Large Scale Non gezielte Metabolomic Profiling von Serum von Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine robuste, nicht gezielte Metabolit-Profilierung von Serum im Rahmen eines groß angelegten Experiments durchzuführen. Zuerst werden die Metaboliten im Plattenformat extrahiert. Anschließend wird eine robuste QC-Probe und -Methode etabliert, um die analytische Stabilität über die Zeit hinweg sicherzustellen.

Danach massenspektrometrische Daten in QC- und randomisierten Serumproben in technischen Wiederholungen erfassen, anschließend fortfahren mit der Datenpräprozessierung, statistischen Analyse und Metabolitenidentifizierung. Die Ergebnisse der nicht gezielten Metabolitenprofilerstellung mittels U-P-L-C-M-S können zur Identifizierung kleiner Molekül-Biomarker im Serum genutzt werden. Das Protokoll wird hier für die Analyse von Serum präsentiert.

Es kann jedoch leicht auf die Analyse anderer biologischer Flüssigkeiten wie Urin, Gewebe und Zellkultur-Extrakte erweitert werden. Um eine Plattenkarte für die Probenvorbereitung zu erstellen, öffnen Sie eine Tabellenkalkulation. Tragen Sie in der ersten Spalte die Probenliste in der Reihenfolge des Beladens ein. Tragen Sie in der zweiten Spalte die Positionen in der 96-Loch-Platte unter Verwendung der korrekten Nomenklatur für Ihre Software des Autosamplers ein.

Behalten Sie eine Vertiefung in jeder Platte für die QC-Probe zurück. Wenn Ihr LC-Autosampler zwei Platten gleichzeitig verarbeiten kann, teilen Sie die Probenliste in Chargen von jeweils 190 ein und speichern Sie diese Informationen in einem zweiten Arbeitsblatt. Innerhalb jeder dieser Chargen randomisieren Sie die Injektionsreihenfolge.

Kopieren Sie nun Ihre Injektionsreihenfolge in das Probeneingabe-System der LCMS-Software. Reservieren Sie die ersten drei Zeilen der Probeneingabe für Säulenkonditionierungsinjektionen. Bereiten Sie einen 10-Milliliter-Stamm der QC-Probe vor, der mindestens vier Verbindungen mit bekannter Masse und Retentionszeit enthält, die die chromatographische Elution des Experiments abdecken.

Tauen Sie die Serumproben auf Eis auf und mischen Sie sie vorsichtig etwa fünf Sekunden lang durch Vortexen. Benetzen Sie die Spitzen eines 12-Kanal-Pipettiers mit Methanol, um Tropfenbildung an den Spitzen während der Probenausgabe zu verhindern. Geben Sie anschließend 370 µL kaltes Methanol in jedes Loch einer 96-Loch-Platte und übertragen Sie 100 µL jeder Probe an die entsprechende Position auf der Platte gemäß den Plattenplänen.

Bedecken Sie die Platten und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei minus 80 Grad Celsius. Zum Ausfällen der Proteine zentrifugieren Sie die Platten bei 3.200 G und vier Grad Celsius für 30 Minuten. Anschließend überführen Sie 250 Mikroliter des Überstandes in eine neue 96-Loch-Platte und wiederholen den Zentrifugationsschritt.

Überführen Sie nun Aliquote von jeweils 60 Mikroliter des Snat in drei für den UPLC- oder LC-Autosampler geeignete 96-Loch-Platten. Geben Sie 100 Mikroliter der QC-Probenmischung in die reservierte Vertiefung der Platte. Versiegeln Sie jede Platte mit einer Haftfolie.

Stellen Sie den Autosampler auf vier Grad Celsius ein. Platzieren Sie die ersten beiden Platten in den Autosampler. Richten Sie die Erfassungsmethode mit einem der beiden alternativen umgekehrten Phasengradienten ein.

Die Gradientensäule A ist auf unpolare Moleküle ausgerichtet. Während Gradient B eine verbesserte Abdeckung von mäßig polaren Molekülen bietet. Stellen Sie das Massenspektrometer so ein, dass es Daten im positiven Modus erfasst und dabei das Massen-Ladungs-Verhältnis von 50 bis 1200 scannt.

Zusätzliche spezifische Geräteeinstellungen variieren je nach verwendeter Systemkonfiguration zu Beginn jedes zweiten Durchlaufs. Führen Sie manuell eine Plattenpatch-Probe der Proben durch, und injizieren Sie die QC-Proben fünfmal. Nutzen Sie die dritte bis fünfte QC-Injektion, um den Peakfläche mit einem RSD von weniger als 25 %, die Retentionszeit mit ± 0,05 Minuten und die Massengenauigkeit mit ± 3 ppm zu überwachen.

Diese Parameter müssen möglicherweise an die Spezifikationen des zur Datenerfassung verwendeten Instruments angepasst werden. Falls die QC-Proben bestanden werden, erfassen Sie die Daten der Serumproben für diese beiden Platten, sobald die Erfassung des gesamten Datensatzes abgeschlossen ist. Führen Sie die Merkmalsdetektion, -ausrichtung und -normalisierung der Massenspektrometriedaten für den gesamten Datensatz durch.

Anschließend statistische Analysen durchführen, um molekulare Merkmale von biologischem Interesse zu ermitteln. Diese Schritte sind im Textprotokoll beschrieben. Der folgende Arbeitsablauf bietet einen konzeptionellen Überblick über den Prozess der Metabolitenidentifizierung.

Eine alternative Strategie wird im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie Software, um anhand der genauen Masse und der isotopischen Verteilung der signifikanten molekularen Merkmale eine molekulare Formel vorherzusagen. Suchen Sie anschließend die genauen Massenmessungen in einer hauseigenen oder öffentlichen Metaboliten-Datenbank ab.

Die Datenbanken filtern die Kandidaten-Metaboliten anhand des Massenfehlers, der vorhergesagten molekularen Formel, der Retentionszeit, der In-Source-Fragmentierung und der biologischen Relevanz im Zusammenhang mit den beobachteten Trends bezüglich des experimentellen Designs. Dies führt zu einer vorläufigen Identifizierung des Metaboliten. Die absolute Identifizierung erfordert die Übereinstimmung der genauen Masse, der Retentionszeit und der Fragmentierung der experimentellen Verbindung mit einem authentischen Standard des vorläufig identifizierten Metaboliten.

Weisen Sie schließlich allen berichteten Metabolit-Identifizierungen basierend auf den Empfehlungen der Metabolomik-Standardsinitiative eine Identifizierungssicherheit zu. Dieser Arbeitsablauf zeigt die grundlegenden analytischen Schritte zur Durchführung eines nicht gezielten Metaboliten-Profilierungs-Experiments mittels U-P-L-C-M-S. Die Rohdaten können als Basis-Peak-Chromatogramm visualisiert werden.

Dieses Beispiel zeigt eine Serumprobe, die mithilfe eines Gradienten analysiert wurde, anschließend erfolgte die statistische Auswertung. Für alle biologisch relevanten und statistisch signifikanten molekularen Merkmale wird eine Metabolitenidentifizierung versucht. Hier wurde Koffein in menschlichem Serum identifiziert, indem die chromatographische Retentionszeit sowie die genaue Masse und der Fragmentierungsmuster zwischen dem experimentellen molekularen Merkmal und einer echten Referenzsubstanz des vermuteten Metaboliten übereinstimmten.

Dies ist ein Beispiel für eine Metabolitenidentifizierung der Stufe eins. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die analytische Stabilität während einer groß angelegten, nicht gezielten Metabolitenprofilerstellung in Serum unter Verwendung von UPLC-MS gewährleistet werden kann. Die analytische Stabilität ist jedoch nur ein wichtiger Aspekt eines erfolgreichen Metabolitenprofilerstellungs-Experiments. Auch das experimentelle Design sowie die nachgeschaltete Datenanalyse und -interpretation sind entscheidend.

Außerhalb des Rahmens dieses Video-Tutorials werden diese Themen jedoch in der schriftlichen Anleitung eingeführt und erläutert.