Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, adhäsive und lösliche Gradienten zu erzeugen, um die Zellmigration zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Oberfläche passiviert wird, um eine unspezifische Zelladhäsion zu verhindern. Der zweite Schritt besteht darin, Stempel aus dem Mikrokontaktdruck herzustellen.

Als nächstes wird die Oberfläche durch Mikrokontaktdruck mit Streptokokken-Avid-Linien strukturiert. Umreifter Din kann auch als Punkte gedruckt werden, indem er mit Hilfe einer Tauchstift-Lithographie an der Unterseite eines mikrofluidischen Geräts angebracht wird. Die modifizierte Oberfläche dient als Grundlage für einen adhäsiven Gradienten von Biotin RGD.

Der letzte Schritt besteht darin, Zellen mit dem Adhäsionshinweis in Gegenwart eines löslichen Chemo-Lockstoffgradienten auf die Oberfläche zu laden. Letztendlich wird die Lebendzellmikroskopie verwendet, um die Zellmigration als Reaktion auf adhäsive und lösliche Signale zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. Transwell- oder Void-Chamber-Assay und einem herkömmlichen mikrofluidischen Aufbau, besteht darin, dass das desintegrierte System des Oberflächenmusters die Beobachtung von Zellreaktionen auf räumlich kontrollierte Adhäsionsreize und Adhäsivgradienten und einen löslichen Gradienten gleichzeitig ermöglicht.

Nun, diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellmigration zu beantworten, wie z. B. die Bedeutung der Zelladhäsion und die Ursache eines Schlaganfalls zwischen Chemo-Texas-Rezeptoren wie Rezeptorseen-Kinase-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und Adhäsionsrezeptoren wie RIN To eat glass cover slips. Reinigen Sie zuerst die Deckgläser, indem Sie sie in ein Gestell in 100%iges Ethanol tauchen und das Gestell für 30 Minuten in ein Wasserbad legen. Trocknen Sie die Glasabdeckung an der Luft.

Anschließend beschallen Sie die Glasdeckgläser 30 Minuten lang in einem molaren Natriumhydroxid. Spülen Sie anschließend die Glasflächen aus, indem Sie das Gestell vorsichtig in ein Becherglas kippen, das mit eineinhalb Litern Milliwürfelwasser gefüllt ist. Wiederholen Sie den Spülvorgang dreimal mit jeweils frischem Milliwürfelwasser.

Nach dem dritten Spülgang trocknet die Glasabdeckung für etwa eine halbe Stunde bei 60 Grad Celsius in einen Ofen. Legen Sie die Hälfte der sauberen Glasabdeckungen einzeln in eine Feuchtkammer, die aus einer 24-Well-Platte besteht, die teilweise mit Wasser gefüllt ist. Die Vertiefungen werden mit Wasser gefüllt und die Glasdeckgläser werden für die Ation auf die Vertiefungen gelegt. Es wird ein Copolymer aus Polylysin und Polyethylenglykol verwendet, in dem 20 % der Peg-Moleküle auf Biotin aufgepfropft werden.

Abgekürzt als PLL Peg Biotin tropfen 15 Mikroliter PLL Peg Biotin in PBS auf jedes Glasdeckglas. Nehmen Sie die andere Hälfte der restlichen sauberen Glasdeckgläser und legen Sie die PEG-Lösung vorsichtig in ein Sandwich. Lassen Sie die Deckgläser eine Stunde lang in der Feuchtkammer.

Nach einer Stunde Gleiten gleitet der Sandwichbezug sanft voneinander weg, ohne die PEG-beschichtete Oberfläche zu kratzen, und spült sie mit UE-Wasser ab. Das Wasser sollte auf der mit dem Stift behandelten Seite leicht abgleiten. Gegebenenfalls.

Trocknen Sie die Glasabdeckung an der Luft auf einem Papiertuch, wobei die behandelte Oberfläche nach oben zeigt. Die Glasabdeckung gleitet bis zur weiteren Verwendung in einem Vakuumtrocknen. Der für dieses Verfahren benötigte Silizium-Master wird durch Fotolithographie hergestellt, um den A-P-D-M-S-Stempel für das PDMS-Elastomer in einer etwa einen Zentimeter hohen Petrischale auf den Silicon Master zu gießen und das Master-PDMS-Gemisch in einem Ofen bei 70 Grad Celsius eine Stunde lang auszuhärten.

Anschließend wird der PDMS-Stempel aus dem Silikonmaster entfernt und auf die richtige Größe zugeschnitten, um Proteinmuster mit der Mikrokontaktdrucktechnik zu drucken, zuerst zu reinigen und die PDMS-Stempel hydrophiler zu machen, indem die Musterseite unmittelbar nach der Ozonbehandlung eineinhalb Stunden lang in einem UV- und Ozonreiniger behandelt wird. Und verteilen Sie 10 Mikroliter abgestreiftes Adin auf die PDMS-Stempel. Wenn Spuren unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar sein sollten, verwenden Sie abgestreiftes Aden, das an ein Fluoro-Vier konjugiert ist, z. B. gestripptes Avid und LOR drei 50.

Eine Stunde in einer feuchten Kammer ruhen lassen. Entfernen Sie überschüssiges Streptokokken vom Stempel mit Taschentuch, Papier und Luft. Trocknen Sie den Stempel etwa eine Minute lang.

Drücken Sie den Stempel leicht auf den PLL Peg Biotin beschichteten Glasdeckglas. Wenn fluoreszierendes Streptokokken verwendet wurde, untersuchen Sie das Muster unter einem Epi-Fluoreszenzmikroskop. Proteinmuster können auch mit Hilfe der Tauch-Stift-Lithografie gedruckt werden.

Mischen Sie zunächst einen Teil von einem Milligramm pro Milliliter, Strippin oder gestripptes Avidan Elif Fluor three 50 mit 10 Teilen Glycerin und laden Sie fünf Mikroliter des Gemisches auf den Ausleger. Passen Sie die Druckgeschwindigkeit an. Kontaktzeit des Auslegers auf der Oberfläche oder ein vertikaler Abstand des Auslegers zur Oberfläche, um die Punktgröße zu reduzieren.

Etwa fünf Mikrometer beginnen den Druckvorgang, wie in der Bedienungsanleitung des Tauchstift-Lithographie-Instrumentenlagers beschrieben. Alle bedruckten Oberflächen in einem Trockenmittel. Ein kommerziell erhältliches mikrofluidisches Gerät wird verwendet, um Oberflächengradienten zu erzeugen.

Kleben Sie diese mit Tritin beschichteten oder gemusterten Glasabdeckungen auf die klebrige Seite des Geräts, um sicherzustellen, dass mehrere Stunden lang keine Leckagen auftreten. Versiegeln Sie die Ränder des Geräts mit einer dünnen Schicht erwärmter Vaseline und mit einer zweiten Schicht einer Mischung aus einem Teil Vaseline und einem Teil Paraffinwachs. Füllen Sie den Kanal des Geräts mit sechs Mikrolitern PBS, um zwei gegensätzliche Farbverläufe zu erzeugen.

Füllen Sie die beiden Reservoire, eines mit 70 Mikrolitern Biotin, vier Fluorescein und das andere mit 70 Mikrolitern Biotin, konjugiert mit biotinyliertem Peptid Arginin, Glycin, Spartinsäure oder RGD, inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln für eine Stunde. Das Spülen von Biotin, RGD und Biotin fit des mikrofluidischen Geräts ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens, da die Gefahr besteht, dass Luftblasen eingeschlossen werden und die gedruckten Mikrokontaktspuren gestört werden. Um den Erfolg zu gewährleisten, müssen das Biotin und PBS vorsichtig und langsam entfernt werden.

Entfernen Sie die Biotinlösungen und spülen Sie die Oberfläche vorsichtig zweimal vorsichtig mit PBS ab, während sie noch an dem mikrofluidischen Gerät befestigt ist. Markieren Sie die Richtung des Adhäsivgradienten, bevor Sie fluoreszenzmarkierte Zellen in das Mikrofluidikgerät laden. Zählen Sie die Zellen und teilen Sie sie in zwei Röhrchen mit gleicher Zellzahl auf.

Waschen und reanimieren. Suspendieren Sie ein Röhrchen mit Zellen mit Medien, die den Chemolockstoff enthalten, wie z. B. DMEM mit niedrigem Glukosegehalt und 10 % FBS-Waschung, und das andere Röhrchen mit Zellen in Medien. Ohne den Chemo-Lockstoff wie DMEM mit 0% FBS sollte die Endkonzentration der Zellen in jedem Röhrchen fünfmal 10 der fünften Zellen pro Milliliter betragen.

Entfernen Sie alle Lösungen aus dem mikrofluidischen Gerät und legen Sie es auf das vorwarme Mikroskop. Laden Sie 70 Mikroliter Zellen, die in 0%F-B-S-D-M-E-M resuspendiert sind, in ein Reservoir. Laden Sie 70 Mikroliter Zellen, die in 10 % F-B-S-D-M-E-M resuspendiert sind, in ein anderes Reservoir

Locker platziertes Klebeband über den Behältern, um Verdunstung zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass sich der Kanal des mikrofluidischen Geräts im Sichtfeld befindet und die Zellen scharf sind. Wählen Sie Bildaufnahmeparameter wie Belichtungszeiten und Leuchtstofffilter aus.

Bildsequenz von Hellfeld und Fluoreszenz, die Zellen und Tracks sowie Zeitpunkte und Aufnahmelänge starten das Bildaufnahmeprogramm. Dieses Video zeigt eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen von Zellen, die in einer Umgebung mit konkurrierenden adhäsiven und löslichen Gradienten wandern. Klebebahnen, die fluoreszierendes Strippin und biotinyliertes RGD enthalten, wurden mit Mikrokontaktdruck oder Tauchstift-Lithographie hergestellt.

Einen erfolgreichen Mikrokontaktdruck zeigt sich am Linienprofil der Fluoreszenzintensität über die Spuren, wo Klebespuren und Antifouling-Bereiche deutlich unterschieden werden können. Punkte, die mit der Tauchstift-Lithografie gedruckt werden, erscheinen abgerundet und nicht tränenförmig, was auf einen erfolgreichen Druckprozess hinweist. In diesem Beispiel wurden Punkte in einer Linie gedruckt, wobei der Zeilen- und Spaltenabstand auf 10 bis 15 Mikrometer eingestellt war.

Dieser Abstand reicht aus, um ein Ineinandergehen der Punkte zu verhindern, ermöglicht aber die Betrachtung mehrerer Punkte in einem einzigen Sichtfeld. Bei den meisten Mikroskopeinstellungen wurde mit dem einfachen Mikrofluidik-Gerät eine Abstufung der Hafthinweise auf der gedruckten Spur erstellt. Durch das Laden von Biotin vier Fluorescein und Biotin RGD in die gegenüberliegenden Seiten einer mikrofluidischen Kammerplatte.

Eine Show zeigt 60 Mosaikbilder, die mit einer Gesamtbildlänge von 3072 Mikrometern aufgenommen wurden. In Panel B wurde die Fluoreszenzintensität über die gesamte Länge des Mosaiks gemessen. Lineare Trendlinien wurden an die Fluoreszenzintensität angepasst, um den RGD-Gradienten im Kanal anzuzeigen.

Nach der Entfernung des Biotins, der Biotin-RGD-Lösung, kann dieselbe Kammer verwendet werden, um einen löslichen Gradienten einzuführen. Bild A zeigt die Fluoreszenzintensität des Fluoresceinfarbstoffs in der Nähe des PBS und der mit Fluorescein gefüllten Reservoire und über den Kanal bei T gleich Null. Panel B zeigt die Fluoreszenzintensität der löslichen Hinweise.

Nach einer 16-stündigen Inkubation deuten die vergleichbaren Ergebnisse darauf hin, dass der Gradient mindestens 16 Stunden lang stabil war. Mit dieser Methode wurde eine Zellmigration in einer mikrofluidischen Kammer mit gegenläufigen Gradienten beobachtet und hier wird ein repräsentativer Film gezeigt. Der adhäsive Gradient wurde mit RGD auf Streptokokken-Avidan-Spuren immobilisiert und der lösliche Gradient betrug null bis 10 %FBS.

Die Bilder wurden alle 15 Minuten für insgesamt 20 Stunden aufgenommen. Der gezeigte Bildübergang beträgt acht Bilder pro Sekunde. Dieser zweite Film zeigt eine einzelne Helikopterzelle, die in Richtung der FBS-Quelle wandert.

Der gezeigte Bildübergang beträgt acht Bilder pro Sekunde. Die blaue Linie, die die Zellbahn darstellt, wurde mit Hilfe einer Zellverfolgungssoftware ermittelt. Diese letzte Grafik zeigt die Zelltrajektorien aus den Bildern im ersten Film.

Zelltrajektorien, die in Richtung einer höheren Konzentration an löslichen FPS migriert sind, sind in den Trajektorien der roten Blutkörperchen dargestellt, die in Richtung höherer Konzentrationen an adhärentem RGD migriert sind, sind in Schwarz dargestellt. Diese Verläufe zeigten, dass mehr Helazellen zur Quelle des Chemolockstoffs wanderten als zu höheren Konzentrationen von adhärentem RGD. Während Sie versuchen, dieses Verfahren zu versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, um die Verdunstung von PBS oder Medien im mikrofluidischen Gerät während der Vorbereitung des Adhäsivgradienten und der Lifestyle-Bildgebung zu vermeiden, verwenden Sie bei Bedarf Klebeband, um alle Einlässe des mikrofluidischen Geräts abzudecken.

Andere Methoden wie Transfektions- und Hybridlösungsmikroskopie können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Biomechanik des Zytoskeletts zu beantworten, das durch Proteine, fokale Adhäsionsproteine und Rezeptoren während der Zellmigration wirkt.