Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Explan der gesamten Gehirnhälfte für die Untersuchung der frühen kortikalen Entwicklung zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zuerst Mausembryonen am 13. Tag des Embryos entnommen werden. Als nächstes injizieren Sie das Plasmid-DNA-Gemisch in den Hirnventrikel und führen eine Ex-utero-Elektroporation durch.

Bereiten Sie dann ein Explan der ganzen Hemisphäre aus dem elektroporierten Embryo vor. Der letzte Schritt besteht darin, den gesamten Hemisphären-Explan für histologische Analysen zu fixieren und zu schneiden. Letztendlich kann die Konsequenz einer Mutation oder Toxinexposition auf die Entwicklung kortikaler Neuronen durch die immunhistologische Analyse von GFP-exprimierenden Neuronen bewertet werden.

Mein Name ist Eric Olson. Ich bin in der Abteilung für Neurowissenschaften und Physiologie hier an der SUNY Upstate Medical University in Syracuse, und heute zeigen wir Ihnen eine Methode, die wir entwickelt haben, den gesamten Hemisphere X Explan. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Slice Explan besteht darin, dass die gesamte Hemisphäre X Explan einfach zuzubereiten ist und zwei Tage organotypisches Wachstum ermöglicht.

Die Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der neurologischen Entwicklung zu beantworten, z. B. wie eine bestimmte Mutation oder ein bestimmtes Toxin die frühe kortikale Entwicklung stört. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Vorbereitung des gesamten Hemisphären-Explans ohne Beschädigung der Hirnhäute etwas Übung erfordern kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Dissektions- und Explan-Transferschritte aufgrund der Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber mechanischer Störung schwer zu erlernen sind.

Das Verfahren wird von Dr. Theresa Ozzi, einer Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert. Verwenden Sie für dieses Protokoll ein kommerziell erhältliches Kit, um die Plasmide aufzureinigen. Bereiten Sie die Plasmid-DNA mit 0,33 Milligramm pro Milliliter in Wasser vor und fügen Sie schnellen grünen Farbstoff als Injektionstracer mit etwa 0,02 Vol.-% hinzu Desinfizieren Sie immer die chirurgischen Instrumente, den Arbeitsbereich und das Mikroskop.

Mit 70%Ethanol wird dann eine benötigte Anzahl an Schweizer Webster-Staudämmen auf E 13 durch Kohlendioxid-Inhalation geopfert. Wenn die Embryonen entnommen werden, legen Sie sie in eine 10 Zentimeter große Schale mit eiskaltem HBSS in der eiskalt gehaltenen Schale. Präparieren Sie jeden Embryo vorsichtig von den umgebenden extraembryonalen Membranen.

Übertragen Sie nun jeden Embryo einzeln in eine saubere Schüssel mit HBSS eiskalt. Injizieren Sie mit einer Hamilton-Spritze zwei bis drei Mikroliter der vorbereiteten DNA in den Ventrikel der linken Gehirnhälfte. Injizieren Sie nicht in oder in der Nähe des kortikalen Bereichs, der für zukünftige Analysen vorgesehen ist.

Um die DNA zu elektroporieren, halten Sie den Embryo vorsichtig mit einer Pinzette und platzieren Sie das positive Paddel der Pinzettenelektrode leicht auf der dorsalen Mittellinie des Kopfes. Platzieren Sie das negative Paddel leicht unter dem Kinn des Embryos. Führen Sie ein Programm von fünf 30-Volt-Impulsen à 50 Millisekunden im Intervall von einer Sekunde mit einem Modell BTX 830 durch, das in anderen Systemen nach Herstellerangaben eingestellt werden kann.

Setzen Sie jeden Embryo wieder in das eiskalte HBSS zurück und fahren Sie mit der Vorbereitung des Explans der gesamten Hemisphäre unter einem Präpariermikroskop unter Verwendung von zwei Juwelierzangen der Nummer fünf fort. Entfernen Sie die Haut und den Knorpelschädel vom Kopf des Embryos. Nächstes Gleiten der Zange unter dem Gehirn.

Um das intakte Gehirn aus dem Schädel zu entfernen, präparieren Sie die elektroporierte Hemisphäre einschließlich des anhaftenden Mittelhirngewebes. Achten Sie darauf, die Hirnhäute über der präparierten kortikalen Hemisphäre nicht zu beschädigen. Wir fanden, dass der schwierigste Schritt, den es zu meistern gilt, die Dissektion und Entfernung der Elektroparade-Hemisphäre ist, ohne die Hirnhäute zu beschädigen.

Nach dem Präparieren übertragen Sie jede Hemisphäre mit einer um einen Milliliter verbreiterten Pipettenspitze auf fünf Milliliter eiskaltes HBSS. Bei Bedarf können die Embryonen in separaten Vertiefungen einer 12-Well-Gewebekulturschale aufbewahrt werden. Übertragen Sie anschließend bis zu sechs Halbkugeln vorsichtig auf eine 24 Millimeter große, mit Kollagen beschichtete Kultur.

Führe die mediale Seite nach unten ein und ordne sie an. Füllen Sie nun eine 35-Millimeter-Vertiefung einer Sechs-Well-Schale mit 2,7 Millilitern ergänztem Medium. Entfernen Sie überschüssiges HBSS aus dem Einsatz und setzen Sie den Einsatz mit der Medienpipette in die Vertiefung ein. Geben Sie einige Tropfen des Mediums aus der Vertiefung auf die Oberseite jedes x Plans.

Erhöhen Sie nicht die Lautstärke des Mediums. Wir haben festgestellt, dass es wichtig ist, ein paar Tropfen Nährmedium auf den X-Explan zu geben, damit die X-Explantate nicht vollständig mit dem Medium bedeckt sind. Dies kann bedeuten, dass bis zu 400 Mikroliter zu den 2,7 mil Medium auf dem x explan hinzugefügt

Stellen Sie die Schale in eine Billups Rothenberg-Kammer, die eine Befeuchtungsschale mit Wasser enthält und mindestens eine Minute lang mit 95 % Sauerstoff aufgegossen wurde. Verschließen Sie die Kammer und trennen Sie den Gaszuleitungsschlauch. Stellen Sie die Kammer für zwei Tage in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, bis dahin hat die Vorbereitungsteilung stattgefunden.

In Vorbereitung. Erstellen Sie Pads zum Einbetten des Plans. Stelle eine 10%ige Gelatinelösung aus Kalbsleder bei 60 Grad Celsius her.

Sobald sie gelöst ist, gießen Sie etwa 10 Milliliter der Lösung in eine 10 Zentimeter große Schale. Bewahren Sie die restliche Lösung für die spätere Verwendung bei 60 Grad Celsius auf. Lassen Sie die Ballen bei Bedarf eine halbe Stunde lang fest werden.

Sie können mehrere Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, müssen aber vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt werden. Bereiten Sie am Tag der Fixierung in einem Abzug die Pagano-, Fixiermittel- und Pagano-Lösung ohne Fixiermittel vor. Erwärmen Sie die Fixierlösung auf 37 Grad Celsius.

Entnehmen Sie die Explantate vorsichtig und schnell aus dem Inkubator, ohne das Gewebe zu stören. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums und ersetzen Sie es durch fünf Milliliter erwärmtes Fixiermittel. Stellen Sie sicher, dass jedes Explantat vollständig untergetaucht ist.

Fixieren Sie die Taschentücher eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann das Fixiermittel und ersetzen Sie es durch Pagano-Lösung. Ohne Fixiermittel.

Geben Sie ein paar Tropfen 10% Natriumazid in jede Vertiefung. Das Gewebe kann nun bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis es auf einem Einbettungspad eingebettet ist. Zeichnen Sie mit Hilfe eines Lineals ein Gitter auf den Boden der Schüssel.

Machen Sie zwei bis drei Zentimeter große Quadrate. Übertragen Sie die einzelnen Explantate auf das Einbettkissen. Spritzen Sie alle Lösungsreste weg und bedecken Sie jeden Explan mit warmer 10%iger Gelatinelösung.

Lassen Sie es sich verfestigen. Sobald es langsam erstarrt ist, fügen Sie mehr Gelatinelösung hinzu, bis jedes Explantat vollständig umgeben ist. Vermeiden Sie es, das Pad zu schmelzen, was passieren kann, wenn zu viel Gelatine auf einmal hinzugefügt wird.

Lassen Sie die Gelatine nun etwa eine Stunde lang aushärten. Nach dem Aushärten kann der einzelne Explan vor dem Schneiden in kleine Gelatineblöcke geschnitten werden. Es ist wichtig, die Blöcke in Pagano für ein oder zwei Tage zu fixieren.

Beim Schneiden. Positionieren Sie die Explantate mit dem Riechkolben nach oben und schneiden Sie sie in der Kronenebene bei 100 Mikrometer Dicke. Sammeln Sie die Abschnitte in gekühltem PBS mit 0,1 % Natriumazid.

Lagern Sie die Abschnitte bei vier Grad Celsius, bis sie mit der beschriebenen Technik gebeizt werden können. Explantate der ganzen Hemisphäre wurden bei E 13 vor der Prälatenspaltung präpariert. Im dorsalen Neokortex.

Das Gewebe beherbergte ein Transgen, das unreife Neuronen der exzitatorischen kortikalen Linie meldet. Kortikale Explantate aus demselben Wurf wurden nacheinander über einen Zeitraum von zwei Tagen in vitro tropfenfixiert und für die anschließende histologische Analyse aufbereitet. Zum Zeitpunkt der ersten Analyse hat DIV noch kein Zero Prepl Splitting im Feld one by one stattgefunden.DIV.

Die CP wurde sichtbar und wuchs bis zu 2D IV weiter. So explantierte die gesamte Hemisphäre, die zunächst bei E 13 kultiviert wurde, unterstützte zwei Tage lang die Reifung der Großhirnrinde und erfasste die Prälatenspaltung im dorsalen Neokortex, um die normale histologische Entwicklung im dorsalen Neokortex zu bestätigen. 2D IV Explan waren Immunfärbungen für Chondroitinsulfat, Protag-Glykane und extrazelluläre Matrixkomponente. Zwei Banden der Immunreaktivität im dorsalen Kortex deuteten auf eine angemessene Aufspaltung des PPP in MZ und SP während der In-vitro-Kulturperiode hin.

Das PP wurde von L sechs kortikalen Neuronen gespalten, die CTIP zwei und TBR R eins exprimierten. Das Immunfärbemuster dieser Marker bestätigt die entsprechende Expression dieser Transkriptionsfaktoren in der neu gebildeten cp. Zusammengenommen bestätigen diese Analysen die ORGANOTYPISCHE frühe kortikale Entwicklung in der gesamten Hemisphäre. Unter Verwendung des gesamten beschriebenen Protokolls wurde der linke Ventrikel von intakten E 13-Embryonen injiziert.

Die elektroporierte und prozessierte GFP-Expression konnte an neuronalen Vorläufern in der vz beobachtet werden. Während intensive GFP-exprimierende Zellen in der IZ und cp beobachtet wurden, wurden zahlreiche GFP-positive Neuronen, die durch Pfeilspitzen markiert waren, an der Spitze des sich bildenden CP mit austretenden Dendriten und Axonen beobachtet. Die diskrete Schicht an der Grenzfläche zwischen CP und MZ zeigt eine entsprechende Migration, Arrest und Laminierung an.

Die Dendriten erstreckten sich in die MZ, während sich die kortikougalen Axone unterhalb der CP und in die iz erstreckten. Unter. Bei den differenzierenden Zellen handelte es sich um GFP-positive Zellen in unterschiedlichen Reifegraden, darunter Neuronen mit einer bipolaren Morphologie, die den Radiogliafasern gegenübergestellt waren, und darunter multipolare Neuronen im iz. Die Dendriten dehnten sich auch in die MZ aus, wo das EZM-Protein-Readin entsprechend immunlokalisiert ist.

So ermöglichen die Elektroporations- und Explantatbedingungen eine normale Entwicklung der kortikalen Neuronen. Wie erwartet bevölkerten postmitotische GFP-positive Neuronen die sich bildenden cp. Auf diese Weise kann das Protokoll zuverlässig auf kortikale L-Sechs-Neuronen abzielen, um ihre Migration und Reifung zu untersuchen.

Die ausgiebige Anwendung dieses Verfahrens hat zu einer Erfolgsquote von 79 % geführt. 195 von 248 Versuchen waren für die Bildgebung und Analyse geeignet. Die Hälfte der Misserfolge kam von einem Versäumnis, GFP zu exprimieren oder von verpasstem gezieltem GFP Nach der Beherrschung.

Diese Technik kann in 90 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Dissektionen zu üben, damit die elektroporierten Hemisphären mit intakten Hirnhäuten kultiviert werden können. Nach diesem Verfahren Andere Methoden wie die Zeitraffermikroskopie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie interessante Mutationen die neuronale Migration oder die Dendri-Agenesie stören.