<li>Untersuchen Sie jedes molekulare Merkmal von Interesse manuell, um festzustellen, ob es einem Molekülion, einem Addukt (z. B. Natrium, Kalium oder Dimer) oder einem neutralen Verlust entspricht.</li>
</ol>
6. Identifizierung von Metaboliten
Der hier vorgestellte Arbeitsablauf ist sehr allgemein gehalten und kann auf Ergebnisse von jeder Geräteplattform angewendet werden. Eine alternative Strategie wird im Abschnitt Diskussion vorgestellt.
<ol>
	<li>Überprüfen Sie für alle statistisch signifikanten Merkmale (wie aus der Analyse in Schritt 6 ermittelt) die Rohdaten und bestätigen Sie, dass Elternionen, Natriumaddukte, Isotope und Fragmente im gesamten Datensatz ähnlichen Trends folgen. Zum Beispiel sollte der von der ANOVA abgeleitete p-Wert für ein Mutterion ähnlich wie sein Isotop sein. Dies deutet darauf hin, dass beide molekularen Merkmale dem gleichen Metaboliten entsprechen.</li>
	<li>Durchsuchen Sie genaue Massenmessungen und/oder neutrale Verluste statistisch signifikanter molekularer Merkmale (wählen Sie das C12-Isotop, wenn mehrere Isotope signifikant sind) mit internen (falls verfügbaren) oder öffentlich zugänglichen Metabolitendatenbanken, wie z. B.:
	<ol class="lroman">
		<li>Datenbank für menschliche Metabolome (<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>Metlin (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>Massenbank (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>Lipid-Maps (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>Nationales Institut für Normung und Technologie MS Search (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verwenden Sie Software, um eine Summenformel aus der genauen Massen- und Isotopenverteilung Ihrer signifikanten molekularen Merkmale vorherzusagen. In der Waters-Software wird dies mit dem Elemental Comp-Tool im MassLynx-Paket durchgeführt.</li>
	<li>Filtern Sie die Identifizierung von Metabolitenkandidaten nach: Massenfehler (je nach Eignung für Ihre Geräteplattform), vorhergesagter Summenformel, biologischer Relevanz in den beobachteten Trends in Bezug auf das Versuchsdesign und Retentionszeit (z. B. haben Lipide und andere unpolare Verbindungen längere Retentionszeiten, wenn sie Umkehrphasenchromatographie verwenden).</li>
	<li>Führen Sie nachfolgende Experimente durch, um die MS/MS-Fragmentierung für statistisch signifikante molekulare Merkmale zu erfassen. Wann immer möglich, sollte die Identifizierung von Metaboliten auf dem Abgleich der experimentellen Fragmentierungsspitzen und der Retentionszeit mit denen eines authentischen Standards beruhen, der mit demselben Gerät erfasst wurde. Alternativ kann die experimentelle Fragmentierung mit einer spektralen Datenbank abgeglichen werden.</li>
	<li>Allen gemeldeten Metabolitenidentifikationen sollte auf der Grundlage der Empfehlungen der Metabolomics-Standards-Initiative12. eine Identifizierungssicherheit zugewiesen werden.
	Stufe 1: Sichere molekulare Identifizierung auf der Grundlage orthogonaler analytischer Parameter (genaue Masse, Retentionszeit und MS/MS-Fragmentierung) im Vergleich zu einer authentischen Verbindung. 
	Stufe 2 bezieht sich auf eine mutmaßliche Identifizierung auf der Grundlage physikalisch-chemischer Eigenschaften und/oder spektraler Ähnlichkeit mit Literatur oder Spektralbibliotheken. 
	Stufe 3 bezieht sich auf die vermeintliche Identifizierung einer Verbindungsklasse auf der Grundlage physikalisch-chemischer Eigenschaften oder spektraler Ähnlichkeit. 
	Stufe 4 bezieht sich auf eine unbekannte Verbindung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dieses Tutorial soll als Ausgangspunkt für die Durchführung groß angelegter nicht-zielgerichteter Metaboliten-Profilierung mittels UPLC-MS dienen. Der Arbeitsablauf konzentriert sich auf Metaboliten, die mit einem wässrigen Methanollösungsmittel extrahiert, auf einer C8- oder C18-UPLC-Säule zurückgehalten und als positive Ionen nachgewiesen werden können. In der Situation, in der es keine vorgegebene Verzerrung gegenüber einer bestimmten Metabolitenklasse gibt und eine Hypothese zur Erstellung eines globalen Profils gewü...

Der Begriff "Metabolomik" kann viele Dinge umfassen. Zum Beispiel kann ein Metabolomik-Experiment mit einer Vielzahl von analytischen Plattformen wie NMR und sowohl Gas- und/oder Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie durchgeführt werden. Darüber hinaus können Metabolomik-Experimente gezielt oder nicht zielgerichtet oder in einer Kombination aus beidem durchgeführt werden. Ein gezieltes Metabolomik-Experiment beinhaltet die gerichtete Analyse einer Gruppe von Molekülen, die für die vorliegende biologische Fragestellung wichtig sind (z. B. ermöglichen kleine Moleküle, die am TCA-Zyklus beteiligt sind, eine genaue Quantifizierung dieses Signalwegs). In dieser Situation diktiert die biologische Hypothese die Auswahl der Metaboliten, auf die die Analyse abzielt, und die analytischen Schritte werden für den Nachweis dieser Moleküle optimiert. Alternativ kann auch ein nicht-zielgerichtetes Metabolomik-Experiment zur Hypothesengenerierung verwendet werden. In diesem Fall wird das Experiment breit und unvoreingenommen durchgeführt, um den Nachweis möglichst vieler Metaboliten zu ermöglichen. Die Ergebnisse eines nicht zielgerichteten Experiments werden den nächsten Schritt der Forschung vorantreiben (der in vielen Fällen einen gezielten Metabolomik-Workflow beinhalten kann). Es ist auch möglich, die beiden Ansätze zu kombinieren, wobei in diesem Fall ein Experiment nicht zielgerichtet durchgeführt wird, während gleichzeitig eine Gruppe bekannter Moleküle innerhalb der Daten überwacht wird. 
Das hier vorgestellte Tutorial konzentriert sich speziell auf die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum. Wie oben beschrieben, bietet der nicht-zielgerichtete Ansatz einen unvoreingenommenen Blick auf die nachweisbaren Metaboliten, kann große Mengen an Informationen generieren und letztendlich neue Entdeckungen ermöglichen. Die Anwendung dieses Ansatzes, bei dem speziell die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (UPLC-MS) eingesetzt wird, wird immer häufiger 1, 2, 3 und umfasst die folgenden Schritte: (1) Versuchsplanung (2) Probenentnahme (3) Probenvorbereitung (4) Datenerfassung mittels UPLC-MS (5) Datenvorverarbeitung (Peak-Detektion, Integration, Ausrichtung und Normalisierung) (6) statistische Datenanalyse (sowohl uni- als auch multivariat) (7) Metabolitenidentifikation und (8) biologische Auslegung. 
Derzeit gibt es keine etablierten Standardmethoden für UPLC-MS-basiertes nicht-zielgerichtetes Metaboliten-Profiling und nachfolgende Datenvorverarbeitungsschritte. Dieser Mangel an Standardisierung ist zum Teil auf eine der wichtigsten analytischen Herausforderungen bei der Erstellung von Metabolitenprofilen zurückzuführen. die chemische Vielfalt des Metaboloms. Aufgrund dieser Vielfalt ist es unmöglich, dass eine einzige Extraktionsmethode oder eine Massenspektrometrie-Erfassungsmethode eine umfassende Abdeckung aller Metaboliten in einer einzigen Analyse bietet. Konzeptionell kann die Metabolitenabdeckung durch die Verwendung mehrerer Extraktionen (z. B. wässrig, Methanol, Chloroform:Methanol usw.) in Verbindung mit verschiedenen chromatographischen Bedingungen (z. B. Umkehrphase, HILIC usw.) und verschiedenen Ionisationsmodi (z. B. positives Ion, negatives Ion, chemische Ionisation usw.) maximiert werden.). Oft haben Forscher jedoch keine vorgegebene Voreingenommenheit für eine bestimmte chemische Klasse, so dass die Kosten für die Durchführung mehrerer Extraktionen und Instrumentenbeschaffungen nicht gerechtfertigt sind, insbesondere bei groß angelegten Experimenten. Daher wurde das hier vorgestellte Video-Tutorial entwickelt, um ein allgemeines Verfahren für die groß angelegte nicht-zielgerichtete Metabolitenprofilierung von Serum mittels UPLC-MS bereitzustellen. Es wird neuen und etablierten Laboratorien ermöglichen, diese Art von Experimenten durchzuführen, und die Bausteine, auf denen sie den Ansatz für verschiedene Probentypen, spezifische chemische Klassen oder gezielte Analysen erweitern können. Konkret umfasst dieses Protokoll die folgenden Schritte: Vorbereitung der Serumprobe, Probenorganisation für groß angelegte Studien, UPLC-MS-Datenerfassung, Qualitätskontrollverfahren (QC) und Identifizierung von Metaboliten. Strategien zur Datenvorverarbeitung und statistischen Analyse werden ebenfalls vorgestellt.
Das Protokoll konzentriert sich nicht auf die Schritte der Versuchsplanung, der Probenentnahme oder der Interpretation biologischer Daten, da es außerhalb des Rahmens dieses Tutorials liegt. In der Literatur gibt es jedoch viele Ressourcen zu diesen Themen, und die Autoren ermutigen Forscher, die neu in der Metabolomik sind, diese gründlich zu untersuchen 4, 5, 6, 7, 8, 9. Insbesondere das Versuchsdesign ist äußerst wichtig und entscheidend für den Erfolg eines nicht-zielgerichteten Metabolomik-Experiments. Faktoren wie eine angemessene biologische Replikation und Konsistenz des Probenentnahmeverfahrens (z. B. Zeit auf dem Labortisch, Lagertemperatur, Lagerzeit, Frost-Tau-Zustand usw.) müssen berücksichtigt werden, um eine tragfähige Studie zu gewährleisten und eine angemessene biologische Interpretation der Daten zu erleichtern.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platten - 500 &mu; l Wells</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>Diese werden für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet 96 Well Plattenmatten</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>Diese werden für die Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet 96 Well Platten - 350 &mu; l Brunnen</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT058943</td><td>Diese werden für die Probeninjektion</td></tr> verwendet <tr><td>96 Well Plattenmatten</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>Diese werden für die Probeninjektion verwendet</td></tr><tr><td>96 Well Platten Heißsiegel</td><td>Waters Corporation</td><td>186002789</td><td>Diese können für die Probeninjektion oder Langzeitlagerung verwendet werden</td></tr><tr><td>96 Well Platte Heißsiegel </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>Methanol in LC-MS-Qualität</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril in LC-MS-Qualität</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS-Qualität aater</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure in LC-MS-Qualität</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Mehrkanalpipette</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Eclipse (gekauft über Light Labs)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - Kontakt Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) System</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - Kontakt Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>UPLC C8 Säule (Gradientenoption a)</td><td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UplC T3 Säule (Gradientenoption b) </td><td>Wasser Corporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF Massenspektrometer</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - Kontakt Waters Corporation</td><td></td></tr></tbody></table>

large scale non gezielte metabolomic profiling von serum von ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (uplc-ms)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels. Der Ansatz bietet eine unvoreingenommene und tiefgehende Analyse, die die Entwicklung diagnostischer Tests und neuartiger Therapien ermöglichen und unser Verständnis von Krankheitsprozessen verbessern kann. Die inhärente chemische Vielfalt des Metaboloms stellt erhebliche analytische Herausforderungen dar, und es gibt keinen einzigen experimentellen Ansatz, der alle Metaboliten nachweisen kann. Darüber hinaus erfordert die biologische Variation des individuellen Stoffwechsels und die Abhängigkeit des Stoffwechsels von Umweltfaktoren große Stichprobenzahlen, um die für eine aussagekräftige biologische Interpretation erforderliche statistische Aussagekraft zu erreichen. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, skizziert dieses Tutorial einen analytischen Arbeitsablauf für die groß angelegte nicht-zielgerichtete Metabolitenprofilierung von Serum mittels UPLC-MS. Das Verfahren umfasst Richtlinien für die Probenorganisation und -vorbereitung, die Datenerfassung, die Qualitätskontrolle und die Identifizierung von Metaboliten und wird eine zuverlässige Datenerfassung für große Experimente ermöglichen und einen Ausgangspunkt für Laboratorien bieten, die noch keine Erfahrung mit der Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen durch UPLC-MS haben.

Die grundlegenden analytischen Schritte eines nicht-zielgerichteten Metabolitenprofiling-Experiments mittels UPLC-MS sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Rohdaten jeder Probe können als Basissignal-Chromatogramm visualisiert werden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel eines Basissignal-Chromatogramms einer Serumprobe, analysiert mit dem Gradientenoption (a) aus dem Tutorial. Nach der statistischen Analyse, wie oben beschrieben, wird die Identifizierung aller statistisch signifikanten molekula...

Die nicht-gezielte Erstellung von Metabolitenprofilen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung des Stoffwechsels. In diesem Artikel wird ein typischer Arbeitsablauf für die Erstellung von nicht-zielgerichteten Metabolitenprofilen von Serum beschrieben, einschließlich Probenorganisation und -vorbereitung, Datenerfassung, Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Metabolitenidentifizierung.

Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine robuste, nicht gezielte Metabolit-Profilierung von Serum im Rahmen eines groß angelegten Experiments durchzuführen. Zuerst werden die Metaboliten im Plattenformat extrahiert. Anschließend wird eine robuste QC-Probe und -Methode etabliert, um die analytische Stabilität über die Zeit hinweg sicherzustellen.Danach massenspektrometrische Daten in QC- und randomisierten Serumproben in technischen Wiederholungen erfassen, anschließend fortfahren mit der Datenpräprozessierung, statistischen Analyse und Metabolitenidentifizierung. Die Ergebnisse der nicht gezielten Metabolitenprofilerstellung mittels U-P-L-C-M-S können zur Identifizierung kleiner Molekül-Biomarker im Serum genutzt werden. Das Protokoll wird hier für die Analyse von Serum präsentiert.Es kann jedoch leicht auf die Analyse anderer biologischer Flüssigkeiten wie Urin, Gewebe und Zellkultur-Extrakte erweitert werden. Um eine Plattenkarte für die Probenvorbereitung zu erstellen, öffnen Sie eine Tabellenkalkulation. Tragen Sie in der ersten Spalte die Probenliste in der Reihenfolge des Beladens ein. Tragen Sie in der zweiten Spalte die Positionen in der 96-Loch-Platte unter Verwendung der korrekten Nomenklatur für Ihre Software des Autosamplers ein.Behalten Sie eine Vertiefung in jeder Platte für die QC-Probe zurück. Wenn Ihr LC-Autosampler zwei Platten gleichzeitig verarbeiten kann, teilen Sie die Probenliste in Chargen von jeweils 190 ein und speichern Sie diese Informationen in einem zweiten Arbeitsblatt. Innerhalb jeder dieser Chargen randomisieren Sie die Injektionsreihenfolge.Kopieren Sie nun Ihre Injektionsreihenfolge in das Probeneingabe-System der LCMS-Software. Reservieren Sie die ersten drei Zeilen der Probeneingabe für Säulenkonditionierungsinjektionen. Bereiten Sie einen 10-Milliliter-Stamm der QC-Probe vor, der mindestens vier Verbindungen mit bekannter Masse und Retentionszeit enthält, die die chromatographische Elution des Experiments abdecken.Tauen Sie die Serumproben auf Eis auf und mischen Sie sie vorsichtig etwa fünf Sekunden lang durch Vortexen. Benetzen Sie die Spitzen eines 12-Kanal-Pipettiers mit Methanol, um Tropfenbildung an den Spitzen während der Probenausgabe zu verhindern. Geben Sie anschließend 370 µL kaltes Methanol in jedes Loch einer 96-Loch-Platte und übertragen Sie 100 µL jeder Probe an die entsprechende Position auf der Platte gemäß den Plattenplänen.Bedecken Sie die Platten und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei minus 80 Grad Celsius. Zum Ausfällen der Proteine zentrifugieren Sie die Platten bei 3.200 G und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Anschließend überführen Sie 250 Mikroliter des Überstandes in eine neue 96-Loch-Platte und wiederholen den Zentrifugationsschritt.Überführen Sie nun Aliquote von jeweils 60&nbsp;Mikroliter des Snat in drei für den UPLC- oder LC-Autosampler geeignete 96-Loch-Platten. Geben Sie 100&nbsp;Mikroliter der QC-Probenmischung in die reservierte Vertiefung der Platte. Versiegeln Sie jede Platte mit einer Haftfolie.Stellen Sie den Autosampler auf vier Grad Celsius ein. Platzieren Sie die ersten beiden Platten in den Autosampler. Richten Sie die Erfassungsmethode mit einem der beiden alternativen umgekehrten Phasengradienten ein.Die Gradientensäule A ist auf unpolare Moleküle ausgerichtet. Während Gradient B eine verbesserte Abdeckung von mäßig polaren Molekülen bietet. Stellen Sie das Massenspektrometer so ein, dass es Daten im positiven Modus erfasst und dabei das Massen-Ladungs-Verhältnis von 50 bis 1200 scannt.Zusätzliche spezifische Geräteeinstellungen variieren je nach verwendeter Systemkonfiguration zu Beginn jedes zweiten Durchlaufs. Führen Sie manuell eine Plattenpatch-Probe der Proben durch, und injizieren Sie die QC-Proben fünfmal. Nutzen Sie die dritte bis fünfte QC-Injektion, um den Peakfläche mit einem RSD von weniger als 25 %, die Retentionszeit mit ± 0,05 Minuten und die Massengenauigkeit mit ± 3 ppm zu überwachen.Diese Parameter müssen möglicherweise an die Spezifikationen des zur Datenerfassung verwendeten Instruments angepasst werden. Falls die QC-Proben bestanden werden, erfassen Sie die Daten der Serumproben für diese beiden Platten, sobald die Erfassung des gesamten Datensatzes abgeschlossen ist. Führen Sie die Merkmalsdetektion, -ausrichtung und -normalisierung der Massenspektrometriedaten für den gesamten Datensatz durch.Anschließend statistische Analysen durchführen, um molekulare Merkmale von biologischem Interesse zu ermitteln. Diese Schritte sind im Textprotokoll beschrieben. Der folgende Arbeitsablauf bietet einen konzeptionellen Überblick über den Prozess der Metabolitenidentifizierung.Eine alternative Strategie wird im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie Software, um anhand der genauen Masse und der isotopischen Verteilung der signifikanten molekularen Merkmale eine molekulare Formel vorherzusagen. Suchen Sie anschließend die genauen Massenmessungen in einer hauseigenen oder öffentlichen Metaboliten-Datenbank ab.Die Datenbanken filtern die Kandidaten-Metaboliten anhand des Massenfehlers, der vorhergesagten molekularen Formel, der Retentionszeit, der In-Source-Fragmentierung und der biologischen Relevanz im Zusammenhang mit den beobachteten Trends bezüglich des experimentellen Designs. Dies führt zu einer vorläufigen Identifizierung des Metaboliten. Die absolute Identifizierung erfordert die Übereinstimmung der genauen Masse, der Retentionszeit und der Fragmentierung der experimentellen Verbindung mit einem authentischen Standard des vorläufig identifizierten Metaboliten.Weisen Sie schließlich allen berichteten Metabolit-Identifizierungen basierend auf den Empfehlungen der Metabolomik-Standardsinitiative eine Identifizierungssicherheit zu. Dieser Arbeitsablauf zeigt die grundlegenden analytischen Schritte zur Durchführung eines nicht gezielten Metaboliten-Profilierungs-Experiments mittels U-P-L-C-M-S. Die Rohdaten können als Basis-Peak-Chromatogramm visualisiert werden.Dieses Beispiel zeigt eine Serumprobe, die mithilfe eines Gradienten analysiert wurde, anschließend erfolgte die statistische Auswertung. Für alle biologisch relevanten und statistisch signifikanten molekularen Merkmale wird eine Metabolitenidentifizierung versucht. Hier wurde Koffein in menschlichem Serum identifiziert, indem die chromatographische Retentionszeit sowie die genaue Masse und der Fragmentierungsmuster zwischen dem experimentellen molekularen Merkmal und einer echten Referenzsubstanz des vermuteten Metaboliten übereinstimmten.Dies ist ein Beispiel für eine Metabolitenidentifizierung der Stufe eins. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die analytische Stabilität während einer groß angelegten, nicht gezielten Metabolitenprofilerstellung in Serum unter Verwendung von UPLC-MS gewährleistet werden kann. Die analytische Stabilität ist jedoch nur ein wichtiger Aspekt eines erfolgreichen Metabolitenprofilerstellungs-Experiments. Auch das experimentelle Design sowie die nachgeschaltete Datenanalyse und -interpretation sind entscheidend.Außerhalb des Rahmens dieses Video-Tutorials werden diese Themen jedoch in der schriftlichen Anleitung eingeführt und erläutert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS) (Video) | JoVE Journal

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