Name: Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Bakterien aus Protozoen gewinnen und quantifizieren, um Säugetierzellen zu infizieren. Diese Methode nutzt fluoreszenzmarkierte Legionella und Flusszytometrie zur Analyse.

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Wir danken Dr. Craig Roy und Dr. Dario Zamboni für die Bereitstellung einer Vorlage für Protozoen Zelle Infektionen. Wir danken Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron und Todd Wisner für Geräte und Reagenzien; Dr. Lulu Cambronne für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Durchflusszytometrie wurde am OHSU Durchflusszytometrie Shared Resource Facility durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss aus dem Medical Research Foundation of Oregon und einer NIH R21 AI088275 (EDC) unterstützt.

Ein. Vorbereitung der Legionella pneumophila Kulturen für Priming Stufe Infektionen <ol><li> Verwandeln Sie alle L. pneumophila-Stämme in dem Assay mit dem Plasmid pAM239 verwendet, die für ein Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbaren grün fluoreszierendes Protein (GFP) 28. Streak die Bakterienstämme auf Eisen und Cystein N-(2-Acetamido)-2-Aminoethansulfonsäure (ACES) ergänzt gepufferten Aktivkohle Hefeextrakt-Agar (CYEA) mit 6,25 g / ml Chloramphenicol (CM) (für Plasmid-Wartung) und inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Übertragen ein Inokulum des Bakterienstammes in ergänzt ACES gepufferten Hefeextrakt-Brühe (AYE) mit 6,25 pg / ml CM und 1 mM IPTG und kultivieren bis zur stationären Phase (O / N) auf einem Schüttler bei 37 ° C </li><li> Bestätigen GFP-Expression in den in vitro-Kulturen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Übertragen 10 ul der Kultur auf einen Objektträger unter einer AbdeckungRutsch-und Bild mit einem 60X-Objektiv mit GFP Anregung / Emission cube (AMG EVOS fl). </li><li> Verdünnen Sie eine 100 ul-Aliquot jeder in-vitro-Kultur bis 1:10 mit sterilem H 2 O. Stellen Sie eine leere mit 100 ul AYE Medien mit 1 mM IPTG und 6,25 pg / ml cm und Wasser. Nehmen OD600 Messungen der Verdünnungen mit einem Spektralphotometer (Bio-Rad Smart-Spec Plus). Berechnen des Volumens erforderlich, eine gut bei einer MOI = 20 infizieren für jede in vitro-Kultur: V = [(Amöben seeded) x MOI] / [OD 600 x (Verdünnungsfaktor) x (konstant)] = [(1 x 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Bakterienkonzentration als OD 600 = 1,0 ermittelt = 1 x 10 9 CFU / ml. </li></ol> 2. Priming Stufe Infektion mit Acanthamoeba castellanii <ol><li> Pflegen und pflegen die Amöben in ATCC 712 PYG Medium in 175 cm 2-Kolben bei RT. </li><li> Ersetzen Medien in Amöben culturen 24 Stunden vor Beginn der bakteriellen flüssigen Kulturen. Am gleichen Tag flüssigen Bakterienkulturen gestartet werden, zu sammeln und zu zählen Zellen auf einem Lichtmikroskop unter Verwendung eines Hämozytometers. </li><li> Verdünnt das Amöben mit frischem Medium auf eine Endkonzentration von 1 × 10 6 Zellen / ml. Seed 12-Well-Zellkultur-Platten mit 1 ml Aliquots der Amöben mit einem Repetierpipette und inkubieren bei RT O / N. </li><li> Nach der Inkubation die Wells der 12-Well-Zellkultur-Platten 3x mit 1 ml steriler PBS mit einem 10 ml serologische Pipette und eine manuelle Pipette Hilfe. </li><li> Nach dem Absaugen des PBS, 1ml der Infektion Medien (ATCC 712 PYG media minus Glukose, Pepton und Hefeextrakt) mit 1 mM IPTG und 6,25 pg / ml cm in jede Vertiefung. Die Inkubation bei RT für 1 Stunde. </li><li> Infect Vertiefungen bei einer MOI = 20. Zentrifuge die Platte bei 400 xg für 5 min (Eppendorf 5810R) und schwimmen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. Übertragen der Platte an einem 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator für 18 Stunden. </li><li> Bestätigen Sie die Infektionen mit Live Cell Imaging auf einem Fluoreszenzmikroskop vor Zelllyse und Ernte von Bakterien beherbergen. </li></ol> 3. Seeding THP-1-Zellen für Target-Zell-Stadium Infektion <ol><li> (Beginn dieses Prozesses 24 Stunden vor dem Einrichten flüssigen Bakterienkulturen). Kultivieren THP-1-Zellen in einem 75 cm 2-Kulturflaschen nahe-Konfluenz in RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Zählen der Zellen unter Verwendung einer Suspension Hämozytometer, verdünnt den THP-1-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 100 ng / ml Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) zu einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml und die Platte in 1 ml Aliquots auf 12-Well-Zellkultur-Platten. Die Inkubation erfolgt 48 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 4. Verarbeitung von Bakterien für Target-Zell-Stadium Infektion nach der Grundierung Bühne Infektion <ol><li> Saugen Sie das Medium aus dem grundiert Amöben. </li><li> Lysieren die amoebae mit 500 ul eiskaltem, sterilen ultrafiltriertes (UF) H 2 O und Inkubation bei RT für 10 min. </li><li> Pool Die Lysate nach Art belasten und nehmen eine E 512 nm Messung für jede der gepoolten Lysaten mit einem Fluoreszenz-Reader (Molecular Devices Spectramax Zwilling EM). </li><li> Berechnen Sie einen OD 600-Messung für den gepoolten Lysaten: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - Lysat Hintergrund) + 0,0019. Die Formel wurde zuvor durch die grafische Darstellung einen direkten Vergleich sowohl der OD 600 und der E 512 nm Messungen von Verdünnungen von L. ermittelt pneumophila Wildtyp-GFP exprimieren von stationärer Phase in vitro-Kultur (1 *). Die Lysate der nichtinfizierten Amöben, unterliegen den gleichen experimentellen Bedingungen wie die infizierten Amöben, werden als Rohling verwendet und einen Korrekturwert (zB Lysat Hintergrund), die in die Gleichung eingearbeitet wurde. Das notwendige Volumen to infizieren auch bei einer MOI = 20 wird für jedes Lysat Pool berechnet: V = [(THP-1 seeded) x MOI] / [calcOD 600 x (konstant)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20/600 calcOD. </li><li> Waschen Sie die THP-1-Zellen 3x mit PBS und 1 ml frisches RPMI 1640 (10% FBS) in jede Vertiefung. Inkubieren THP-1-Zellen für 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Infizieren die THP-1 Zellen bei der Verwendung der berechneten MOI gepoolt Lysaten. Zulassen, dass ein Satz von Vertiefungen bleiben uninfizierten, dient als negative Kontrolle für die durchflusszytometrische Analyse. Verarbeitung der Grundierung Stufe sollte in weniger als 30 Minuten abgeschlossen werden. Die Lysate werden auf Eis gehalten, um Veränderungen in bakterielle Genexpression vor der Infektion zu begrenzen. </li><li> Zentrifuge die Platte schweben um die Temperatur zu erhöhen, und inkubieren, wie in der Grundierung Bühne. </li><li> Eine Stunde nach der Infektion, entfernen Sie die Medien durch Aspiration und waschen Brunnen 3x mit PBS auf extrazelluläre Bakterien zu entfernen. </li><li> 1 ml fresh RPMI 1640 (10% FBS), in Vertiefungen und kehren die Platte in den Inkubator. Der Zeitpunkt unmittelbar nach Medienersatz dient als Zeitpunkt Null (T 0). Inkubieren der THP-1-Zellen für 14-16 Stunden bei 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 5. Experimental Analysis 5.1 Live Cell Imaging Bild die infizierten Brunnen mit einem Fluoreszenzmikroskop (AMG EVOS fl) bei 10X oder 20X Vergrößerung (1A-D). Die Bilder können entweder qualitativ oder quantitativ verglichen werden, um Niveaus einer Infektion sowohl in der Initialisierungszusammensetzung Stufe und Stufe Infektionen Zielzelle zu bestimmen. 5,2 Durchflusszytometrie <ol><li> Die Emissions-Peaks verschiedener Infektionen können durch Durchflusszytometrie (BD FACS Calibur) verglichen werden. Trypsinieren die infizierten THP-1-Zellen und vorsichtig waschen sie aus den Vertiefungen durch Mischen in PBS mit einer Pipette. </li><li> Pool die Zellen von Stamm-Typ in 15 ml Falcon-Röhrchen und Pellet bei 1.800 xg für 2min in der Tischzentrifuge. </li><li> Suspend die Pellets in 1 ml PBS und Transfer zum 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.800 x g (Eppendorf 5424) und wieder aussetzen Pellets in 1 ml PBS. Wenn die resultierenden Suspensionen stark trüb werden (OD 600 ≥ 1,0) sie müssen in zusätzlichen PBS (1:3) verdünnt werden, um ein Verstopfen der Leitungen in dem Durchflusszytometer verhindern. </li><li> Verwenden sterilfiltriert PBS für die Äquilibrierung des Durchflusszytometers und Waschschritte zwischen Probeninjektionen. Zur Erstellung der Vorwärts / Seitenstreuung von nicht infizierten Targetzellen vor der Injektion von Zielzelle Infektion Proben. </li><li> Sammle 20.000 insgesamt Veranstaltungen für jeden Zustand mit 488 nm Laser-Anregung und die FL1-Kanal. </li><li> Tor nach der Aufnahme Zellpopulationen auszuschließen infizierten Zellen und Grundstück Fluoreszenzintensität in einem Histogramm (FlowJo) (Abbildung 1E). </li></ol> 5,3 CFU plating <ol><li> Untersuchen Sie die Effizienz of Infektion durch Plattieren CFU der Zellen für Durchflusszytometrie geerntet. Planen serielle Verdünnungen der Proben in ultrafiltriertes H 2 O bei 10 -1, 10 -2 und 10 -3. </li><li> Platte 20 ul jeder Verdünnung auf 1/3 einer CYEA Platte mit 6,25 pg / ml CM. </li><li> Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 72 Stunden. </li><li> Zählen Sie die Kolonien mit einem Zahnstocher und Zell-Zähler. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Bakterielle Genexpression dicht durch eine Kombination von Lebenszyklus Progression und ansprechend auf Signale in der umgebenden Mikroumgebung gesteuert. Vacuolar Krankheitserreger wie L. pneumophila zu einer Vielzahl von Host-Zellen abgeleiteten Signale reagiert, wenn in einem Phagosom kompartimentiert. Als Ergebnis der kollektiven Erschöpfung Nährstoff in der Wirtszelle, kompensiert das Bakterium durch Expression für erfolgreiche Verbreitung erforderlich zu einer nachfolgenden 25 Wirtszelle. L...

Zahlreiche bakterielle Krankheitserreger allgemeine Strategien zur Wirtszellen für das Überleben und Replikation in einem intrazellulären Kompartiment nutzen angepasst. In vielen Fällen sind pathogenen Mechanismen ähnlich zwischen Protozoen und Metazoen Zellen. Jedoch sind diese beiden Mikroumgebungen sehr verschieden sein und in unterschiedliche Expression von Virulenzfaktoren 1-4 führen. Die Legionärskrankheit Bakterium Legionella pneumophila ist ubiquitär mit Süßwasser-Umgebungen weltweit 5 verbunden. Wichtig ist, dass L. pneumophila in Protozoen Zellen vor der Infektion von menschlichen Monozyten gewinnen eine pathogene Vorteil kultiviert, was darauf hindeutet, dass globale Genexpressionsprofile des Bakteriums Verlassen eines Protozoen-Zelle unterschiedlich sind als die der in vitro kultivierten Organismus 6-8. In der Natur, bieten Süßwasser Amöben nährstoffreichen Grenzen für eine schnelle Verstärkung eines eindringenden Bakteriums. Menschliche Akquisition von L. pneumophila wird häufig die Inhalation von kontaminiertem Wasser Tröpfchen, die das Bakterium enthalten, zurückzuführen. Es ist wahrscheinlich, dass diese Tröpfchen Hafen Protozoen Zell-assoziierten Bakterien, wo Protozoen Zellen sind resistent gegen herkömmliche Wasseraufbereitung Praktiken 9,10. Infektion der Lunge Alveolarmakrophagen verläuft in einer Weise nahezu identisch mit dem intrazellulären Lebenszyklus des Bakteriums in Protozoon-Wirtszellen 11-13. Um zu überleben und zu replizieren in eukaryotischen Zellen, L. pneumophila verwendet eine spezielle Art IVb Sekretionssystem bezeichnet Dot / Icm auf fast 300 &quot;Effektor&quot;-Proteine ​​in das Zytosol der Wirtszelle 14-16 liefern. Diese Effektorproteine ​​kollektiv funktionieren, um zelluläre Prozesse zu unterlaufen, um eine Replikation permissiv Abteil für das Bakterium 17,18 erzeugen. Deletionen in einem der 26 Gene, die die Dot / Icm Transporters defekt Ergebnis in Stämmen für intrazelluläre mult umfasseniplication 19-23. Historisch Löschen einzelner Effektor-Gene kodieren selten führte Stämme gedämpft für die intrazelluläre Wachstum. Dieses Phänomen hat mehrere Hypothesen, einschließlich redundanter Funktion und paraloge Kopien von Effektoren zugeschrieben. Einige Virulenzfaktoren sind nur im Rahmen der Wirtszell-assoziierter intrazelluläre Wachstum 24 exprimiert. Wir nahmen an, dass, wenn eine bestimmte Effektorzellen wurde nur im Kontext von Protozoen-Infektion exprimiert wird, dann der Beitrag des Effektors nicht durch einen Wildtypstamm, wenn sowohl in vitro kultiviert wurden verglichen werden. L. pneumophila Übergänge von einem replikativen zu einer transmissiven Phase, wie sie der stationären Phase in der Kultur 25 eintritt. Die Phase Switching Phänotyp stellt die Nährstoffverarmung während der intrazellulären Wachstums gestoßen und wird durch die Montage von Flagellen für Motilität 26 veranschaulicht. Da L. pneumophila ist invasive und virulent, wenn sie von Protozoen Zellen geerntet, haben wir versucht, einen Test, dass mehr treu die pathogenen Zustand des Bakteriums vertreten, wenn es Host-Makrophagen begegnet entwickeln. Zu diesem Zweck haben wir ein vielseitiges Protozoen Priming-Assay, die jeden geeigneten Wirt für sowohl den ersten (Priming Zelle) und zweiten (Zielzelle) Stufe Infektionen unterbringen kann. Die Infektion Prozess ist lenkbar durch Verwendung von Bakterien stabil exprimieren grün fluoreszierendes Protein (GFP). Die Infektion Modell für die Protozoen Acanthamoeba castellanii folgt eine Methode weit verbreitet im Bereich 27 verwendet. Für die Grundierung Schritt, L. pneumophila-Stämme werden in vitro bis zur stationären Phase in flüssigen Medien kultiviert, um als &#39;durchlässigen&#39; Bakterien (1A) zu erzeugen. Bakterien nächsten zur Monolagen A. infizieren castellanii 18 Stunden zur Erzielung einer späten Stufe des intrazellulären Lebenszyklus. Große Vakuolenten Bakterien können zu diesem Zeitpunkt mittels Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1A) visualisiert werden. Protozoischen Zellen werden dann lysiert und Bakterien aus dem Lysat gewonnen werden für die Emission bei 512 nm unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät gemessen. Fluoreszenz wird mit optischen Dichte korreliert Multiplizität-of-Infektion (MOI) für die Infektion von Zielzellen (Abb. 1, * Korrelation Kurve) zu berechnen. Nach Invasion (T 0) und 18 Stunden nach der Invasion (T 18), werden die Zielzellen für Fluoreszenz quantifiziert darstellt intrazellulären Bakterien. Fluoreszenz kann durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie überwacht werden, und kann durch Keimzahlen Kolonie Plattieren gemessen werden. Die Grundierzusammensetzung Assay wird immer durch Infektionen mit Wildtyp L. begleitet pneumophila und ein Stamm einen Defekt im Dot / Icm Typ IV-Sekretionssystem (Δ dota) (Abbildung 1A). Dies wichtiger bietet interne Kontrollen für direkte Vergleiche zwischen Wildtyp-and keine isogenen Mutanten bei der Infektion verwendet. Die Einbeziehung des avirulenten Stamm Δ DOTA während des Priming Stufe einen Schwellenwert für die Beobachtung eines abgeschwächten Wachstums Phänotypen mit isogenen Mutantenstämmen, die in vitro kultiviert werden, zugeordnet ist.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz</td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td> ACES Sigma A9758-1KG <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>ATCC Medium: 712 PYG</td><td>ATCC</td><td></td><td>Wachstumsmedien für Protozoen</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Aktivkohle</td><td>Fisher Scientific</td><td>C272-212</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Diagnostik</td><td>211677</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>L-Cystein, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>173601000</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>Eisennitrat Nonahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I110-100</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EVOS fl</td><td>AMG</td><td>EVOS fl</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Smart Spec Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Spektralphotometer</td></tr><tr><td>5810 R Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22627023</td><td>Tischzentrifuge</td></tr><tr><td>Repeater plus</td><td>Eppendorf</td><td>22230201</td><td>Repeating-Pipette</td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Mikroplatten-Reader</td></tr><tr><td>Softmax Pro 5.3</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td>Microplate Reader Software</td></tr><tr><td>5424 Mikrofuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td>Tischplatte Mikrozentrifuge</td></tr><tr><td>Schnellwechsel-Pipettenpumpe II</td><td>Scienceware</td><td>379111010</td><td>Pipettenhilfe</td></tr><tr><td>FACS Calibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>FlowJo 7.6.1</td><td>FlowJo</td><td>Lizenz</td><td>Durchflusszytometer-Software</td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>konisches Röhrchen aus Polypropylen</td></tr><tr><td>1,6 ml Mikrofuge-Röhrchen</td><td>Neptune</td><td>3745.X</td><td>Mikrozentrifugen-Röhrchen</td></tr></tbody></table>

gefügig mammalian cell infektionen mit protozoen-grundiert bakterien

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Viele intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger verwenden Süßwasser Protozoen als natürliches Reservoir für die Proliferation in der Umwelt. Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit Lungenentzündung, gewinnt eine pathogene Vorteil gegenüber in vitro kultivierten Bakterien beim ersten von Protozoen Zellen geerntet vor der Infektion von Säugetieren Makrophagen. Dies deutet darauf hin, dass wichtige Virulenzfaktoren möglicherweise nicht richtig in vitro exprimiert werden. Wir haben eine tractable System zur Grundierung L. entwickelt pneumophila durch seine natürliche Protozoen Host Acanthamoeba castellanii vor Säugetierzellen Infektion. Der Beitrag eines Virulenzfaktor durch Vergleichen intrazellulären Wachstum eines Mutantenstammes zu Wildtyp-Bakterien nach Protozoen Priming untersucht werden. GFP-exprimierenden Wildtyp und Mutante L. pneumophila-Stämme verwendet werden, um Protozoen Monoschichten in einem Priming-Schritt infizieren und dürfen späten Stadien der intrazellulären Wachstum zu erreichen. Fluoreszierende Bakterien werden dann aus diesen infizierten Zellen geerntet und normiert durch Spektrophotometrie um vergleichbare Anzahl von Bakterien für eine nachfolgende Infektion in Säugern Makrophagen erzeugen. Zur Quantifizierung werden lebenden Bakterien nach der Infektion überwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie, durch Kolonie und Plattieren. Diese Technik hebt und stützt sich auf den Beitrag der Wirtszelle-abhängige Genexpression durch Nachahmung der Umgebung, die in einem natürlichen Erwerb Weg begegnet wäre. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um jegliche Bakterium, das einen Vermittler Host verwendet als Mittel zur Gewinnung eines pathogenen Vorteil unterzubringen.

Ein typisches Ergebnis für die gesamte Infektion ist in Abbildung 1 dargestellt. Live-cell Fluoreszenzaufnahmen Darstellung Monolagen A.castellanii mit Wildtyp L. infiziert pneumophila während des Priming Stufe wird in 1A gezeigt. Eine erfolgreiche Maßnahme des Priming-Schritt würde zu einer Bevölkerung von etwa 90% der Wirtszellen mit großen Vakuolen mit GFP markierten Bakterien an dieser MOI besiedelten führen. Bei 18 Stunden nach der Infektion, die meisten ...

Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszenztechnisch nachverfolgbare Bakterien aus einem Zwischenwirt zu gewinnen und zu quantifizieren, um anschließend Säugetierzellen zu infizieren. Hier werden Legionella mala, die GFP exprimieren, verwendet, um die natürlichen Wirt-Protozoen Acanthamoeba castellanii in Monolagen zu infizieren. Die L. mala werden anschließend durch selektive Lyse gewonnen, und die Konzentration der Bakterien wird dann anhand einer Formel berechnet, die auf der Fluoreszenzemissionsverdünnung des Protozoen basiert.Die vorbehandelten Bakterien werden anschließend zur Infektion von monolayerartigen Säugetierzellen verwendet. Schließlich wird die Anzahl der infektiösen Bakterien in den Säugetierzellen mittels einer Kombination aus Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie und Ausplattieren von Lysaten zur Bestimmung der koloniebildenden Einheiten ermittelt. Die erhaltenen Daten zeigen einen pathogenetischen Vorteil der Bakterien, die im Vorbehandlungsschritt in Protozoenzellen kultiviert wurden, im Vergleich zum gleichen Stamm, der in einem künstlichen Medium kultiviert wurde.Wir entwickelten diese Technik, indem wir beobachteten, dass die E

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Toxoplasma gondii verwandelt sich in eine Zyste bilden als Reaktion auf Belastungen der Umwelt, die in Gewebekultur-Modellen nachgeahmt werden kann. Dieses Video zeigt Techniken, um Zystenwand Bildung durch Aktivierung des Knochenmarks-Makrophagen oder Ändern Wachstumsmedium pH in Fibroblasten-Zellen zu untersuchen.

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Genetische Kreuzungen Nagetier Malaria-Parasiten werden durch Zuführen von zwei genetisch verschiedene Parasiten Mücken durchgeführt. Rekombinante Nachkommen sind von der Maus Blut nach Abzug Mücken infizierten Mäuse beißen geklont. Dieses Video zeigt, wie genetische Kreuzungen...

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Hier berichten wir ein Verfahren zur Verwendung von Typ I und Typ...

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Unter Verwendung dieses Protokolls konnten wir Bild 160 um dicke Gehirnschnitte von Mäusen mit dem Parasiten Toxoplasma gondii, der Visualisierung und Analyse der räumlichen Beziehung zwischen dem encysting Parasiten und der infizierten Neuronen ermöglicht infiziert.

3-D-Bildgebung und Analyse von Neuronen Infizierte In-vivo- Mit Toxoplasma gondii

Die Prionen-ähnliche Vermehrung von Proteinaggregaten hat sich in letzter Zeit als an vielen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie der Fadenwurm C. elegans als Modellsystem zur Überwachung der Proteinausbreitung und zur Untersuchung prionenähnlicher Phänomene verwendet werden kann.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um Bakterienerfassung durch CD4 + T-Zellen, die während der Antigenpräsentation über transinfection aus bereits infizierten dendritischen Zellen (DC) auftritt, zu messen. Wir zeigen, wie man die notwendigen Schritte durchführen: Isolierung von primären Zellen, Infektion von DC, DC / T-Zell-Konjugat-Bildung, und die Messung der bakteriellen T-Zell-Transfektion.

T-Zellen erfassen Bakterien durch Transinfection von dendritischen Zellen

Hier boten wir eine Methode zur Erreichung einer stabilen Transfektion von Eimeria-Parasiten durch Nukleofektive Sporozoite oder Merozoitder der zweiten Generation. Genetisch veränderte eimerische Parasiten, die heterologe antigene Gene exdrücken, könnten als Impfstoff-Liefervehikel verwendet werden.

Nukleofection und In Vivo Propagation von Hühner Eimeria Parasiten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, zu unterweisen, wie man murine Astrozyten- und Mikrogliazellen aus dem zentralen Nervensystem extrahiert, aufrechterhält und dissoziiert, gefolgt von einer Infektion mit Protozoenparasiten.

Gleichzeitige Isolierung von Primärastrozyten und Mikroglia bei Protozoenparasiten-Infektion

Malaria wird durch Inokulation des Sporozoitenstadiums von Plasmodium durch infizierte Stechmücken übertragen. Transgenes Plasmodium hat es uns ermöglicht, die Biologie der Malaria besser zu verstehen und hat direkt zur Entwicklung von Malaria-Impfstoffen beigetragen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Generierung transgener Plasmodium berghei-Sporozoite.

Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Transfektion von Naegleria gruberi Trophozoiten mit einem Konstrukt, das während der gesamten passagierenden Trophozoiten in vitro sowie durch Enzystierung und Exzystierung erhalten bleibt.

Transfektion eines molekularen Klons von Naegleria gruberi rDNA in N. gruberi Trophozoiten

Hier wird ein Protokoll für das Design, die Konstruktion und die Bereitstellung eines tetracyclingesteuerten induzierbaren synthetischen Schaltkreises vorgestellt. Die Wirkung der synthetischen Schaltkreise auf die Parasiteneliminierung und die Zytokinexpression kann durch Kanalisierung der vorgestellten Pipeline untersucht werden. Dieses Protokoll ist relevant für Forscher, die synthetische Schaltkreise bei Infektionskrankheiten untersuchen.

Immunmetabolische Schaltkreise in der Infektion zur Weiterentwicklung wirtsgerichteter Therapien

Erfahren Sie, wie Sie Bakterien aus Protozoen gewinnen und quantifizieren, um Säugetierzellen zu infizieren. Diese Methode nutzt fluoreszenzmarkierte Legionella und Flusszytometrie zur Analyse.

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

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