Name: Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Mikro-Partikel-Bildvelozimetrie zur Messung von Blutflussgeschwindigkeitsprofilen in Mikrokanälen. Diese Methode ermöglicht die Ableitung von Scherrate und maximaler Geschwindigkeit für biomedizinische Anwendungen.

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Die Autoren möchten NSERC (Natural Sciences and Engineering Council of Canada) für die Finanzierung, Catherine Pagiatikis danken für ihre Hilfe bei der ersten Läufe, Sura Abu-Mallouh und Frederick Fahim zum Testen des Protokoll, Richard von Prevost LaVision, Inc für die technische Unterstützung, und Guy Cloutier der Universität Montréal für das Darlehen des Dalsa High-Speed-Kamera.

1. Microchip Fabrication Der erste Schritt besteht darin, zu erstellen oder kaufen Sie Ihre Mikrokanalstruktur. Es gibt viele Optionen für die Mikrochip-Material. Eines der am häufigsten gewählten Materialien Poly (dimethylsiloxan) (PDMS). Es gibt viele Publikationen über Richtungen für PDMS Herstellung durch Softlithographie 16,17,18. Sobald das PDMS Kanal hergestellt ist, gibt es mehrere Oberflächenbehandlungen seiner natürlichen Hydrophobie umzukehren. Oxygenierte Plasmabehandlung ist eine weit verbreitete Möglichkeit. Zhou, Ellis und Voelcker (2009) geben einen Überblick über Oberflächenbehandlungen und wie sie Einfluss auf PDMS. Diese Ergebnisse sind für Wasser aber, und Blut hat unterschiedliche Eigenschaften. Eine Studie über, was das bedeutet, Oberflächenbehandlung für Blut wurde von Pitts et al. (2012a) getan worden. Für die hier vorgestellten Ergebnisse, Mikrochip Oberflächen und die Glasplatten waren siegebunden wurden sowohl Sauerstoff-Plasma für 45 Sekunden belichtet und dann fest zusammen, was zu einer dauerhaften Bindung gedrückt. 2. Blut Vorbereitung <ol><li> Sammeln von Blutproben von einer akkreditierten Einrichtung. Zum Beispiel Schweineblut mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Antikoagulanz verwendet werden. 1 g EDTA mit 4 ml Wasser, und fügen Sie dann die Lösung auf 1 l Vollblut, vorsichtiges Mischen 10x. </li></ol> Beim Abholen Blutproben, damit sie langsam auf RT. Blutproben sollten frisch und idealerweise nutzten den Tag, sie gesammelt, um die rheologischen Eigenschaften des Blutes zu erhalten sind. Die Proben können gekühlt werden einmal bei RT, jedoch Vollblut ohne gerinnungshemmende unbrauchbar wird nach Kühlung. Abhängig von der Antikoagulans kann RBCs gekühlt aufbewahrt für bis zu 42 Tage, und Vollblut gekühlt gehalten für 35 Tage, aber Kontamination wäre in einem nicht-m möglichedizinische Anlage 21. Außerdem darauf achten, der Erhebungsmethode mit Rindern oder Schweinen Proben, und keine Verunreinigungen durch Knochenmark. <ol start="2"><li> Zentrifuge die Blutproben 3x bei 3.000 UpM für je 10 min. Nach der ersten Zentrifugation, entfernen Sie das Plasma und Buffy-Coat, verwerfen. Es ist in der Regel am einfachsten, das Plasma zunächst entfernen und dann verwerfen oder für künftige Verwendung aufbewahren, dann die Buffy-Coat allein zu entfernen. </li></ol> Führen Sie die Pipette langsam, um so nicht mischen Leukozytenmanschette zurück ins Blut. Nach dem Entfernen des Buffy-Coat, fügen Sie etwa 20 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und vorsichtig mischen, zentrifugieren. Wiederholen letzten Schritt. Nach der dritten Zentrifugation, entfernen Sie die restlichen PBS und Buffy-Coat, verwerfen. Es ist auch möglich, die nativen Plasma anstelle von PBS zu verwenden, wenn Sie die Aggregation des Blutes behalten möchten. Achten Sie darauf, sich nicht zu vermischen keine Buffy-Coat oder weißBlutzellen in das Plasma. <ol start="3"><li> Nehmen gereinigt roten Blutkörperchen (Erythrozyten) und setzt in PBS oder Plasma bei gewünschten Konzentrationen (Hämatokrit). Überprüfen Sie mit einem Hämatokrit Mikrozentrifuge (CritSpin FisherSci, USA). </li></ol> Blut bei 10 bis 20% Hämatokrit sollten leichter sichtbar als 40 oder 50% (physiologischen Hämatokrit). In der Mikrozirkulation, das Blut ist in der Regel die Hälfte der Hämatokrit des Makro-Kreislauf, so H = 20 15 ist ausreichend. <ol start="4"><li> In fluoreszierender Tracer-Partikel in der gewünschten Konzentration in den Blutproben. Eine allgemeine Regel ist zu 10 Teilchen in einer Korrelation Fenster, die vor der Zeit berechnet werden kann. </li></ol> Beispielsweise werden 30 ul Teilchen zu 1 ml Blut Lösung für die Set-up in dem Video dargestellt worden. Alternativ können die RBCs selbst fluoreszierend markiert werden. <ol start="5"><li> Darüber hinaus stellen Sie eine Kalibrierung mit Wasser und Grippeorescing Teilchen. Es wird notwendig sein, das System mit einer Newtonschen Lösung kalibrieren. </li></ol> Wenn zum Beispiel unter Verwendung eines 10X-Objektiv mit einem Kanal in der Größenordnung von 100 um eine geeignete Konzentration 300 ul Teilchen mit 15 ml destilliertem Wasser gemischt. Eine weitere Möglichkeit ist Glycerin mit destilliertem Wasser auf eine Viskosität von 3Cp, die näher an der Makro Blut Viskosität verdünnt verwenden. 3. μPIV Messungen <ol><li> Lasersicherheit: Prüfen Sie die Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Tragen Sie geeignete Laser-Schutzbrille. Schließen Sie die Laser-Vorhang oder schalten Sie den Laser-Schild an der Tür Labor auf den Menschen nicht davor geschützt ausgesetzt zu verhindern. </li><li> Verfahren mit Davis-Software ist in dem Video zu sehen. Nähere Informationen finden Sie in der Bedienungsanleitung eines bestimmten Systems. </li><li> Vor der Einnahme von Daten, muss die Kamera Skala kalibriert mit einem Mikrometer werden. </li><li> Um die Einhaltung des Systems zu reduzieren, verwenden Sie den kürzesten Schlauch eind der kleinste starren Spritze möglich, wie in 15 oder 50 ul Hamilton gasdichte Spritze. Um das Auslaufen von Blut oder Lufteinlass in das System zu reduzieren, versiegeln Sie den Schlauch auf die Spritze und auf den Chip. Dies kann mit Leim, PDMS oder Vaseline (darauf achten, daß das Blut verunreinigen) durchgeführt werden. </li></ol> Um die Mikro-Spritze mit Wasser mit Tracer-Partikel geschnürt füllen verwenden Rückfluss Methode, weil das Volumen der Mikro-Spritze ist in der Regel viel kleiner als das Volumen zu füllen. Unsere Rückfluss Verfahren besteht die Mikro-Spritze und der Kanal zusammen füllen über den Ausgang des Kanals unter Verwendung eines sekundären Kunststoffspritze. Dafür zuerst die Mikro-Kolben der Spritze, dann drücken Sie die Flüssigkeit mit der klassischen Kunststoffspritze an dem Ausgang des Kanals, lassen Sie die Flüssigkeit ausfließen der Mikro-Spritze, bis alle Mikrobläschen sind aus dem Mikro-Spritze, Schlauch oder Chip, endlich den Kolben zurück und ziehen Sie die Kunststoff-Spritze. Das Vorhandensein or Fehlen von Mikrobläschen kann mit einem Mikroskop überprüft werden. <ol start="5"><li> Richten Sie die Spritzenpumpe auf horizontale Rohr zu erreichen. Programmieren Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussmenge. </li></ol> Seien Sie sich der möglichen Auswirkungen vergänglich, wie der &quot;Flaschenhals-Effekt&quot;, für starre System oder die Einhaltung des Systems, die die tatsächliche Durchflussmenge ändern. Charakteristische Zeiten eines Systems in Abhängigkeit von den Materialien und Abmessungen des Systems bestimmt werden. (Kapitel 2, S. 77-81, Tabeling, 2005) <ol start="6"><li> Zeigen Mikrochip auf Mikroskoptisches und starten Sie die Pumpe. Verwenden Sie das Wasser mit Partikeln, um das System in der Mitte Geschwindigkeitsprofil kalibrieren und kalibrieren dT (die Zeit zwischen gepulsten Bilder). </li></ol> Die Partikel sollten zwischen 5 und 10 Pixeln zwischen den Rahmen für eine gute Korrelation 11 zu bewegen. Bei der Kalibrierung, vorsichtig sein, um in der Mitte des Kanals zu messen. Der Fokus Flugzeug in der Mitte hat die höchsteGeschwindigkeit 8. Wenn Sie einen runden Kanal, achten Schatteneffekte. Eine Probe wird in Bild 2 dargestellt ist, unter Verwendung eines gepulsten Kamera, während das obere Bild ist der erste Impuls und der unteren Bild ist der zweite Impuls. Es kann in der Figur, dass die hellsten Punkte (fluoreszierende Partikel) die in-Fokus sind zu sehen. <ol start="7"><li> OPTIONAL: Durch die Daten in unterschiedlichen Höhen ein 3D Geschwindigkeitsprofil kann durch Zugabe der verschiedenen Vektoren in einem einzigen Bild rekonstruiert werden. Das Video zeigt eine Routine, die für die Automatisierung des Prozesses entwickelt. </li><li> Bei der Aufnahme von Daten mit dem Blut füllen Spritze mit der gewünschten Menge an Blut in dem gleichen Verfahren wie dem Wasser. Programmieren Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Durchflussmenge und nehmen die gewünschten Daten. Ein Beispiel für RAW-Bilder erhaltene Abbildung 2 dargestellt. Seien Sie vorsichtig mit RBC Sedimentation sowie. Nachfüllen der Spritze jeden Lauf oder jedeandere Sicht verringert sich die Ansiedlung der RBC. </li><li> Nach der Übernahme von Bildern wird Kreuzkorrelation auf die Bildpaare durchgeführt, um Geschwindigkeitsvektorfelder zwischen den Bildern zu erhalten. Es ist wichtig, gute Bilder zu haben, um eine gute Korrelation aufweisen. Vor Korrelation können Pre-Processing durchgeführt, um Hintergrundgeräusche zu entfernen. </li></ol> Kreuzkorrelation zwischen den Fenstern in den benachbarten Bildern, die in Form und Größe, um die Korrelation beeinflussen variiert werden kann getan. Nach Kreuzkorrelation können Bild-Nachbearbeitung getan, um fehlerhafte Vektoren oder Ausreißer zu entfernen. Eine detaillierte Beschreibung der verschiedenen verfügbaren Optionen und deren Genauigkeiten in Pitts et al. (2012b), wo die beste Verarbeitung für Blut gefunden wurde, um die Methode der &quot;Bild überlappen&quot; mit Fenstern in der Länge erweitert werden und ausgerichtet mit dem Strom . Diese Vorgänge können manuell in einem Programm erfolgen wie MATLAB oder innerhalb der Software mit Ihrem System. Die<html> Software ist nicht wichtig, ist die Mathematik hinter den Operationen immer wichtiger und jede Operation kann für die Richtigkeit der Endgeschwindigkeit Profil beeinflussen. Die resultierenden Vektoren können im Raum über den Kanal gemittelt werden, um momentane Geschwindigkeit Profile zu erhalten, und dann gemittelt wieder in der Zeit, eine durchschnittliche, repräsentativ Geschwindigkeitsprofil zu erhalten. Kloosterman et al. (2011) eine Erklärung des Fehlers in μPIV Messungen, bei denen die Schärfentiefe groß ist. Die Diskussionen über die Fehler der Datenverarbeitung präsentiert hier in Pitts et al. (2012b) für die gepulste Messungen und Chayer et al. (2012) für die High-Speed-Messungen gefunden werden. Beispiele Geschwindigkeitsprofile sind in den 3 und 4 dargestellt. Abbildung 3 zeigt eine einzelne Geschwindigkeitsprofil für die Mittellinie einer 10 ul / h Strom von RBC bei H = 10 in einem 140 um breiten Kanal. Zelt &quot;&gt; Diese einzelnen Profils durch Mittelung der korrelierten Vektoren über den Kanal, um ein Geschwindigkeitsprofil zu erzielen, und dann im zeitlichen Mittel um eine repräsentative Messung zu erhalten. In diesem Fall 100 Paare in der Zeit über das Sichtfeld wurden gemittelt. Ein Beispiel für die 3D rekonstruierten Profil für eine Wasser Kalibrierstromleitung in einer 100 um im Quadrat Kanal mit einem programmierten Flussrate von 30 ul / h genommen wird in Abbildung 4 gefunden. In Abbildung 4 sind die Profile bei 1 um-Intervallen gemessen. <ol start="10"><li> OPTIONAL: In der abgebildeten Set-up mit hoher Geschwindigkeit Bilder können zu den gleichen Bedingungen durch Umschalten Kameras (und Datenerfassungssysteme) entnommen werden. Dies kann nützlich sein für die Visualisierung des zellfreien Schicht in den Kanal, und zur Quantifizierung der Aggregation. Die Analyse der Daten ist etwas anders (Chayer et al., 2012). </li></ol> Beispiele von weißem Licht Bilder mit und ohne RBC Aggregation presented in Abbildung 5 bei H = 20. Die Top-Bilder zeigt H = 20 in PBS, die die Fähigkeit des RBC entfernt zu aggregieren, um 1 ul / hr. Das untere Bild ist H = 20 in nativen Plasma bei 0,5 ul / hr. Im unteren Bild ist die Aggregation sichtbar. <ol start="11"><li> Fahren Sie das System in einer sicheren Weise, wenn Messungen abgeschlossen sind. Verwenden Sie die richtigen Laser Sicherheitsverfahren bis Laserleistung Quelle vollständig heruntergefahren ist. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit μPIV für Messungen des Blutflusses an der Skala der Mikrozirkulation können Einblick in eine große Anzahl von relevanten biomedizinischen, mechanischen und chemischen Engineering-Prozesse zu geben. Einige der wichtigsten Faktoren zu berücksichtigen sind die Dichte des RBC selbst, die Aggregation und Verformbarkeit des RBC, Aggregation oder Bewegung der fluoreszierenden Mikropartikeln, und die Ansiedlung der RBC in den Kanälen. Alle diese Faktoren können für wenn die allgemeinen Leitlinien festgelegt oben befolgt wer...

Der menschliche Körper enthält zahlreiche Gefäße mit Durchmessern von weniger als 50 um, dem wichtigsten Ort Austausch zwischen Blut und Gewebe. Die Untersuchung der Durchblutung in diesen Gefäßen stellt eine erhebliche Herausforderung dar, sowohl das Ausmaß der Messungen und die Flüssigkeit von Blut. Diese Messungen, einschließlich der Druckgradient, der Schere an der Wand, und Geschwindigkeitsprofile in Arteriolen und Venolen, sind wichtige Faktoren, die mit physiologischen Reaktionen verknüpft. Es gibt jetzt noch nie dagewesene Möglichkeiten, um diese Herausforderungen zu lösen Messung dank neuer experimenteller Techniken auf Mikroebene, um die Mikrozirkulation zu studieren und lösen dieses Problem multiscale. Mikropartikel-Geschwindigkeitsmessung (μPIV) ein Teilchen-basierte Strömungsvisualisierung Technik, die verwendet werden, um Geschwindigkeitsprofile des Blutflusses in Mikrokanälen über Kreuzkorrelation auszuwerten. μPIV, die zuerst von Santiago et al. entwickelt wurde, hat mit Hämorheologie verwendet wordenStudien seit Sugii et al. im Jahr 2001 verwendet die Technik, um den Blutfluss in 100 um rund 1,2 Glasröhren messen. Verschiedene Ansätze zur μPIV existieren. High-Speed-Kameras können verwendet werden, um die Bewegung von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) zu korrelieren, und gepulste Bilder können verwendet werden, um die Bewegung von Tracer-Partikeln korrelieren. Jede dieser Optionen kann mit einer aufrechten oder umgekehrten Mikroskop eingekoppelt werden, abhängig von der Anwendung. In beiden Fällen ist das Ergebnis ein 2D Geschwindigkeitsprofil. Ein weiterer Ansatz ist, ein konfokales Mikroskop zu verwenden, um 2D-und 3D-Profile zu erreichen. Diese Methode ist, um Blut 3,4,5 angewendet worden. Micro Skala PIV hat mehrere Komplikationen, wenn sie mit Makro PIV verglichen. In Makro PIV können die Daten in einer einzigen Ebene durch Blätter des Lichts beschränkt ist, sondern im Mikromaßstab Volumen Beleuchtung erforderlich ist. Volume Beleuchtung ein größeres Problem für die Abbildung von Mikro Blut fließt, da die roten Blutkörperchen sich im Vergleich groß sind, um die channels und mit den RBCs als Tracer-Partikel führt zu einer Tiefe von Korrelation (DOC), die signifikant verringern kann die Genauigkeit der Kreuzkorrelation Ergebnisse 6.7.8. Nach Wereley et al. (1998) die DOC für eine 40 um groß Kanal mit RBC als Tracer ist 8,8 um, während mit einer 1 um Tracerpartikel die DOC ist 6,7 um. Dieser Unterschied wird noch deutlicher, wenn Kanalwechsel Höhe und Vergrößerung. Zusätzlich sind RBCs opak, und die Erhöhung der Dichte der RBCs in der Strömung bewirkt Bildgebung Schwierigkeiten. Fluoreszierende Tracer-Partikel, die zuerst von Santiago et al. (1998) verwendet werden, haben als ein Werkzeug, um den Einfluss von out-of-focus Partikel verringern befürwortet worden, wenn mit den kleinsten Teilchen möglich. Mit 1 Mikrometer Durchmesser fluoreszierende Mikropartikel gekoppelt mit einem Laser ist ein Ansatz, der die Tiefenschärfe Problem in Mikro Blutfluss Bildgebung 10. Mai verringern. Es gibt mehrere aktuelle Bewertungen des Zustands der μPIV technik, von denen jeder die Bedeutung der μPIV hebt, um den Blutfluss Studien 11,12. Mehrere wichtige Aspekte müssen berücksichtigt werden, wenn μPIV für Blut. Auf der Mikro-Ebene, das Ausmaß der Mikrozirkulation, kann das Blut nicht als eine homogene Flüssigkeit sein, da es eine Suspension von flexiblen roten Blutkörperchen (Erythrozyten), große weiße Blutkörperchen, Blutplättchen und anderen Proteinen in einer Newtonschen Flüssigkeit (Plasma) suspendiert ist . Die Geschwindigkeitsprofile gemessen hier kann verwendet werden, um bestimmte Eigenschaften der Mikro-Blut fließt zu messen. Die wichtigsten Faktoren sind in microhemorheology die Strömungsgeschwindigkeit des Blutes, die Form des Geschwindigkeitsprofils und die Scherspannung an der Wand des Gefäßes. Diese Information hat klinische Implikationen, da der Mikrozirkulation ist die Website für Stoffaustausch in den Körper, und dieser Austausch ist scherabhängige. Es gibt mehrere Studien über aktuelle Bewertung den Stand der Forschung in der Mikrozirkulation sowie 13,14,15. Präsentiert hier ist ein Protokoll für μPIV Messungen der Blut fließt in Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikrokanäle. PDMS-Kanälen wurden in-house nach den Quellen in Abschnitt 1 des Protokolls hergestellt. Schweine wurden Blutproben von einer akkreditierten Schlachthof erhalten und gereinigt nach § 2 des Protokolls. Alle Daten wurden unter Verwendung des LaVision MITAS μPIV System, wie in Abschnitt 3 des Protokolls beschrieben. Das Set-up besteht aus einem Nd: YAG-Laser (New Wave Research, USA) und CCD-Kamera (Bild Intensiv, LaVision) gesteuert durch einen programmierbaren Auslöseeinheit ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Bühne bewegt sich in 3 Achsen gekoppelt ist, und einem Computer, zusätzlich zu einer Hochgeschwindigkeitskamera (Dalsa 1M150, Niederlande) wurde für die Visualisierung der roten Blutkörperchen selbst aufgenommen. Beide Kameras sind mit einem 2-fach Optik-Box (Custom von Zeiss, Deutschland) verbunden. In typischen in vivo Messungen des Blutflusses, ist eine aufrechte Mikroskop zu verfolgen der Erythrozyten diemselves, während in typischen Anwendungen in vitro ein invertiertes Mikroskop wird verwendet, um den Tracer-Partikeln zu verfolgen. In diesem einzigartigen Dual-Set-up ermöglicht die Optik Box beide Tracer abzubildenden mit dem inversen Mikroskop werden. Blut wurde in den Mikrochips über eine hochpräzise Spritzenpumpe (Nexus3000, Chemyx Inc., USA) eingeführt. Ein Diagramm des Systems wird in Abbildung 1, wobei der obere Teil der Figur repräsentiert die 140 um 40 um durch rechteckige Kanäle PDMS hergestellt gezeigt, und der untere Teil stellt das gesamte System einschließlich der beiden Kameras, den Laser, der Spritzenpumpe und das Mikroskop. Aktuelle μPIV Set-ups zur Verfügung, in der Regel mit proprietärer Software umfassen TSI, Dantec Dynamics und LaVision. Standard-Kreuz-Korrelations-Algorithmen können durch zahlreiche Software-Optionen, einschließlich der MATLAB erreicht werden. Die Software ist nicht der Schlüssel, zu verstehen, was die Dialogboxen zu mathematisch wird die Nutzung dienen entsprechenr viel besser. In diesem Protokoll DaVis werden LaVision proprietäre Software oder MATLAB eingesetzt. Das Protokoll ist nicht speziellen Software, aber die Menüoptionen könnte an verschiedenen Orten in verschiedenen Software-Pakete sein.

<table><tbody><tr><td>Poly(dimethylsiloxan) (PDMS), d.h. Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Poshpat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>fluoreszierende Mikropartikel</td><td>Microgenics/FisherSci</td><td>R900</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin (OPTIONAL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6279-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge, i.e. CritSpin</td><td>FisherSci</td><td>22-269-291</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, d.h. 50 &mu; l Gasdichte</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>Kamera, i.e. Imager Intense, Hochgeschwindigkeits-LaVision</td><td>, Dalsa</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, d.h. MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe, d.h. Nexus3000</td><td>Chemyx, Inc.</td><td>Nexus-3000</td><td></td></tr><tr><td>flexible Schläuche, i.e. Tygon</td><td>FisherSci</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>Datenverarbeitungssoftware, i.e. DaVis</td><td>LaVision</td><td>DaVis</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr></tbody></table>

micro-particle image velocimetry für velocity micro profil messungen der blut fließt

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-Particle Image Velocimetry (μPIV) wird verwendet, um gepaart Bilder von Mikro-Partikel im Blut fließt ausgesät visualisieren. Die Bilder sind kreuzkorrelierten eine genaue Geschwindigkeitsprofil geben. Ein Protokoll für μPIV Messungen von Blut fließt in Mikrokanälen dargestellt. Am Umfang der Mikrozirkulation, kann das Blut nicht als eine homogene Flüssigkeit sein, da es eine Suspension von Teilchen in flexible Plasma, einer Newtonschen Flüssigkeit suspendiert ist. Schergeschwindigkeit, maximale Geschwindigkeit, Geschwindigkeit Profilform und Durchflussmenge kann aus diesen Messungen abgeleitet werden. Mehrere wichtige Parameter wie Brennweite, Partikelkonzentration und System-Compliance, präsentiert werden, um eine genaue, nützliche Daten zusammen mit Beispielen und repräsentative Ergebnisse für verschiedene Hämatokrit-und Strömungsverhältnisse zu gewährleisten.

In allen Figuren wird die Strömung nach rechts in RAW-Bildern, und oben in berechneten Geschwindigkeitsprofile links. Ein Beispiel für die Rohdaten mit Blut Hämatokrit H = 10 fließt bei 10 ul / h erhalten, ist in 2 gezeigt. Raw-Daten können ohne Datenverarbeitung zu erreichen Geschwindigkeitsprofile kreuzkorreliert werden. Die Auswirkungen der Vor-und Datenverarbeitung Methoden wird durch Pitts, et al. (2012b) diskutiert. Ein Beispiel für eine resultierende Geschwindigkeit Profile Daten ähnlich...

Micro-Particle Image Velocimetry (μPIV) wird verwendet, um gepaart Bilder von Mikro-Partikel im Blut fließt die kreuzkorrelierten um eine genaue Geschwindigkeitsprofil geben sind ausgesät visualisieren. Schergeschwindigkeit, maximale Geschwindigkeit, Geschwindigkeit Profilform und Strömungsgeschwindigkeit, von denen jede klinische Anwendungen hat, können aus diesen Messungen abgeleitet werden.

Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das Geschwindigkeitsprofil einer Blutlösung in einem Mikrokanal mithilfe der mikropartikularen Bild-LOC-Symmetrie zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst das System mit einer newtonschen Lösung im Mikrokanal kalibriert wird, um den Maßstab festzulegen, das Bild und die Zeitsteuerung anzupassen sowie die Mittenebene des Kanals zu bestimmen. Der zweite Schritt besteht darin, die Blutlösung in die Kanalanordnung einzubringen und sicherzustellen, dass keine Mikroblasen vorhanden sind.Anschließend wird der Blutfluss in den gewünschten Ebenen innerhalb des Kanals mithilfe von Bildpaaren einer gepulsten Kamera oder eines Videos einer Hochgeschwindigkeitskamera abgebildet. Im letzten Schritt erfolgt die Kreuzkorrelation zwischen den Bildpaaren oder der Videosequenz, um das Verschiebungsvektorfeld innerhalb des Kanals zu erhalten. Letztendlich kann das Verschiebungsvektorfeld über den Kanalquerschnitt und den Zeitraum der Messung gemittelt werden, um ein repräsentatives Geschwindigkeitsprofil zu ermitteln.Dieses Profil kann weiter analysiert oder für Berechnungen verwendet werden. Diese Methode kann zentrale Fragen im biomedizinischen Bereich und bei Bioflüssigkeiten beantworten, beispielsweise bezüglich der Form des Geschwindigkeitsprofils und der Schergeschwindigkeit an der Wand von Mikrogefäßen. Im Allgemeinen haben Nutzer, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit den Herausforderungen, die bei der Verwendung biologischer Proben wie Blut auftreten, sowie mit den Komplexitäten, die genaue Messungen erforderlich machen.Der erste Schritt besteht darin, einen Mikrokanal aus Polymethyl-SUBOXAN oder PDMS zu gewinnen. Die Mikrokanäle in diesem Experiment sind etwa 50 Mikrometer tief und 150 Mikrometer breit. Exponieren Sie die fluidberührende Seite des PDMS und des Objektträgers, mit dem es verbunden wird, für 45 Sekunden gegenüber sauerstoffhaltigem Plasma.Drücken Sie sie dann fest zusammen, um eine dauerhafte Bindung zu erzielen. In diesem Experiment wird frisch gesammeltes Porensignatblut verwendet. Zur Herstellung geben Sie 0,5 Gramm EDTA zu zwei Millilitern Wasser hinzu.Anschließend die Lösung zu einem Liter warmen, vorsichtig zehnmal geschüttelten Vollblut hinzufügen und abkühlen lassen, bis die Raumtemperatur erreicht ist, wenn sich das Blut bereits bei Raumtemperatur befindet. Zentrifugieren Sie 50-Milliliter-Blutproben bei 3000 U/min für 10 Minuten. Danach das Plasma mit einer Pipette entfernen.Führen Sie dann langsam eine Pipette ein, um die Büffelschicht zu entfernen, und vermeiden Sie, dass sie sich nach der Entfernung wieder mit dem Blut vermischt. Fügen Sie etwa 20 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS hinzu, mischen Sie vorsichtig und wiederholen Sie die Zentrifugation, die Entfernung von Plasma und Büffelschicht sowie die Zugabe von PBS insgesamt noch zweimal. Entfernen Sie nach der letzten Zentrifugation das PBS zusammen mit der verbleibenden Büffelschicht.Nehmen Sie die gereinigten roten Blutkörperchen und suspendieren Sie sie in PBS oder Plasma in der gewünschten Konzentration. Die vorliegende Probe enthält 10 % rote Blutkörperchen oder einen Hämatokrit von 10. Geben Sie anschließend einteilige fluoreszierende Tracerteilchen in die Blutproben in der gewünschten Konzentration hinzu, etwa 30 Mikroliter pro Milliliter Blut in diesem System.Außerdem bereiten Sie an dieser Stelle eine Kalibrierlösung aus entionisiertem Wasser und den fluoreszierenden Partikeln zu. Die Daten für dieses Experiment werden mithilfe eines Lavis-Laser-Bildgebungssystems mit einer gepulsten Kamera erfasst. Dieses ist mit einem ND-YAG-Laser gekoppelt.Bevor Sie Daten sammeln, treffen Sie alle erforderlichen Sicherheitsvorkehrungen für Arbeiten mit Lasern. Bereiten Sie den Mikrochip vor, indem Sie ihn mit dem Spritzensystem verbinden, wobei hier die kleinste mögliche Spritze, 50 Mikroliter, und die kürzeste Schlauchlänge verwendet werden sollten. Versiegeln Sie den Schlauch an der Verbindung zur Spritze im Chip mit PDMS-Kleber oder Vaseline, um Flüssigkeitsaustritt und Luftaufnahme zu reduzieren.Achten Sie darauf, eine mögliche Kontamination der Flüssigkeit zu vermeiden. Füllen Sie zunächst zur Kalibrierung des Systems die Kalibrierungslösung in die Mikrospritze. Füllen Sie zunächst eine Standardspritze mit der Lösung aus Wasser und fluoreszierenden Partikeln. Entfernen Sie den Kolben aus der Mikrospritze.Verwenden Sie die Standard-Spritze, um die Kalibrierungslösung in den Ausgang des Mikrokanals zu injizieren. Dadurch wird die Flüssigkeit die Mikrospritze füllen und aus ihrem offenen Ende austreten. Setzen Sie die Injektion der Flüssigkeit fort, bis keine Mikroblasen mehr im Schlauch des Mikrochips oder in der Mikrospritze vorhanden sind.Um das Fehlen von Mikroblasen zu überprüfen, setzen Sie den Mikrospritzenkolben wieder ein und untersuchen Sie das System unter dem Mikroskop. Beispiele für Mikroblasen werden hier gezeigt. Wenn keine Mikroblasen im System vorhanden sind, ziehen Sie den Standardspritzenanschluss ab und ersetzen Sie ihn durch einen Spritzenanschluss zur Sammlung des Ausflusses. Befestigen Sie anschließend den Mikrospritzenanschluss mit Kalibrierflüssigkeit an der Spritzenpumpe und richten Sie die Pumpe waagerecht aus.Die Tubing liegt also horizontal. Programmieren Sie die Spritzenpumpe auf die gewünschte Flussrate. Platzieren Sie den Mikrochip auf dem Objekttisch des invertierten Mikroskops.Jetzt kalibrieren Sie das System. Messen Sie zunächst das Geschwindigkeitsprofil in der Kanalmitte. Kalibrieren Sie außerdem die Zeit zwischen den gepulsten Bildern.Die Partikel sollten sich zwischen fünf und 10 Pixeln zwischen den Einzelbildern bewegen. Achten Sie für eine gute Korrelation darauf, in der Kanalmitte zu messen. Nach Abschluss der Kalibrierung entfernen Sie die Mikrospritze, den Kolben und die Ausflussspritze und spülen Sie das System mit reinem Wasser durch.Füllen Sie dann das System mit dem vorbereiteten Blut, indem Sie es mit einer Standard-Spritze in den Ausgang des Mikrokanals injizieren. Fahren Sie fort, bis keine Mikroblasen mehr vorhanden sind, was mikroskopisch überprüft wird. Ersetzen Sie danach den Mikrospritzenkolben.Als Nächstes platzieren Sie die Mikrospritze mit Blut in die Spritzenpumpe und richten Sie sie aus. Halten Sie die Pumpeinstellung konstant. Stellen Sie den Mikrochip auf den Mikroskopständer und starten Sie die Pumpe.Beginnen Sie mit der Datensammlung, um zu verhindern, dass sich rote Blutkörperchen in der Spritze absetzen; füllen Sie sie nach jedem ein bis zwei Durchgängen erneut auf. Sobald alle Daten gesammelt wurden, sehen die Bilder wie hier dargestellt aus. Dies sind Rohdaten, die für eine Konzentration roter Blutkörperchen von 10 % und eine Flussrate von 10 Mikrolitern pro Stunde erhalten wurden.Das obere Bild ist das erste. Das untere Bild wurde ein Hundertstel Sekunde später aufgenommen. Diese Bilder werden vorverarbeitet, um Hintergrundrauschen zu entfernen, nachdem die Vorverarbeitung abgeschlossen ist.Die Kreuzkorrelation zwischen den Bildern wird durchgeführt, um Geschwindigkeitsfelder zu erhalten. Dies ist ein Beispiel für ein Ergebnis des Geschwindigkeitsprofils aus einem System mit 10 % roten Blutkörperchen und einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Stunde. Beachten Sie, dass die vertikale Achse die Geschwindigkeit darstellt.Mithilfe verschiedener Kameras und Datenerfassungssysteme können Hochgeschwindigkeitsaufnahmen erstellt werden. Dies kann nützlich sein, um die zellfreie Schicht im Kanal sichtbar zu machen und die Aggregation zu quantifizieren. Diese Bilder zeigen Proben mit 20 % roten Blutkörperchen im oberen Bild.Die Flussrate beträgt ein Mikroliter pro Stunde, und die Blutzellen sind in PBS suspendiert, wodurch ihre Fähigkeit zur Aggregation aufgehoben wird. Im unteren Bild beträgt die Flussrate 0,5 Mikroliter pro Stunde, und die Blutzellen sind in natives Plasma suspendiert.In diesem Fall ist eine Aggregation sichtbar. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass scharfe, klare Bilder die beste Korrelation zwischen aufeinanderfolgenden Bildpaaren ergeben. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie die Mikropartikel-Bildgeschwindigkeits-Symmetrie auf mikroskopische Blutströmungen angewendet werden kann, trotz der inhärenten Schwierigkeiten, die Blut als Arbeitsflüssigkeit mit sich bringt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Intravitalmikroskopie zur zeitlichen und räumlichen hämodynamischen und entzündliche Ereignisse in der Pia Mikrozirkulation folgen.

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

Ein Echo Teilchenbildanalysator Velocimetry (EPIV)-System in der Lage ist Erfassen zweidimensionale Felder der Geschwindigkeit in optisch opaken Fluide oder durch optisch opaken Geometrien beschrieben und Validierung Messungen in Rohrströmung berichtet.

Echo Particle Image Velocimetry

Ein Verfahren zur Untersuchung von transienten Strömungen in der Nähe Grenzen mit hochauflösenden, High-Speed-Particle Image Velocimetry (PIV) wird hier beschrieben. PIV ist eine non-intrusive Messtechnik auf jede optisch zugänglichen Strömung durch die Optimierung mehrerer Parameter Zwänge wie die Bild-und Aufnahme-Eigenschaften, die Laser-Blatt Eigenschaften und Analyse-Algorithmen.

High-Speed-Particle Image Velocimetry Nahe Surfaces

Intravitalmikroskopie kann bei Tieren verwendet werden, um retinale Gefäßdurchmesser, Blutbahngeschwindigkeiten und den gesamten retinalen Blutfluss sichtbar zu machen und zu messen.

Intravitale Videomikroskopie-Messungen des retinalen Blutflusses bei Mäusen

Das Protokoll beschriebenen Einzelheiten ein experimentelles Verfahren, um rote Blutzellen (RBC) Aggregate unter einer kontrollierten und konstanten Scherrate zu quantifizieren, auf Basis von Bildverarbeitungstechniken. Das Ziel des Protokolls ist es, RBC Aggregatgrößen an den entsprechenden Schergeschwindigkeit kontrolliert mikrofluidischen Umwelt beziehen.

Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen

Diese Studie stellt eine neuartige Technik für die Messung und Analyse von wechselnden Geschwindigkeiten von Blut Mikrozirkulation in einem einzigen Experiment mit einem Laser-Speckle-Kontrast-Imager.

Ein neuer Ansatz zur Bewegung Artefakt zu überwinden, wenn Sie einen Laser-Speckle-Kontrast Imaging-System für wechselnde Geschwindigkeiten von Blut Mikrozirkulation zu verwenden

Eine experimentell zugängliche analoge Methode zur Untersuchung von molekularen hydrodynamischen Vorgänge in dichten Flüssigkeiten wird vorgestellt. Die Technik nutzt Particle Image Velocimetry geschüttelten, hohe Entschädigung Getreide Pfähle und ermöglicht die direkte, makroskopischen Beobachtung von dynamischen Prozessen bekannt und voraussichtlich in stark wechselwirkenden, hohe Dichte Gase und Flüssigkeiten vorhanden sein.

Eine analoge makroskopischen Technik für das Studium molekulare hydrodynamische Prozesse in dichten Gasen und Flüssigkeiten

Die hier beschriebene Technik bietet eine relativ einfache und kostengünstige Methode, um simultane Messung von Teilchen Kinematik und Turbulenz in Strömungen mit niedrigen Partikelkonzentrationen. Die Turbulenzen wird mittels Particle Image Velocimetry (PIV) gemessen, und Partikel Kinematik errechnen sich aus Bildern, die mit einer Hochgeschwindigkeitskamera in überlappenden Sichtfeld.

Gleichzeitige Messung von Turbulenzen und Partikel-Kinematik mit bildgebenden Verfahren

Hier präsentieren wir vereinfachte Methoden für die Herstellung von transparenten neurovaskuläre Phantome und Charakterisierung des Fluss darin. Wir markieren Sie mehrere wichtige Parameter und ihre Beziehung zum Feld Genauigkeit zu demonstrieren.

Mesoskaligen Partikel Image Velocimetry Studien des neurovaskulären fließt In-vitro-

Um den mikrovaskulären Fluss aus Hochgeschwindigkeits-Kapillarflussbildsequenzen zu quantifizieren, haben wir die Software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) entwickelt. Im gesamten Bildfeld und im Laufe der Zeit wertet STAFF Strömungsgeschwindigkeiten aus und generiert eine Sequenz farbcodierter Raumkarten für die Visualisierung und Tabellarische Ausgabe für quantitative Analysen.

Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur

Das vorliegende Protokoll beschreibt PIV-Messungen (Particle Image Velocimetry), die durchgeführt wurden, um den Sinusfluss durch den In-vitro-Aufbau der Transkatheter-Aortenklappe (TAV) zu untersuchen. Die hämodynamischen Parameter basierend auf der Geschwindigkeit werden ebenfalls bestimmt.

Particle Image Velocimetry Untersuchung der Hämodynamik mittels Aortenphantom

Erfahren Sie die Mikro-Partikel-Bildvelozimetrie zur Messung von Blutflussgeschwindigkeitsprofilen in Mikrokanälen. Diese Methode ermöglicht die Ableitung von Scherrate und maximaler Geschwindigkeit für biomedizinische Anwendungen.

Micro-Particle Image Velocimetry für Velocity Micro Profil Messungen der Blut fließt

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