Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ganze zerebrale Hemisphärenexplane zur Untersuchung der frühen kortikalen Entwicklung vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst am 13. embryonalen Tag Mausembryonen gewonnen werden. Anschließend wird die Plasmid-DNA-Mischung in das zerebrale Ventrikel injiziert und eine ex-utero-Elektroporation durchgeführt.

Danach bereiten Sie eine ganze Hemisphäre-Explant aus dem elektroporierten Embryo vor. Der letzte Schritt besteht darin, den gesamten Hemisphäre-Explanten zu fixieren und einzuschneiden, um histologische Analysen durchzuführen. Letztendlich kann die Auswirkung einer Mutation oder Toxinexposition auf die kortikale Neuronenentwicklung durch immunhistologische Analysen von GFP-exprimierenden Neuronen bewertet werden.

Mein Name ist Eric Olson. Ich arbeite in der Abteilung für Neurowissenschaften und Physiologie an der SUNY Upstate Medical University in Syracuse, und heute werden wir Ihnen eine von uns entwickelte Methode vorstellen, die als ganzes Hemisphären-X-Explan bezeichnet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Schnitt-Explan besteht darin, dass ganze Hemisphären-X-Explan einfach herzustellen sind und zwei Tage lang organotypisches Wachstum ermöglichen.

Die Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroentwicklung zu beantworten, beispielsweise wie eine bestimmte Mutation oder ein Toxin die frühe kortikale Entwicklung stört. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Vorbereitung des gesamten Hemisphären-Explantats, ohne die Hirnhäute zu beschädigen, etwas Übung erfordern kann. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der Dissektion und des Explantat-Transfers aufgrund der Empfindlichkeit des Gewebes gegenüber mechanischer Belastung schwer zu erlernen sind.

Dr. Theresa Ozzi, eine Postdoktorandin in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Verwenden Sie für diesen Protokollschritt ein kommerziell erhältliches Kit zur Reinigung der Plasmide. Bereiten Sie die Plasmid-DNA in einer Konzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter in Wasser vor und geben Sie Fast-Green-Farbstoff als Injektionsmarker mit einem Anteil von etwa 0,02 % Gewicht pro Volumen hinzu. Desinfizieren Sie stets die chirurgischen Instrumente, den Arbeitsbereich und das Mikroskop.

Mit 70 % Ethanol behandeln und eine erforderliche Anzahl von Swiss-Webster-Müttern am E13 durch Einatmen von Kohlendioxid opfern. Nach dem Entfernen der Embryonen diese in eine 10 cm große Petrischale mit eiskaltem HBSS geben, die auf Eis gehalten wird. Jeden Embryo vorsichtig von den umgebenden extraembryonalen Membranen ablösen.

Überführen Sie nun jedes Embryo einzeln in eine saubere Schale mit eiskaltem HBSS. Injizieren Sie mithilfe einer Hamilton-Spritze zwei bis drei Mikroliter der vorbereiteten DNA in das Ventrikel des linken Großhirnhemisphären. Injizieren Sie nicht in den kortikalen Bereich hinein oder in dessen Nähe, der für die spätere Analyse vorgesehen ist.

Um die DNA elektroporierend einzubringen, halten Sie das Embryo vorsichtig mit einer Pinzette fest und platzieren Sie die positive Zange der Elektrodenzange leicht auf der dorsalen Mittellinie des Kopfes. Legen Sie die negative Zange leicht unter das Kinn des Embryos. Führen Sie ein Programm mit fünf Impulsen à 30 Volt, jeweils 50 Millisekunden lang im Abstand von einer Sekunde, durch; verwenden Sie dazu ein BTX-830-Modell. Andere Systeme können gemäß den Herstelleranweisungen eingestellt werden.

Bringen Sie jedes Embryo zurück in das eiskalte HBSS und fahren Sie mit der Vorbereitung des gesamten Hemisphären-Explanten unter einem Dissektionsmikroskop mit zwei Pinzetten der Stärke fünf fort. Entfernen Sie die Haut und den knorpeligen Schädel aus dem Kopf des Embryos. Führen Sie als Nächstes die Pinzette unter das Gehirn.

Um das intakte Gehirn aus dem Schädel zu entfernen, dissezieren Sie die elektroporierte Hemisphäre einschließlich des daran befestigten Mittelhirngewebes. Achten Sie darauf, die über der dissezierten kortikalen Hemisphäre liegenden Hirnhäute nicht zu beschädigen. Wir fanden, dass der schwierigste Schritt, den es zu beherrschen gilt, die Dissektion und Entfernung der elektroporierten Hemisphäre ohne Schädigung der Hirnhäute ist.

Nach der Dissektion jedes Hemisphäre unter Verwendung einer verbreiterten Ein-Milliliter-Pipettenspitze in fünf Milliliter eiskaltes HBSS überführen. Bei Bedarf können die Embryonen in separaten Vertiefungen einer 12-Loch-Gewebekulturplatte aufbewahrt werden. Anschließend bis zu sechs Hemisphären vorsichtig auf eine 24-Millimeter-Kollagen-beschichtete Kultur übertragen.

Setzen Sie das Insert mit der medialen Seite nach unten ein und positionieren Sie es. Füllen Sie nun eine 35-Millimeter-Vertiefung einer sechsfachen Platte mit 2,7 Millilitern supplementiertem Medium. Entfernen Sie überschüssiges HBSS vom Insert und geben Sie das Insert in die Vertiefung. Pipettieren Sie mit der Medienpipette einige Tropfen des Mediums aus der Vertiefung auf die Oberseite jedes x-Explantats.

Erhöhen Sie das Mediumvolumen nicht. Wir haben festgestellt, dass es entscheidend ist, einige Tropfen Kulturmedium auf das X-Explantat zu geben, sodass die X-Explantate nicht vollständig mit Medium bedeckt sind. Dies kann bedeuten, bis zu 400 Mikroliter zu den 2,7 Millilitern Medium auf dem X-Explantat hinzuzufügen.

Bringen Sie die Petrischale in eine Billups-Rothenberg-Kammer, die eine befeuchtete Wasserschale enthält und mindestens eine Minute lang mit 95 % Sauerstoff durchströmt wurde. Verschließen Sie die Kammer hermetisch und trennen Sie das Gaszufuhrrohr ab. Stellen Sie die Kammer zwei Tage lang in einen 37 °C warmen Inkubator, wobei bis dahin die Vorstadiums-Spaltung stattgefunden haben wird.

In Vorbereitung. Stellen Sie Polster zum Einbetten des Exemplars her. Bereiten Sie eine 10%ige Kalbsledergelatine-Lösung bei 60 Grad Celsius vor.

Wenn die Substanz gelöst ist, etwa 10 Milliliter der Lösung in eine 10 cm große Schale geben. Die restliche Lösung bei 60 Grad Celsius für spätere Verwendung aufbewahren. Falls erforderlich, den Pads eine halbe Stunde Zeit zur Vollständigen Erstarrung lassen.

Sie können mehrere Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, müssen jedoch vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt werden. Am Tag der Fixierung in einem Abzug bereiten Sie das Pagano, das Fixans und die Pagano-Lösung ohne Fixans vor. Erwärmen Sie die Fixierungslösung auf 37 Grad Celsius.

Entnehmen Sie die Explantate vorsichtig und schnell aus dem Inkubator, ohne das Gewebe zu stören. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums und ersetzen Sie es durch fünf Milliliter vorgewärmtes Fixans. Stellen Sie sicher, dass jedes Explantat vollständig untergetaucht ist.

Fixieren Sie die Gewebe eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Anschließend entfernen Sie das Fixierungsmittel und ersetzen es durch Pagano-Lösung. Ohne Fixierungsmittel.

Geben Sie einige Tropfen 10% Natriumazid in jede Vertiefung. Die Gewebe können nun bei vier Grad Celsius aufbewahrt werden, bis sie auf einem Einbettungsblock fixiert werden. Zeichnen Sie mit Hilfe eines Lineals ein Raster auf den Boden der Schale.

Herstellung von zwei bis drei Zentimeter großen Quadraten. Überführen Sie die einzelnen Explantate auf das Einbettungspolster. Pipettieren Sie jegliche Restlösung ab und bedecken Sie jedes Explantat mit warmer 10%iger Gelatinelösung.

Lassen Sie es erstarren. Nach dem langsamen Erstarren weitere Gelatinelösung hinzufügen, bis jedes Explant vollständig umgeben ist. Vermeiden Sie es, das Polster zu schmelzen, was geschehen kann, wenn zu viel Gelatine auf einmal zugegeben wird.

Lassen Sie nun das Gelatine etwa eine Stunde lang aushärten. Sobald es ausgehärtet ist, kann das einzelne Explan in kleine Gelatineblöcke geschnitten werden, bevor es geschnitten wird. Es ist wichtig, die Blöcke einen Tag oder zwei in Pagano-Fixansatz nachzufixieren.

Beim Schneiden die Explantate mit dem Riechkolben nach oben positionieren und im koronalen Schnitt bei einer Dicke von 100 Mikrometern schneiden. Die Schnitte in gekühltem PBS mit 0,1 % Natriumazid sammeln.

Bewahren Sie die Schnitte bei vier Grad Celsius auf, bis sie mit der beschriebenen Technik gefärbt werden können. Ganze Hemisphären-Explantate wurden am Embryonaltag 13 vor der Prälatenspaltung hergestellt. Im dorsalen Neokortex.

Das Gewebe enthielt ein Transgen, das unreife Neuronen der exzitatorischen kortikalen Linie markiert. Kortikale Explantate aus demselben Wurf wurden über einen Zeitraum von zwei Tagen in vitro nacheinander fixiert und für die anschließende histologische Analyse aufgearbeitet. Zum Zeitpunkt der ersten Analyse, DIV null, hat die Vorläuferzellteilung in Feld eins nach dem anderen noch nicht stattgefunden. DIV.

Die CP werden sichtbar und wuchsen weiter bis zum 2D IV. Somit unterstützten die ursprünglich am E13 kultivierten halbkugelförmigen Explantate zwei Tage lang die Reifung der Großhirnrinde und erfassten die Aufspaltung des Prelate im dorsalen Neokortex, um die normale histologische Entwicklung im dorsalen Neokortex zu bestätigen. Die 2D IV-Explantate wurden immunhistochemisch auf Chondroitinsulfat, Proteoglykane und Komponenten der extrazellulären Matrix gefärbt. Zwei Bande der Immunreaktivität im dorsalen Kortex deuteten auf eine angemessene Aufspaltung des PPP in MZ und SP während der In-vitro-Kulturphase hin.

Das PP wurde durch L sechs kortikale Neuronen, die CTIP zwei und TBR R eins exprimieren, aufgeteilt. Das Immunfärbungsmuster dieser Marker bestätigt die angemessene Expression dieser Transkriptionsfaktoren im neu gebildeten cp. Zusammen bestätigen diese Analysen die organspezifische frühe kortikale Entwicklung im gesamten Hemisphären-Explantat unter Verwendung des vollständig beschriebenen Protokolls, wobei die linke Herzkammer intakter E 13-Embryonen injiziert wurde.

Elektroporierte und verarbeitete GFP-Expression konnte in neuronalen Vorläuferzellen in der vz beobachtet werden. Während intensive GFP-exprimierende Zellen in der IZ und cp zu sehen waren, wurden wichtigerweise zahlreiche mit Pfeilspitzen markierte GFP-positive Neuronen an der Spitze des sich bildenden cp mit sich entwickelnden Dendriten und Axonen beobachtet. Die deutliche Schichtung an der Grenzfläche zwischen cp und mz weist auf eine angemessene Migration, Arrestierung und Schichtung hin.

Die Dendriten erstreckten sich in die MZ, während kortiko-ugale Axone unterhalb der CP und in die IZ hinein reichten. Die differenzierenden Zellen waren GFP-positive Zellen in unterschiedlichen Reifestadien, einschließlich Neuronen mit bipolarer Morphologie, die neben radialen glialen Fasern lagen, sowie darunter liegende multipolare Neuronen in der IZ. Die Dendriten erstreckten sich außerdem in die MZ, wo das ECM-Protein Reelin korrekt immunlokalisiert ist.

Daher ermöglichen die Elektroporations- und Explantenbedingungen eine normale Entwicklung kortikaler Neuronen. Wie erwartet besiedelten postmitotische, GFP-positive Neuronen den sich bildenden cp. Somit kann das Protokoll zuverlässig kortikale Neuronen der Schicht sechs für Untersuchungen ihrer Migration und Reifung gezielt ansprechen.

Die umfangreiche Anwendung dieses Verfahrens hat zu einer Erfolgsquote von 79 % geführt. 195 von 248 Versuchen eigneten sich für die Bildgebung und Analyse. Die Hälfte der Fehlschläge resultierte aus einem Ausbleiben der GFP-Expression oder aus verfehlten Zielstrukturen für GFP, sobald das Verfahren beherrscht wurde.

Diese Technik kann innerhalb von 90 Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Dissektionen zu üben, damit die elektroporierten Hemisphären mit intakten Hirnhäuten nach diesem Verfahren kultiviert werden können. Weitere Methoden wie die Zeitraffer-Mikroskopie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie Mutationen von Interesse die neuronale Migration oder die Dendritenbildung stören.