Name: Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Hemisphären-Explantaten aus embryonalen Mäusen mittels ex utero Elektroporation für Studien der frühen kortikalen Entwicklung. Diese Methode ermöglicht präzise Genfunktionsanalysen.

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Diese Arbeit wurde Zuschüsse aus NINDS (NS066071) und der NIAAA unterstützt. (P50AA017823) an ECO. Die Autoren danken Dr. Robert Quinn und das Personal in der Abteilung für Versuchstierkunde Ressourcen für Tierpflege. Wir danken Judson Belmont für den technischen Support, Nicole Belletier für die Unterstützung als Sommer Undergraduate Research Fellow (SURF). Wir danken auch Dr. David Cameron für Kommentare und Änderungen auf eine frühere Version des Manuskripts.

1. Ex utero Elektroporationen mit Green Fluorescent Protein Expression Plasmid <ol><li> Plasmid-DNA werden mit Injektionslösungen CAG-eGFP DNA 27 verdünnt, um die endgültige Arbeitskonzentration von 0,33 mg / ml in ddH 2 O zubereitet Endo-Free Qiagen Maxi-Präparationen verwendet werden, um das Plasmid aus den transformierten Bakterien zu reinigen. Schnelle grünen Farbstoff bei ~ 0,02% (w / v endgültige) mit der DNA-Lösung als Injektion Tracer zugegeben. </li><li> Um den OP-Bereich vorzubereiten, abspritzen Labor-und Binokular Bühne mit einer 70% igen Ethanol-Lösung und trocken wischen. Sprühen chirurgische Scheren und Zangen mit 70% Ethanol vor Dissektion und trocken wischen. </li><li> Timed Schwangere Swiss / Webster Dämme auf E13 durch Überführung in eine Kammer mit CO 2 aus einer Druckflasche gefüllt und der Damm wird überwacht geopfert, bis alle Bewegung für mindestens 1 min gestoppt wurde. Nach der Tötung durch CO 2-Inhalation werden die Embryonen aus dem Uterus entfernt und ineine 10 cm Petrischale mit eiskaltem Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS). </li><li> Sorgfältig sezieren jeden Embryo aus den umliegenden extraembryonalen Membranen und halten in eiskaltem HBSS. </li><li> Übertragen jedes Embryo einzeln mit einem zweiten 10 cm Petrischale mit kaltem HBSS. Verwenden einer Hamilton-Spritze auf 2-3 ul der DNA schnell Grünmischung in den Ventrikel des linken Großhirnhemisphäre injizieren, wobei darauf zu in einer kortikalen Bereich räumlich getrennt von dem kortikalen Bereich für zukünftige Analysen injizieren. </li><li> Um elektroporieren, halten den Embryo vorsichtig mit Pinzette und leicht zu platzieren die positive Paddel des Pinzette Elektrode auf der dorsalen Mittellinie des Kopfes zu platzieren und leicht die negative Paddel unterhalb des Embryos Kinn. Elektroporationen mit einem BTX830 Elektroporator programmiert zu fünf 30 V Impulse von 50 ms Dauer von 950 ms Intervalle getrennt liefern erreicht. Diese Einstellungen sind für die BTX830 Modell. Andere Systeme können nach Herstellerangaben instructio verwendet werdenns. </li></ol> 2. Whole Hemisphäre Explantatherstellung <ol><li> Nach der Elektroporation werden die Embryonen wieder in eiskaltem HBSS platziert. Das Gehirn wird entfernt, indem zwei # 5 Juwelier Zange, um die Haut und knorpeligen Schädels aus dem Embryo Kopf zu entfernen. Eine Pinzette wird dann rutschte unterhalb des Gehirns, um das intakte Gehirn aus dem Schädel zu entfernen. Das elektroporierte Halbkugel (links) wird dann von dem Gehirn seziert und die angeschlossenen mittleres Hirngewebe entfernt wird. Während der Dissektion Verfahren wird darauf geachtet, nicht zu beschädigen die Hirnhäute, die über dem linken kortikalen Hemisphäre. </li><li> Sobald seziert jeder Embryo in HBSS mit einer Pipette mit einem Schnitt 1 ml Pipettenspitze übertragen wird. Die Halbkugel wird vorsichtig auf ein Kollagen beschichteten Kulturplatten Einsatz vertrieben. Bis zu sechs Hemisphäre Explantate medialen Seite angeordneten sich auf jeweils 24 mm Einsatz. Einmal angeordnet, überschüssiges HBSS wird von dem Einsatz entfernt und der Einsatz wird dann in eine 35-mm-Well einer 6-Well-Schale gegeben. Der Brunnen enthält exactly 2,7 ​​ml Medium: DMEM-F12 Medium mit Glutamax und ergänzt mit 2% B-27, 1% G5 und 1% Penicillin-Strep. Ein paar Tropfen der Medien aus dem Brunnen können übereinander Explantat pipettiert werden, aber nicht hinzufügen media über der ursprünglichen 2,7 ml pro Vertiefung. </li><li> Sobald die Explantate auf Collagen Filter platziert wurden die 6 Well-Platte, welche die Explantate in eine Billups Rothenberg (BR) Kammer (das auch eine Schale mit Wasser befeuchtet) platziert. A 95% / 5% Sauerstoff / CO 2-Gasmischung in die Kammer für mindestens 1 min vor Abdichten der Kammer geschlossen und Abklemmen der 95% / 5% Sauerstoff / CO 2 Gaszufuhrrohr infundiert. Das BR Kammer wird dann in einem 37 ° C Inkubator für Gewebekultur den Rest der Kulturperiode, 1-2 DIV platziert. </li></ol> 3. Fixierung Explantatgewebe für die Histologie <ol><li> In einem Abzug vorbereiten Pagano Fixierung Lösung erster machende 8 g Paraformaldehyd in 100 ml vorgewärmtes (~ 80 &amp; deg; C) ddH 2 O. Fügen Sie 1-3 Tropfen konzentrierte NaOH die Solubilisierung zu fördern und vorsichtig umrühren. Sobald solubilisiert mischen 8% Paraformaldehydlösung 1:1 mit einer Lösung, die 500 mM Saccharose, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM KCl für eine Endkonzentration von 4% Paraformaldehyd in 250 mM Saccharose 50 mM Hepes ist , 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4. </li><li> Um dies zu beheben die Explantate erwärmen Pagano fix Lösung auf 37 ° C. Schnelles Entfernen meisten DMEM/F12 Medien aus jeder Kultur gut und 5 ml Pagano Fix zu jeder Vertiefung der Explantate. Achten Sie darauf, jedes Explantat vollständig bedecken in fix. Fix für 1 Stunde bei RT. Entfernen Sie nicht Explantate aus dem Filter vor 1 Stunde der Fixierung. </li><li> Nach der Fixierung entfernen Pagano fix Lösung und ersetzen Pagano Lösung ohne fix (250 mM Saccharose 50 mM Hepes, 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Fügen Sie ein paar Tropfen 10% Natriumazid und bei 4 ° C bis Einbettung. </li></ol> 4. Einbettung und Sectioning für die Histologie <ol><li> Eine 10% ige Kalbshaut Gelatinelösung durch Solubilisieren 10 g Kalbshaut Gelatine in 100 ml warmem Wasser (55-60 ° C). Zeigen Gelatinelösung auf einer Heizplatte auf 60 ° C und wirbeln in regelmäßigen Abständen, bis solubilisiert. </li><li> Gießen etwa 10 ml der 10% igen Gelatine-Lösung in den Boden einer 10 cm-Petrischale und erlauben 30 min zu verfestigen. Dadurch wird ein &quot;pad&quot; für die Einbettung der Explantate bilden. Diese Pads können vorbereitete Tage im Voraus und bei 4 ° C. Verwenden Sie ein Lineal, um ein Raster auf dem Boden der Petrischale zu ziehen und zu übertragen einzelnen Explantate in jedem Feld des Gitters. Rückstände von Pagano Lösung und mit einer Pipette auf jede Explantat mit warmen 10% igen Gelatinelösung und lassen sich zu verfestigen. Fortsetzen langsame Zugabe von Gelatinelösung, bis jede Explantat vollständig von Gelatine umgeben, dabei nicht um das Kissen durch die Zugabe von zu viel erwärmen Gelatine sofort schmilzt. Lassen Sie für die Gelatine zu härten für ~ 1 Stunde. Nach Aushärtung der einzelUAL Explantate können in kleine Blöcke von Gelatine geschnitten werden. Die Blöcke werden dann in Pagano-fixiert verfassen fix für 24-48 Stunden vor dem Schneiden mit einem Vibratom. </li><li> Explantate in Gelatine Blöcke Riechkolben positioniert und geschnitten in der koronalen Ebene bei 100 mu m Dicke. Die Abschnitte werden gesammelt und in PBS + 0,1% Natriumazid bei 4 ° C bis immunhistochemische Verarbeitung. Gespeicherten </li><li> Immunhistochemischen Nachweis erfolgt durch die Übertragung Abschnitten in eine 24-Well-Platte (2-3 Abschnitte pro Well) durchgeführt. Erster Block unspezifische Antikörperbindung durch Zugabe von 0,5 ml PBST + B (PBS + 0,5% Triton X 100 und 2% BSA) in jede Vertiefung, inkubieren 1 h unter leichtem Schütteln. Die entsprechenden primären Antikörper wird dann in PBST + B verdünnt und 0,4 ml pro Vertiefung wird für eine Inkubation über Nacht bei RT zugegeben. Der primäre erfolgt mit PBS 3X wäscht und für mindestens 10 min gewaschen. Der sekundäre Antikörper und 2 ug / ml Hoechst 33342 Nuklearfarbstoff werden dann in PBST + B verdünnt und die Proben werden für 2 h bei RT inkubiertunter leichtem Schütteln. Drei Wäschen PBS (10 min jeweils) werden durchgeführt und dann werden die Schnitte auf Objektträger unter Verwendung eines 90% Glycerin 50 mM Tris, pH 7,4, Eindeckmitteln montiert. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir haben verbessert und ausgewertet eines experimentellen Modells - ganzen Hemisphäre Explantate - zur Untersuchung der frühen Entwicklung kortikalen (E13-E15). Das Modell hat sich für die Analyse der Migration und Differenzierung des exzitatorischen Neurons Linie, die Schicht 6 aus der Großhirnrinde 25,37 bildet nützlich. Die prinzipiellen Vorteile des Systems sind: 1) organotypischen Wachstum für 2 DIV, 2) Einfachheit der Zubereitung, und 3) experimentellen Zugang zu den Neuronen für die Elektroporation, p...

Die Säugerzellen Großhirnrinde Formen durch den abgestimmten Proliferation, Migration und Differenzierung von nacheinander erzeugten Neuronen. Jedes Neuron in der ventrikulären Zone (VZ) geboren und wandert von der VZ in die Zwischenzone (IZ), Bilden des kortikalen Platte (CP) ein. Als sie durch die verschiedenen kortikalen Bereichen passieren, zeigen die Migration Neuronen mehrere Modi der Migration 2,3, die auf die extrazelluläre Umgebung und andere zelluläre Elemente (zB radiale Gliazellen) innerhalb des sich entwickelnden Gewebes ab. Kortikalen Neuronen dann verhaften Migration an der Spitze der bildenden kortikalen Platte in den zusammenfallenden Prozesse der neuronalen Migration Verhaftung und dendritogenesis 4. Kortikalen Entwicklung zwischen embryonalen Tag 11-13 (E11-13) 5 durch die Einrichtung des Ur plexiformen Schicht 6 oder Vorbeschichtungszyklus (PP), eine Schicht des Pioniers Neuronen, die über der VZ eingeleitet. ProspektivSchicht 6 kortikalen Neuronen (dh die ersten kortikalen Neuronen im VZ geboren), dann orientieren ihre Somata in einem stereotypen Muster und verbinden sich zu einer deutlichen Schicht innerhalb des PP 7. Diese Ereignisse spaltete die Vorbeschichtungszyklus in eine oberflächliche marginal (zukünftige kortikale Schicht 1) und einer tiefen Zone, die letztere Plattenaufbau Zellen (transiente kortikale Schicht 7) zusammen. Dieser Vorgang, genannt Vorbeschichtungszyklus Spaltung, ist ein grundlegendes Ereignis in der Zukunft Wachstum der Großhirnrinde 8. Viele genetische Mutationen identifiziert worden, die stören, die verschiedenen Aspekte der kortikalen Entwicklung 9. Kortikalen Entwicklung kann sich auch negativ durch die Exposition gegenüber aufgenommenen Gifte wie Kokain 10 und Alkohol 11 beeinflusst werden. Da kortikalen Fehlbildungen, die während der Entwicklung entstehen wahrscheinlich Beitragszahler neurologischen Erkrankungen (zB Autismus, Schizophrenie), sind empirische Untersuchungen von Störungen auf kortikalen Entwicklung inhärentenders wichtig. Es ist daher von großer Bedeutung, um Ansätze zu etablieren, um kortikalen Entwicklung, die eine schnelle Tests von genetischen oder Toxin Effekte erlauben die aber auch die Erhaltung der möglichen Wechselwirkungen zwischen differenzierenden Neuronen, andere Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) in dieser frühen Phase der Entwicklung des Gehirns 12 studierst . Scheibe Explantate 13 haben ein solches System zur Verfügung gestellt und sind weit Assay kortikalen Neuronen Entwicklung 14-16 verwendet. Allerdings kann Slice Assays unter dem Nachteil, dass neuronale Migration und Laminierung kann als abnormal 17 möglicherweise durch die Zellen, die den meningealen entwickelnden Gehirns und der radiale Anker glialen Stützgerüst umgeben beschädigen leiden. Als radiale Gliafasern ein wichtiger Substrat für kortikale Neuronen Migration 18 Störung der Basallamina durch Schneiden sind lokal zu stören radialen Gliazellen Architektur und führen zu veränderten kortikalen Migration. Neben der SLIced Oberflächen Explantate stellt einen Bereich aus toten Zellen, die den normalen Zusammensetzung der ECM in diesen Bereichen verändert werden kann. Neuere Ansätze haben ihre Analyse auf Zellen tief in der Scheibe, die durch geeignete gesunde Zelltypen und ECM umgeben befinden konzentriert. Jedoch kann in einigen Fällen diese neueren Ansätze können erfordern, dass die ursprüngliche Dicke kultivierten Slice Kryo-oder Paraffin-Schnitt geschnitten werden nach Fixierung, so daß die relativ normal Inneren der Scheibe zur Verfügung gestellt wird zur Analyse 19-21. Sowohl der ursprüngliche Vibratom Schneiden, um die Live-Scheiben für Kultur sowie der anschließenden Kryoschneiden von festen Scheiben für die Analyse vorzubereiten erfordern Sorgfalt und Mühe für diese Assays zu arbeiten. Um einen einfachen, ergänzenden Ansatz für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, haben wir modifiziert eine bestehende Scheibe Ansätze 13 Studien der frühen kortikalen Entwicklung zu erleichtern. Wir haben eine wh entwickeltole Hemisphäre Explantat-Modell ähnlich einem bestehenden E14 ganzen Hemisphäre Modell, das geschüttelte Kulturen bei 65 Umdrehungen pro Minute und erlaubt organotypischen Wachstum für 16-18 Stunden 22,23 involviert. In unserem Ansatz werden ganzen Hemisphäre Explantate auf semipermeable Membran 13 mit einem hohen Sauerstoff-Atmosphäre Kultur 21,24 angeordnet, um organotypischen kortikalen Wachstum für 48 Stunden verlängern. Dieser Ansatz ermöglicht eine konsistente Elektroporation entwickelt kortikalen Neuronen. Die Embryonen werden aus der Gebärmutter entfernt und elektroporiert, Plasmid-DNA einzuführen und die Telencephalon wird dann seziert. Jede Hemisphäre wird isoliert und medialen Seite nach unten auf eine Kollagen-beschichtete Filter. Das Explantat wird dann für einen Zeitraum von 48 Stunden, eine Periode, die Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 8 umfasst kultiviert. Während der Anzucht, entwickeln L6 Neuronen aus Vorläuferzellen zu unterscheiden Neuron 25, richtig positioniert in der kortikalen Platte. Während dieser Zeit ist die Entwicklung vonNeuron wird durch die entsprechende ECM und Zelltypen, die die entsprechende Zelle in vivo zu konfrontieren würde umgeben. Dieses System hat sich bereits in der Entschlüsselung der zellulären Vorgänge, die Ethanol Toxizität 26, Schicht 6 Bildung und Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 7,25 zugrunde wertvoll.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 Supplement 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen / Strep Liquid 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 ml</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Kultureinsatz kollagenbeschichtet </td><td>Costar</td><td>3492</td><td></td></tr><tr><td>Rinderhautgelatine </td><td>Sigma</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 830 Elektroporator</td><td>Harvard Apparat</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Pinzettenelektroden 10mm</td><td>Harvard Apparat</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Billups</td><td>Rothenberg MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze (5uL)</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritzennadel</td><td>Hamilton</td><td>7803-04</td><td>Spezifizieren 1" und Style 4</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere Tough Cut 9 cm</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero elektroporation und whole hemisphäre explantate: a simple experimentelle methode für studien der frühen kortikalen entwicklung

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Kortikalen Entwicklung beinhaltet komplexe Interaktionen zwischen Neuronen und nicht-neuronalen Elemente, einschließlich Vorläuferzellen, Blutgefäße, Hirnhäute und die damit verbundenen extrazellulären Matrix. Weil sie eine geeignete organotypischen Umfeld zu schaffen, sind kortikale Schicht Explantate oft verwendet, um die Wechselwirkungen, die neuronale Differenzierung und Entwicklung steuern zu untersuchen. Obwohl von Vorteil, kann die Scheibe Explantat-Modell von Nachteilen einschließlich aberrante zelluläre Laminieren und Migration leiden. Hier berichten wir über eine ganze Gehirnhälfte Explantat für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, die einfacher herzustellen als kortikale Scheiben und zeigt konsistente organotypischen Migration und Laminierung. In diesem Modellsystem, frühe Laminierung und Migrationsmuster der Regel über eine Zeitspanne von zwei Tagen in vitro, einschließlich der Dauer der Vorbeschichtungszyklus Splitting, bei denen Interessenten Rindenschicht sechs Formen. Wir entwickelten eine ex utero Elektroporation (EUEP)Ansatz, ~ 80% Erfolg bei der Ausrichtung der GFP-Expression zu Neuronen entwickeln im dorsalen medialen Kortikalis erreicht. Die ganze Hemisphäre Explantat Modell macht frühen kortikalen Entwicklung zugänglich für die Elektroporation, pharmakologische Intervention und Live-Bildgebung. Dieses Verfahren vermeidet die Überlebensrate Chirurgie in utero Elektroporation (IUEP) erforderlich ist, während Ansätze Verbesserung sowohl Transfektion und Flächendichte Targeting Konsistenz. Dieses Verfahren erleichtert experimentelle Untersuchungen von neuronalen Proliferation, Migration und Differenzierung.

Die embryonale Nager Cortex weist eine quer neurogenetischen Gradienten in der Entwicklungsphase ist, so dass seitliche Neocortex ungefähr 1 Tag reifer als dorsalen medialen Neocortex 28. Die Masse der Schicht 6 Neuronen so erzeugte (dh weisen ihre endgültige S-Phase) auf E12 in seitlichen Kortex (auch als Feld 40 5) und bei E13 in der dorsalen medialen Kortex (auch als Feld 1 5). Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung beginnt etwa 1 Tag nach Layer 6 Neuron Generation und wird somit...

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das umfasst<em&gt; Ex utero</em&gt; Elektroporation, Dissektion und Kultur des gesamten zerebralen Hemisphären aus dem embryonalen Maus. Die Vorbereitung erleichtert pharmakologischen Studien und Untersuchungen von Genfunktionen in der frühen kortikalen Entwicklung.

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ganze zerebrale Hemisphärenexplane zur Untersuchung der frühen kortikalen Entwicklung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst am 13. embryonalen Tag Mausembryonen gewonnen werden. Anschließend wird die Plasmid-DNA-Mischung in das zerebrale Ventrikel injiziert und eine ex-utero-Elektroporation durchgeführt.Danach bereiten Sie eine ganze Hemisphäre-Explant aus dem elektroporierten Embryo vor. Der letzte Schritt besteht darin, den gesamten Hemisphäre-Explanten zu fixieren und einzuschneiden, um histologische Analysen durchzuführen. Letztendlich kann die Auswirkung einer Mutation oder Toxinexposition auf die kortikale Neuronenentwicklung durch immunhistologische Analysen von GFP-exprimierenden Neuronen bewertet werden.Mein Name ist Eric Olson. Ich arbeite in der Abteilung für Neurowissenschaften und Physiologie an der SUNY Upstate Medical University in Syracuse, und heute werden wir Ihnen eine von uns entwickelte Methode vorstellen, die als ganzes Hemisphären-X-Explan bezeichnet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Schnitt-Explan besteht darin, dass ganze Hemisphären-X-Explan einfach herzustellen sind und zwei Tage lang organotypisches Wachstum ermöglichen.Die Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroentwicklung zu beantworten, beispielsweise wie eine bestimmte Mutation oder ein Toxin die frühe kortikale Entwicklung stört. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Vorbereitung des gesamten Hemisphären-Explantats, ohne die Hirnhäute zu beschädigen, etwas Übung erfordern kann. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der Dissektion und des Explantat-Transfers aufgrund der Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber mechanischer Belastung schwer zu erlernen sind.Dr. Theresa Ozzi, eine Postdoktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Verwenden Sie für diesen Protokollschritt ein kommerziell erhältliches Kit zur Reinigung der Plasmide. Bereiten Sie die Plasmid-DNA in einer Konzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter in Wasser vor und geben Sie Fast-Green-Farbstoff als Injektionsmarker mit einem Anteil von etwa 0,02 % Gewicht pro Volumen hinzu. Desinfizieren Sie stets die chirurgischen Instrumente, den Arbeitsbereich und das Mikroskop.Mit 70 % Ethanol behandeln und eine erforderliche Anzahl von Swiss-Webster-Müttern am E13 durch Einatmen von Kohlendioxid opfern. Nach dem Entfernen der Embryonen diese in eine 10 cm große Petrischale mit eiskaltem HBSS geben, die auf Eis gehalten wird. Jeden Embryo vorsichtig von den umgebenden extraembryonalen Membranen ablösen.Überführen Sie nun jedes Embryo einzeln in eine saubere Schale mit eiskaltem HBSS. Injizieren Sie mithilfe einer Hamilton-Spritze zwei bis drei Mikroliter der vorbereiteten DNA in das Ventrikel des linken Großhirnhemisphären. Injizieren Sie nicht in den kortikalen Bereich hinein oder in dessen Nähe, der für die spätere Analyse vorgesehen ist.Um die DNA elektroporierend einzubringen, halten Sie das Embryo vorsichtig mit einer Pinzette fest und platzieren Sie die positive Zange der Elektrodenzange leicht auf der dorsalen Mittellinie des Kopfes. Legen Sie die negative Zange leicht unter das Kinn des Embryos. Führen Sie ein Programm mit fünf Impulsen à 30 Volt, jeweils 50 Millisekunden lang im Abstand von einer Sekunde, durch; verwenden Sie dazu ein BTX-830-Modell. Andere Systeme können gemäß den Herstelleranweisungen eingestellt werden.Bringen Sie jedes Embryo zurück in das eiskalte HBSS und fahren Sie mit der Vorbereitung des gesamten Hemisphären-Explanten unter einem Dissektionsmikroskop mit zwei Pinzetten der Stärke fünf fort. Entfernen Sie die Haut und den knorpeligen Schädel aus dem Kopf des Embryos. Führen Sie als Nächstes die Pinzette unter das Gehirn.Um das intakte Gehirn aus dem Schädel zu entfernen, dissezieren Sie die elektroporierte Hemisphäre einschließlich des daran befestigten Mittelhirngewebes. Achten Sie darauf, die über der dissezierten kortikalen Hemisphäre liegenden Hirnhäute nicht zu beschädigen. Wir fanden, dass der schwierigste Schritt, den es zu beherrschen gilt, die Dissektion und Entfernung der elektroporierten Hemisphäre ohne Schädigung der Hirnhäute ist.Nach der Dissektion jedes Hemisphäre unter Verwendung einer verbreiterten Ein-Milliliter-Pipettenspitze in fünf Milliliter eiskaltes HBSS überführen. Bei Bedarf können die Embryonen in separaten Vertiefungen einer 12-Loch-Gewebekulturplatte aufbewahrt werden. Anschließend bis zu sechs Hemisphären vorsichtig auf eine 24-Millimeter-Kollagen-beschichtete Kultur übertragen.Setzen Sie das Insert mit der medialen Seite nach unten ein und positionieren Sie es. Füllen Sie nun eine 35-Millimeter-Vertiefung einer sechsfachen Platte mit 2,7 Millilitern supplementiertem Medium. Entfernen Sie überschüssiges HBSS vom Insert und geben Sie das Insert in die Vertiefung. Pipettieren Sie mit der Medienpipette einige Tropfen des Mediums aus der Vertiefung auf die Oberseite jedes x-Explantats.Erhöhen Sie das Mediumvolumen nicht. Wir haben festgestellt, dass es entscheidend ist, einige Tropfen Kulturmedium auf das X-Explantat zu geben, sodass die X-Explantate nicht vollständig mit Medium bedeckt sind. Dies kann bedeuten, bis zu 400 Mikroliter zu den 2,7 Millilitern Medium auf dem X-Explantat hinzuzufügen.Bringen Sie die Petrischale in eine Billups-Rothenberg-Kammer, die eine befeuchtete Wasserschale enthält und mindestens eine Minute lang mit 95 % Sauerstoff durchströmt wurde. Verschließen Sie die Kammer hermetisch und trennen Sie das Gaszufuhrrohr ab. Stellen Sie die Kammer zwei Tage lang in einen 37 °C warmen Inkubator, wobei bis dahin die Vorstadiums-Spaltung stattgefunden haben wird.In Vorbereitung. Stellen Sie Polster zum Einbetten des Exemplars her. Bereiten Sie eine 10%ige Kalbsledergelatine-Lösung bei 60 Grad Celsius vor.Wenn die Substanz gelöst ist, etwa 10 Milliliter der Lösung in eine 10 cm große Schale geben. Die restliche Lösung bei 60 Grad Celsius für spätere Verwendung aufbewahren. Falls erforderlich, den Pads eine halbe Stunde Zeit zur Vollständigen Erstarrung lassen.Sie können mehrere Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, müssen jedoch vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt werden. Am Tag der Fixierung in einem Abzug bereiten Sie das Pagano, das Fixans und die Pagano-Lösung ohne Fixans vor. Erwärmen Sie die Fixierungslösung auf 37 Grad Celsius.Entnehmen Sie die Explantate vorsichtig und schnell aus dem Inkubator, ohne das Gewebe zu stören. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums und ersetzen Sie es durch fünf Milliliter vorgewärmtes Fixans. Stellen Sie sicher, dass jedes Explantat vollständig untergetaucht ist.Fixieren Sie die Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Anschließend entfernen Sie das Fixierungsmittel und ersetzen es durch Pagano-Lösung. Ohne Fixierungsmittel.Geben Sie einige Tropfen 10% Natriumazid in jede Vertiefung. Die Gewebe können nun bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, bis sie auf einem Einbettungsblock fixiert werden. Zeichnen Sie mit Hilfe eines Lineals ein Raster auf den Boden der Schale.Herstellung von zwei bis drei Zentimeter großen Quadraten. Überführen Sie die einzelnen Explantate auf das Einbettungspolster. Pipettieren Sie jegliche Restlösung ab und bedecken Sie jedes Explantat mit warmer 10%iger Gelatinelösung.Lassen Sie es erstarren. Nach dem langsamen Erstarren weitere Gelatinelösung hinzufügen, bis jedes Explant vollständig umgeben ist. Vermeiden Sie es, das Polster zu schmelzen, was geschehen kann, wenn zu viel Gelatine auf einmal zugegeben wird.Lassen Sie nun das Gelatine etwa eine Stunde lang aushärten. Sobald es ausgehärtet ist, kann das einzelne Explan in kleine Gelatineblöcke geschnitten werden, bevor es geschnitten wird. Es ist wichtig, die Blöcke einen Tag oder zwei in Pagano-Fixansatz nachzufixieren.Beim Schneiden die Explantate mit dem Riechkolben nach oben positionieren und im koronalen Schnitt bei einer Dicke von 100 Mikrometern schneiden. Die Schnitte in gekühltem PBS mit 0,1 % Natriumazid sammeln.Bewahren Sie die Schnitte bei vier Grad Celsius auf, bis sie mit der beschriebenen Technik gefärbt werden können. Ganze Hemisphären-Explantate wurden am Embryonaltag 13 vor der Prälatenspaltung hergestellt. Im dorsalen Neokortex.Das Gewebe enthielt ein Transgen, das unreife Neuronen der exzitatorischen kortikalen Linie markiert. Kortikale Explantate aus demselben Wurf wurden über einen Zeitraum von zwei Tagen in vitro nacheinander fixiert und für die anschließende histologische Analyse aufgearbeitet. Zum Zeitpunkt der ersten Analyse, DIV null, hat die Vorläuferzellteilung in Feld eins nach dem anderen noch nicht stattgefunden. DIV.Die CP werden sichtbar und wuchsen weiter bis zum 2D IV. Somit unterstützten die ursprünglich am E13 kultivierten halbkugelförmigen Explantate zwei Tage lang die Reifung der Großhirnrinde und erfassten die Aufspaltung des Prelate im dorsalen Neokortex, um die normale histologische Entwicklung im dorsalen Neokortex zu bestätigen. Die 2D IV-Explantate wurden immunhistochemisch auf Chondroitinsulfat, Proteoglykane und Komponenten der extrazellulären Matrix gefärbt. Zwei Bande der Immunreaktivität im dorsalen Kortex deuteten auf eine angemessene Aufspaltung des PPP in MZ und SP während der In-vitro-Kulturphase hin.Das PP wurde durch L sechs kortikale Neuronen, die CTIP zwei und TBR R eins exprimieren, aufgeteilt. Das Immunfärbungsmuster dieser Marker bestätigt die angemessene Expression dieser Transkriptionsfaktoren im neu gebildeten cp. Zusammen bestätigen diese Analysen die organspezifische frühe kortikale Entwicklung im gesamten Hemisphären-Explantat unter Verwendung des vollständig beschriebenen Protokolls, wobei die linke Herzkammer intakter E 13-Embryonen injiziert wurde.Elektroporierte und verarbeitete GFP-Expression konnte in neuronalen Vorläuferzellen in der vz beobachtet werden. Während intensive GFP-exprimierende Zellen in der IZ und cp zu sehen waren, wurden wichtigerweise zahlreiche mit Pfeilspitzen markierte GFP-positive Neuronen an der Spitze des sich bildenden cp mit sich entwickelnden Dendriten und Axonen beobachtet. Die deutliche Schichtung an der Grenzfläche zwischen cp und mz weist auf eine angemessene Migration, Arrestierung und Schichtung hin.Die Dendriten erstreckten sich in die MZ, während kortiko-ugale Axone unterhalb der CP und in die IZ hinein reichten. Die differenzierenden Zellen waren GFP-positive Zellen in unterschiedlichen Reifestadien, einschließlich Neuronen mit bipolarer Morphologie, die neben radialen glialen Fasern lagen, sowie darunter liegende multipolare Neuronen in der IZ. Die Dendriten erstreckten sich außerdem in die MZ, wo das ECM-Protein Reelin korrekt immunlokalisiert ist.Daher ermöglichen die Elektroporations- und Explantenbedingungen eine normale Entwicklung kortikaler Neuronen. Wie erwartet besiedelten postmitotische, GFP-positive Neuronen den sich bildenden cp. Somit kann das Protokoll zuverlässig kortikale Neuronen der Schicht sechs für Untersuchungen ihrer Migration und Reifung gezielt ansprechen.Die umfangreiche Anwendung dieses Verfahrens hat zu einer Erfolgsquote von 79 % geführt. 195 von 248 Versuchen eigneten sich für die Bildgebung und Analyse. Die Hälfte der Fehlschläge resultierte aus einem Ausbleiben der GFP-Expression oder aus verfehlten Zielstrukturen für GFP, sobald das Verfahren beherrscht wurde.Diese Technik kann innerhalb von 90 Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Dissektionen zu üben, damit die elektroporierten Hemisphären mit intakten Hirnhäuten nach diesem Verfahren kultiviert werden können. Weitere Methoden wie die Zeitraffer-Mikroskopie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie Mutationen von Interesse die neuronale Migration oder die Dendritenbildung stören.

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Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

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Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung (Video) | JoVE Journal

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

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