RNA Secondary Structure Prediction Mit High-Throughput-SHAPE

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Vorhersage der RNA-Sekundärstruktur mit Einzelnukleotidauflösung. Dies wird erreicht, indem die gefaltete RNA zunächst chemisch mit einem elektrophilen Reagenz modifiziert wird, das einzelsträngige oder flexible RNA-Regionen isoliert. Der zweite Schritt besteht darin, mit Hilfe der reversen Transkription Stellen der RNA nachzuweisen, die chemisch modifiziert wurden.

Anschließend werden die CD NA-Produkte der reversen Transkription durch Kapillarelektrophorese fraktioniert. Der letzte Schritt ist die Datenverarbeitung und Normalisierung. Letztendlich wird RNA-Struktursoftware verwendet, um die RNA-Sekundärstruktur unter Verwendung der aus der Formanalyse abgeleiteten Pseudo-Freie-Energie-Einschränkungen vorherzusagen.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Molekularbiologie zu beantworten, z. B. wie die RNA-Struktur die Funktionen von katalytischen und nicht-aktuellen RNAs steuert und wie virale RNA-Genome die Multifunktionalität ihrer Genome regulieren. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf unsere Therapie und Diagnose von Viruserkrankungen oder Krebs, da der Einblick in die RNA-Sekundärstruktur das Design von strukturbasierten Medikamenten unterstützen könnte. Obwohl diese Methode Einblicke in die Struktur von RNAs liefert, die durch In-vitro-Transkription hergestellt werden, kann sie auch in vivo angewendet werden, da Formreagenzien zellpermeabel sind.

Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, bereiten Sie die RNA durch In-vitro-Transkription vor. Mit einem kommerziellen Transkriptionskit. RNAs sollten in einem TE-Puffer zwischen minus 20 und minus 80 Grad Celsius in einem 0,5-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen gelagert werden.

Verdünnen Sie 12 Picomol RNA auf 18 Mikroliter mit Wasser und fügen Sie zwei Mikroliter 10 x Renaturationspuffermischung hinzu, indem Sie auf das Röhrchen klopfen, gefolgt von kurzem Schleudern, erhitzen Sie die Mischung im Röhrchen eine Minute lang auf 85 Grad Celsius und kühlen Sie dann auf vier Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Grad Celsius pro Sekunde ab. Geben Sie 100 Mikroliter Wasser und 30 Mikroliter Fünffach-Faltpuffer in das Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie anschließend den Inhalt des Röhrchens bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten, je nachdem, welche RNA gefaltet wird.

Im Allgemeinen erfordert die magnesiumabhängige Faltung längerer und strukturierterer RNAs längere Inkubationszeiten. Übertragen Sie ein 72-Mikroliter-Aliquot auf jeweils zwei 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, die als modifiziert bzw. kontrolliert gekennzeichnet werden sollten. Der nächste Schritt besteht darin, der Kontrollmischung acht Mikroliter wasserfreies Dimethylsulfoxid hinzuzufügen und beiseite zu stellen. Dann fügst du acht Mikroliter 10 x und MIA zum modifizierten Mix hinzu.

Inkubieren Sie die modifizierte und kontrollierte Mischung 50 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie acht Mikroliter drei Natriumacetat, pH 5,28 Mikroliter 100 Millimolar EDTA, 240 Mikroliter kaltes Ethanol und einen Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter hinzu. Glykogen in das modifizierte gemischte Röhrchen geben, um die modifizierte RNA auszufällen, den Inhalt des Röhrchens zwei Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius kühlen und dann bei 14.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Waschen Sie das Pellet dann zweimal fünf Minuten lang mit kaltem Ethanol zentrifugieren. Entfernen Sie nach jedem Waschen den Überstand mit der Mikropipette und trocknen Sie das Pellet fünf Minuten lang an der Luft. Bei Raumtemperatur werden die modifizierten Proben und Kontrollproben für die reverse Transkription in 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vorbereitet.

Für die modifizierte Reaktion werden fünf Mikroliter modifizierte RNA, sechs Mikroliter Wasser und ein Mikroliter einer 10 mikromolaren sci five markierten Primerlösung gemischt. Für die Kontrollreaktion mischen Sie fünf Mikroliter Kontroll-RNA, sechs Mikroliter Wasser und einen Mikroliter einer 10 mikromolaren sci 5.5-markierten Primerlösung. Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler und knien Sie den Primer auf die RNA.

Während des Kniens 2,5 x RT Mix zubereiten. Für jede RT-Reaktion gut mischen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, bevor Sie zu den knienden Reaktionen hinzufügen. Sobald die Temperatur der knienden Reaktionen 50 Grad Celsius erreicht, fügen Sie acht Mikroliter 2,5 XRT hinzu.

Mischen und 50 Minuten bei 50 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes hydrolysierte er die RNA, indem er einen Mikroliter vier molare Natriumhydroxide hinzufügte und drei Minuten lang auf 90 Grad Celsius erhitzte. Kühlen Sie die Reaktionen auf Eis ab und neutralisieren Sie sie dann, indem Sie zwei Mikroliter zweimolare Salzsäure hinzufügen.

Kombinieren Sie nun die modifizierte und die Kontrollreaktion und fügen Sie 0,1 Volumen oder ein Zehntel des Gesamtreaktionsvolumens von drei molaren Natriumacetat und 100 Millimolar EDTA, 1,5 Volumen kaltem Ethanol und einem Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter hinzu. Glykogen. Dies führt dazu, dass die CDNA aus der Lösung fällt. Die Lösung zwei Stunden lang in den Kühlschrank stellen und dann 30 Minuten lang bei 14.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Waschen Sie das Pellet zweimal mit kaltem, 70%igem Ethanol-Resuspend, dem pelletierten CD NA in 40 Mikrolitern deionisiertem Formamid, indem Sie es 10 Minuten lang auf 65 Grad Celsius erhitzen, gefolgt von einem kräftigen Vortexen für mindestens 30 Minuten zur Vorbereitung der Sequenzierungsreaktion in einem 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, mischen Sie 40 Mikroliter der DDA-Terminationsmischung. Fünf PICA-Mole des DNA-Templates, 4,6 Mikroliter 10 x Sease-Puffer und 10 Mikroliter gut gelesener D-two-markierter Primer. Zu dieser Mischung fügen Sie 4,6 Mikroliter QUIN A hinzu und verdünnen Sie sie mit Wasser, um das Gesamtvolumen auf 82 Mikroliter zu bringen.

Bereiten Sie eine zweite Sequenzierungsreaktion auf die gleiche Weise vor, indem Sie stattdessen DDT und Lycor IR 800 markierten Primer verwenden. Fahren Sie anschließend mit der PCR-Amplifikation unter den angegebenen USB-empfohlenen Bedingungen fort. Fügen Sie 16 Mikroliter drei molare Natriumacetate mit einem pH-Wert von 5,2, 16 Mikroliter 100 Millimolar EDTA, einen Mikroliter 10 Milligramm pro Milliliter Glykogen und 480 Mikroliter 95%iges Ethanol hinzu, um die DNA auszufällen, dann 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius zu inkubieren und 30 Minuten lang bei 14.000 g bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren.

Das pelletierte CD NA wird in 100 Mikrolitern deionisiertem Formamid resuspendiert, indem es 10 Minuten lang auf 65 Grad Celsius erhitzt wird, gefolgt von einem kräftigen Vortexen für mindestens 30 Minuten. Mischen Sie anschließend 40 Mikroliter der gepoolten Formproben mit 10 Mikrolitern der gepoolten Sequenzierleitern und pipettieren Sie das Gesamtvolumen der Probe auf 96-Well-Probenplatten, programmieren und bereiten Sie das Kapillarelektrophorese-Instrument vor und initiieren Sie einen Lauf gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die vier überlappenden farbcodierten Spuren werden durch Migration der vier Sätze von Reaktionsprodukten durch die Kapillare wie folgt erzeugt, die blaue Spur zeigt reverse Transkriptionsprodukte, die aus der reversen Transkription von NMIA-modifizierten RNAs erzeugt wurden.

Die grüne Spur zeigt reverse Transkriptionsprodukte von gefalteten, aber ansonsten unmodifizierten RNAs. Die schwarze Spur zeigt die D-N-A-D-D-G-Sequenzierungsleiter und die rote Spur die DDT-Sequenzierungsleiter. Die rohen Kapillarelektrophoresespuren werden mit Hilfe der Shape-Finder-Software getrennt, verarbeitet, ausgerichtet und integriert.

Die Datenanalyse beginnt mit dem Import der Elektropherogramme aus dem Kapillarelektrophoresesystem in den Shape Finder. Das zentrale Datenansichtsfenster bietet grafisches Feedback zu jedem Datenverarbeitungsschritt. Im Werkzeuginspektorenfenster unten links auf dem Bildschirm werden die Parameter für die Werkzeuge angezeigt, die im Skriptinspektor ausgewählt sind.

Der Scripting-Inspektor am oberen Rand des Bildschirms zeigt die Werkzeuge an, die auf die Daten angewendet wurden, passt die Elektropherogramme an, um den Fluoreszenzhintergrund, die spektrale Überlappung zwischen den Fluoreszenzkanälen, Mobilitätsverschiebungen, die durch unterschiedlich getaggte Primer verursacht werden, den Signalzerfall infolge der vorzeitigen Beendigung der reversen Transkription und Unterschiede in der Fluoreszenzintensität gängiger Produkte, die mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind, im Shape Finder Align and Integrate Tool zu korrigieren. Verwenden Sie die Setup-Funktion, um einzelnen Peaks automatisch Identitäten zuzuweisen und diese Informationen mit der RNA-Sequenz zu korrelieren, wie sie durch Benutzereingaben und die beiden Sequenzierungsleitern definiert ist, um die Nukleotid-Reaktivitätsprofile in den Sekundärstrukturalgorithmus zu integrieren, der von der RNA-Struktur-5.3-Software verwendet wird, und/oder um Profile eng verwandter RNAs zu vergleichen. Normalisieren Sie die Shape-Daten auf standardisierte Weise.

Schließen Sie dazu Ausreißer aus nachfolgenden Berechnungen aus. Bestimmen Sie die effektive maximale Reaktivität und normalisieren Sie, indem Sie alle Reaktivitätswerte durch das effektive Maximum dividieren. RNA-Struktursoftware wird verwendet, um experimentell gestützte RNA-Sekundärstrukturen unter Verwendung der pseudofreien Energiebeschränkungen aus der Formanalyse vorherzusagen.

Die Software bietet grafische Darstellungen der geringsten Energie für DRNA-Strukturen sowie eine textuelle Darstellung dieser Strukturen. In der Punktklammer-Notation sollten die Sequenz und die Punktklammer-Annotation in den RNA-Struktur-Viewer importiert werden. Hier ist die 2D-Struktur der HIV-Rev-Response-Element-Stammschleife zwei Region gezeigt, die in der RNA-Struktur 5.3 unter Verwendung der von der Form abgeleiteten Reaktivitätsprofile generiert und mit einem Java-Lightweight-Applet visualisiert wurde. Blau gefärbte Nukleotide haben eine geringe Reaktivität, während rot gefärbte Nukleotide eine höhere Reaktivität aufweisen Sobald die Technik gemeistert ist, kann sie bei richtiger Ausführung in zwei Tagen durchgeführt werden.

Bei diesem Verfahren ist zu beachten, dass das resultierende RNA-Modell sorgfältig interpretiert werden muss, bevor endgültige Schlussfolgerungen über die RNA-Sekundärstruktur gezogen werden können. Andere Methoden, wie z. B. die Sondierung von Hydroxyradikalen durch Raumspaltungsmethoden, können durchgeführt werden, um komplexe tertiäre Wechselwirkungen aufzuklären und es den Forschern schließlich zu ermöglichen, die Strukturen dieser RNAs in drei Dimensionen zu bestimmen.