Name: Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Lernen Sie die TED-Methode zur direkten Bildgebung von Calciumdynamiken im endoplasmatischen Retikulum lebender Zellen. Diese Technik ermöglicht Forschern die Untersuchung intrazellulärer Calcium-Signalwege mit hoher räumlicher Auflösung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und dem BL567/3-1 Friedrich-Baur-Stiftung unterstützt. Wir möchten Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories an der University of California, San Diego danken für die Bereitstellung von uns mit Tag-RFP-T2. Wir anerkennen dankbar David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, und Didier Trono, Universität Genf, Genf, für die uns die lentiviralen Plasmide FUGW und psPAX2/pMD2.G.

<ol><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling%3A+dynamics%2C+homeostasis+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+calcium+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Local calcium signaling in neurons.</a> Neuron. 40, 331-346 (2003).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium signaling.</a> Neuron. 21, 13-26 (1998).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73, 862-885 (2012).</li>
<li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59, 861-872 (2008).</li>
<li>Jaepel, J., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+ER+calcium+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing ER calcium dynamics.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).</li>
<li>Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathophysiology+of+the+calcium+store+in+the+endoplasmic+reticulum+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons.</a> Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).</li>
<li>Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+calcium+as+a+primary+regulator+of+endoplasmic+reticulum+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function.</a> Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).</li>
<li>Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Ca2%2B+from+a+nonmitochondrial+intracellular+store+in+pancreatic+acinar+cells+by+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate.</a> Nature. 306, 67-69 (1983).</li>
<li>Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff-regulation+of+phospholipase+C-gamma+1-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzyme+Regulation%22%5BJournal%5D)">On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction.</a> Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channels+as+cellular+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRP channels as cellular sensors.</a> Nature. 426, 517-524 (2003).</li>
<li>Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIMulating+store-operated+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">STIMulating store-operated Ca(2+) entry.</a> Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).</li>
<li>Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+cellular+stress+through+STIM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sensing cellular stress through STIM proteins.</a> Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).</li>
<li>Erdmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+calmodulin+with+Sec61alpha+limits+Ca2%2B+leakage+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum.</a> The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).</li>
<li>Schäuble, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiP-mediated+closing+of+the+Sec61+channel+limits+Ca%282%2B%29+leakage+from+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER.</a> The EMBO Journal. , (2012).</li>
<li>Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+as+an+integrator+of+multiple+dendritic+events%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist+%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%2C+neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).</li>
<li>Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+compartments+serve+multiple+hippocampal+dendritic+spines+from+a+widespread+rather+than+a+local+store+of+recycling+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).</li>
<li>Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+endoplasmic+reticulum+controls+metabotropic+signaling+and+plasticity+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).</li>
<li>Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+network+of+endoplasmic+reticulum+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J. Vis. Exp. (23), e1067(2009).</li>
<li>Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+calcium+imaging+combined+with+siRNA+mediated+gene+silencing+identifies+Ca%282%29%28%2B%29+leak+channels+in+the+ER+membrane+and+their+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms.</a> J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).</li>
<li>Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+forward+to+seeing+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking forward to seeing calcium.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).</li>
<li>Mank, M., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators.</a> Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).</li>
<li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamic+changes+in+free+Ca2%2B+concentration+in+the+endoplasmic+reticulum+of+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells.</a> The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).</li>
<li>Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+environmental+sensitivity+of+yellow+fluorescent+protein.+Mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).</li>
<li>Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+shuttling+between+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+underlying+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations.</a> EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).</li>
<li>Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2-mediated+alterations+in+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+analyzed+with+an+improved+genetically+encoded+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).</li>
<li>Hofer, A. M., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+in+situ+measurement+of+calcium+in+intracellular+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate-sensitive+stores+using+the+fluorescent+indicator+mag-fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).</li>
<li>Solovyova, N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+free+calcium+in+the+neuronal+endoplasmic+reticulum%3A+an+overview+of+modern+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches.</a> Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).</li>
<li>Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+dynamics+in+the+lumen+of+the+endoplasmic+reticulum+in+sensory+neurons%3A+direct+visualization+of+Ca%282%2B%29-induced+Ca%282%2B%29+release+triggered+by+physiological+Ca%282%2B%29+entry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry.</a> The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).</li>
<li>Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-disruptive+strategy+to+target+calcium+indicator+dyes+to+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum.</a> Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).</li>
<li>Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+imaging+of+intracellular+organelles%3A+endoplasmic+reticulum%22">Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum</a>. 43, Humana Press. (2010).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+photostability+of+bright+monomeric+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5, 545-551 (2008).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zufferey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-inactivating+lentivirus+vector+for+safe+and+efficient+in+vivo+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.</a> Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).</li>
<li>Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+dyes+enter+via+a+store-operated+calcium+channel+and+modify+calcium+signaling+of+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).</li>
<li>Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+R+%22Calcium+measurement+methods%22">Calcium measurement methods</a>. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+esterase-ester+pair+for+targeting+small+molecules+with+cellular+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).</li>
<li>Samtleben, S., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+direct+ER+calcium+imaging+with+targeted-estersase+induced+dye+loading%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading.</a> , In preparation (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Vor-und Nachteile des TED Verfahren wurden ausgiebig in den letzten Publikationen 34,35 diskutiert. Im Vergleich zu anderen oben beschriebenen Verfahren umgeht das Problem der TED zu stören und Perfusion der Zellen. Darüber hinaus müssen zwei Aspekte hervorgehoben werden. Das Prinzip der TED für ER Calcium Imaging erfordert (1.) Die gezielte Expression eines aktiven Carboxylesterase in das ER-Lumen mit Hilfe von TED Vektor-Konstrukte und (2.) Die effiziente und bevorzugte Freisetzung von niedriger Affinit...

Um physiologischen Calcium Reaktionen des ER zu beheben, haben wir eine neue Strategie, um das Einfangen von synthetischen Calcium sensitiven Farbstoffen in die Notaufnahme zu verbessern. Das Verfahren ermöglicht die direkte, nicht-störende Echtzeit-Überwachung des freien ER Calcium in Gegenwart von extrazellulärem Calcium. Funktion und Signalisierung von ER Calcium Calcium-Signale werden in verschiedenen Zelltypen, zB Muskelzellen, Neuronen und Gliazellen und ihre Funktionen reichen von der Vermittlung Muskelkontraktion zu einer Beteiligung an der synaptischen Übertragung in Lernen und Gedächtnis 1,2 gefunden. Änderungen im freien Calcium-Konzentration sind von hohem wissenschaftlichen Interesse, da Calcium in der Regulation der Gen-Transkription, Proliferation, neuronale Erregbarkeit, Zelltod und anderen Zelle Signalwege 1-7 beteiligt ist. All diese zellulären Calcium-Signale sind funktional verbunden sind und dazu beitragen, Calcium intrazellulärestore Dynamik 8-10. Ein gemeinsames Merkmal aller Calcium-Signale ist der Fluss von Kalzium zwischen dem extrazellulären Raum, die Cytosol und Organellen, vor allem die ER und Mitochondrien. Dies bewirkt dynamische Änderungen der Calciumkonzentration innerhalb dieser Organellen, die von verschiedenen Signalkomponenten erfasst werden. Im Allgemeinen ist die Calcium-Konzentration in der ER zwischen 100 bis 800 um, in das Cytosol der Calcium-Konzentration in der Nähe von 100 nm und in den extrazellulären Raum die Konzentration etwa 1-2 mM. Dementsprechend gibt es eine hohe chemische Antriebskraft für Calcium Strömung zum Cytosol 2,9,10. Die am häufigsten untersuchten ER abgeleiteten Calcium Signale abhängig von der Stimulation der G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), die dann aktiviert Phospholipase C (PLC). PLC erzeugt wiederum Inositol 1,4,5-triphosphat (IP 3) 1. Bei der Bindung von IP 3 seiner receptor (IP 3-Rec, Abbildung 1) in der ER-Membran, werden Kalzium-Ionen aus dem ER-Lumen freigesetzt. Historisch gesehen, war IP 3-vermittelte Calcium-Freisetzung aus dem ER ersten - obwohl indirekt - gemessen in acinar Zellen der Bauchspeicheldrüse durch Streb et al 1983 11.. Diese Veröffentlichung vorgeschlagen erstmals eine Signalkaskade mit Acetylcholin, Phospholipase C und IP 3. Diese Art der Calcium-Freisetzung wird allgemein als IP 3-induzierten Calcium-Freisetzung (IICR) (Abbildung 1). Kinase-abhängige Aktivierung von Phospholipase C &amp;ggr; durch Rezeptor-Tyrosinkinasen Verbindungen die Wirkung von Wachstumsfaktoren und neurotrophe Faktoren ER Calciumsignaltransduktion nach IP 3 Erhebung 12. Neben IICR kann Calciumerhöhung durch ionotropen Calcium Eintrag vermittelt werden, zum Beispiel über spannungsabhängigen Calcium-Kanäle (Ca V) und anschließender Calcium-induzierten Calcium-Freisetzung (IKRK) von ryanodine reRezeptoren (RyR). IICR und CICR sind physiologisch Calcium-Shop-Eintrag (SOCE) verknüpft. SOCE umfasst die Wirkung von STIM (Stroma interagierende Molekül), die ein Sensor für ER Calcium-Freisetzung ist. STIM hat sich gezeigt, extrazellulären Calcium Eintrag durch transient receptor potential-Kanäle (Trp) 13, Orai Kalziumkanäle 14 und sogar spannungsabhängigen Calcium-Kanäle 15 (Abbildung 1) zu stimulieren. Loss of ER Calcium wird dynamisch durch die Wirkung der sarco-endoplasmatischen Retikulum Calcium ATPase (SERCA), die aktiv Pumpen Calcium in die ER gerettet. Das Blockieren der SERCA mit Medikamenten wie thapsigargin enthüllt einen kontinuierlichen Verlust von Kalzium ER zum Zytosol. Das ER Calcium &quot;Leck&quot; wird durch ER intramembrane Porenkomplexe wie Sec61 Protein-Komplex 16,17 (Abbildung 1) verursacht. In 1998 veröffentlichte Berridge ein Modell, das &quot;Neuron innerhalb eines Neurons model&quot;, which schlägt ein Prinzip physiologische Rolle des ER bei der Integration von neuronalen Calcium-5. Dieses Modell berücksichtigt die Existenz eines kontinuierlichen ER-Membran-System bildet eine intrazelluläre &quot;Bild&quot; des neuronalen Plasmamembran 5. Diese binäre eukaryotischen Membran-System wurde behauptet, eine Grundvoraussetzung für zeitliche und räumliche Integration von schnellen und langsamen Calcium-Signale in Neuronen. Calcium-Signale auftreten, die entweder gleichzeitig oder anschließend in verschiedenen Stacheln oder Dendriten des gleichen Neurons zu der Zelle soma oder Kern über das ER, wo sie bis 5,18 summiert verliehen. Dann kann ihre Summe haben Auswirkungen auf die Erregbarkeit des Neurons, die Regulierung der Gen-Transkription oder Integration von Signalkaskaden. Somit unterstützt die ER die Integration von Calcium-Signale. Eine Voraussetzung für dieses Konzept ist die Kontinuität des ER in einer einzigen Zelle, die durch mehrere Studien in Anspruch genommen wurde und das hat zumindest für somato-d erwiesenendritic Bereichen und kurze Strecke axonalen Projektionen 19-21. Ob es ER Kontinuität innerhalb langen axonalen Projektionen ist eine Angelegenheit der Debatte. Strategien, um den Fluss der freien Calcium über die ER-Membran zu messen Calcium-Signale werden am häufigsten in das Cytosol 22,23 überwacht. Es kann daher nicht leicht zu unterscheiden, ob Ca2 + in das Cytosol von extrazellulären oder intrazellulären Speichern 6,24 fließenden werden. Um diese Beschränkung zu überwinden, wurden methodische Strategien zur direkten ER Calcium Imaging entwickelt. Zusammenfassend sind die folgenden Strategien: (1) ER-Protein gezielt gentechnisch-Indikatoren 25-27 Protein-basierten Low-Affinität Ca 2 +-Indikatoren verwenden die Biolumineszenz Protein GFP Äquorin oder in Kombination mit einem Calcium-sensitiven Proteins.. Diese gentechnisch veränderten Ca 2 +-Indikatoren (GeCIS) kannder ER mit Hilfe eines Signalpeptids ausgerichtet sein und sich aktiv an der ER mit einem Aufbewahren und Abrufen Motiv gehalten. Gemeinsame ER Ca 2 +-Indikatoren basieren auf der Cameleon-Prinzip und sind die Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon Split YC7.3ER 29 und 30 Cameleon D1. (2) Direkter Esterase-basierte Farbstoff Laden von AM-Ester niedriger Affinität Ca 2 + Indikatoren 31,32. AM-Derivate der Indikatorfarbstoffe (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM oder Fluo5N-AM) gehen die biologischen Membranen in einem lipophilen, Calcium-und Kleinschreibung Zustand. Dann wird in das Cytosol und im ER freizugeben endogene Esterasen gespalten des AM-Estergruppe und die Ca 2 +-Indikator, hinterlässt eine bestimmte Menge des aktiven Farbstoff im Cytosol und im ER. Daher ist dieser Ansatz unter den Bedingungen einer hohen Calcium-Konzentration in der ER nützlich, solange der cytosolischen Calciumkonzentration bleibt weit unter dem deNachweisgrenze der niedriger Affinität Indikatoren, insbesondere während der charakteristischen Calcium-Signale (zB nM bis niedrig uM). (3) AM-Ester Belastung in Kombination mit Plasmamembran Permeabilisierung 32. Ein verbleibender zytosolischen Ca 2 +-Indikator durch Plasmamembran Permeabilisierung mit geringen Mengen eines &quot;mild&quot; Reinigungsmittel (z. B. Saponin) in einem künstlichen intrazelluläre Puffer entfernt. Somit können die intrazellulären Membranen angeregt werden, zB mit IP 3 in der intrazellulären Puffer direkt durch &quot;Poren&quot; in der Plasmamembran. (4) Dialyse des Cytosol unter Whole-Cell-Konfiguration und gleichzeitige Messungen von Ca 2 + in das ER-Lumen und das Cytosol 32,33. Zelle zuerst mit einer niedrigen Affinität Ca 2 +-Indikator (zB Mag-Fura2 geladen AM, ratiometrischen, UV-Licht). Danach mit Hilfe eines Patch-Pipette, verbleibende cytosolic niedriger Affinität Ca 2 +-Indikator aus dem Cytosol mit einem Puffer, der eine hohe Affinität Ca 2 +-Indikator (zB Fluo-3, sichtbares Licht) dialysiert. Diese Strategie ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von zytosolischen und ER abgeleiteten Signale. (5) Gezielte-Esterase-induzierte Farbstoffbeladung 8,34. A Carboxylesterase (CES) mit dem Lumen des ER gezielte und bietet eine hohe Esterase-Aktivität für eine effiziente Abfangen des AM-Ester Form niedriger Affinität Ca 2 +-Indikatoren. Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED) Zur Verbesserung der Ausrichtung der niedriger Affinität Ca 2 + Indikatoren zur ER-Lumen, wurde TED entwickelt. TED erfordert die Überexpression eines ER gezielte Maus Carboxylesterase (CES2) (Abbildung 2), die über Expressionskonstrukte erreicht wird. Zellen, die ein rekombinantes CES-Konstrukt mit dem AM-Ester Form eines Calcium inkubiertIndikator-Farbstoff (Fluo5N-AM, Abbildung 2). Dann wird in dem ER wird der Farbstoff auf die Ca 2 + umgewandeltes empfindlich, undurchlässigen Membran Ca 2 +-Indikator-Komplex (Fluo5N/Ca 2 +) durch die hohe Esterase daher Einfangen der Farbstoff in einer hohen Konzentration in der ER-Lumen 8 , 34. Die Methode ist besonders nützlich, um ER Calcium-Freisetzung über die IICR-Bahnen zum Beispiel untersuchen, über metabotropic, purinergen-oder Glutamat-Rezeptoren 8,34 und ER Calciumentzug visualisieren über &quot;Leck-Kanäle&quot; direkt, zum Beispiel nach Blockade der SERCA 17 , 34. Um unsere Erfahrungen die Low-Affinität Ca 2 +-Indikator Fluo5N-AM ist derzeit die beste verfügbare Indikator mit dem TED Farbstoffbeladung Strategie zu verwenden. Fluo5N-AM hat eine geringe Affinität für Ca 2 + (Dissoziationskonstante K D ~ 90 pM, Abbildung 2), ist fast nicht fluoreszierenden in seine AM-Form, sondern bietet eine hohe Fluoreszenzemission auf Calcium Bindung 8,34. Die Fluo5N/Ca 2 +-Komplex mit einer Standard-Lichtquelle von ~ 490 nm, die über die normalen Farbstoffen wie FITC, Alexa 488 oder eGFP entspricht angeregt werden. Cytosolic Calcium-Signale kaum erreichen eine Konzentration in den niedrigen pM-Bereich und werden daher kaum von Fluo5N im Cytosol 35 erkannt. Um die TED Leistung zu verbessern, wurden mehrere rekombinanten Vektor-Konstrukte entwickelt (Abbildung 3). Ursprünglich ist TED Vektoren auf der kodierenden Sequenz des CES2 (Refseq Zugangsnummer NM_145603, CES2c) und am besten TED Leistung bezogen mit stabilen Expression CES Konstrukte beobachtet. New TED Vektoren exprimieren ein Kernelement CES2 fusioniert mit dem roten fluoreszierenden Proteins TagRFP-T2 36. Diese Vektoren haben den Vorteil, dass sie verwendet werden, um zu identifizieren transduzierten Zellen und die rote Fluoreszenz als interne Kontrolle für die Normalisierung der Veränderungen in Fluo5N/Ca 2 verwenden werden + Fluoreszenz. Die rote Fluoreszenz bietet auch die Möglichkeit, die strukturellen Verteilung der ER und ER Änderungen in Dynamik unter Stimulationsbedingungen visualisieren.

<table><tbody><tr><td>(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycin)</td><td>Tocris</td><td>0805</td><td></td></tr><tr><td>5';-ATP-Na2, ATP Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma</td><td>A26209-1G</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung,50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Carbamoylcholinchlorid (Charbachol)</td><td>Sigma</td><td>C4382-1g</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopiazonsäure (CPA)</td><td>Aufstieg wissenschaftlich</td><td>Asc-300</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit Glutamax</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS ohne Ca/Mg 1x</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>F14204</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F12 Nährstoffmischung</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank's BSS(1x) ohne Ca, ohne Mg, mit Phenolrot, HBSS</td><td>PAA Laboratories</td><td>H15-010</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>SHD3250YK</td><td>Linearis</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin Ca2+ Salz</td><td>Ascent scientific</td><td>Asc-116</td><td></td></tr><tr><td>murine EGF </td><td>PreproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Invitrogen-Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127, geringe UV-Absorption, 2g</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td>Poly-DL-Ornithinhydrobromid PORN</td><td>Sigma</td><td>P8638</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysinhydrobromid</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Calbiochem</td><td>586005-1mg</td><td></td></tr><tr><td>TryLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS-003707</td><td></td></tr><tr><td>Trypsininhibitor aus Glycin MAX (Sojabohne)</td><td>Sigma</td><td>T6522<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Konfokales System: inverses Laser-Scanning-Mikroskop: FV1000 mit IX81</td><td>Olympus</td><td></td><td>anwenderspezifische Konfiguration</td></tr><tr><td>Konfokales System: Laserkombinierer FV10 und Diodenlaser (405, 473, 559, 635)</td><td>Olympus</td><td></td><td>benutzerspezifische Konfiguration</td></tr><tr><td>Konfokales System: Scankopf FV10-SPD mit Spektraldetektor</td><td>Olympus</td><td></td><td>benutzerspezifische Konfiguration</td></tr><tr><td>Heizregler TC-344B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0101</td><td>zur Steuerung der In-Line-Lösungsheizung</td></tr><tr><td>NIH ImageJ Software</td><td>WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>, 1997--2006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ziel: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35</td><td>Olympus</td><td>N2709100</td><td></td></tr><tr><td>Ziel: UPLFLN40XO</td><td>Olympus</td><td>N1478700</td><td></td></tr><tr><td>Ziel: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15</td><td>Olympus</td><td>N1480700</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionskammer, inverse</td><td>Perfusionskammer</td><td></td><td></td>nach Maß</tr><tr><td>, RC-49FS</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-1709</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionssonde: PT-49</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1730</td><td>für Perfusion</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe MiniPlus 3 (4 Kanäle)</td><td>Gilson</td><td>n.a.Perfusionspumpe</td><td></td></tr> <tr><td>Einzel-Inline-Lösungserhitzer SH-27B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>gesteuert über Heizungsregler</td></tr><tr><td>Saugrohre: ST3R</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1407</td><td>für Perfusion</td></tr><tr><td>Heizeinsatz: Tempocontrol 37-2 digital 2-Kanal</td><td>Pecon</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

direct imaging von calcium er mit targeted-esterase induzierte dye loading (ted)

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualisierung Kalziumdynamik ist wichtig, die Rolle von Calcium in der Zellphysiologie zu verstehen. Um Kalzium Dynamik zu untersuchen, wurden synthetische fluoreszierenden Ca 2 + Indikatoren populär geworden. Hier zeigen wir, TED (= gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Laden), eine Methode, um die Freisetzung von Ca 2 + zu verbessern Indikatorfarbstoffe in das ER-Lumen verschiedener Zelltypen. Bisher wurde in TED-Zelllinien, Gliazellen und Neuronen in vitro verwendet. TED basiert auf effizienten, rekombinanten Targeting von einer hohen Aktivität Carboxylesterase dem ER-Lumen mit Vektor-Konstrukte, die ausdrückliche Carboxylesterasen (CES). Die neuesten TED Vektoren enthalten ein Kernelement CES2 fusioniert an ein rot fluoreszierendes Protein, wodurch gleichzeitige zweifarbige Bildgebung. Die Dynamik des freien Calcium in der ER sind in einer Farbe abgebildet, während die entsprechende ER Struktur erscheint in rot. Zu Beginn des Verfahrens werden die Zellen mit einem Lentivirus transduziert. Anschließend werden die infizierten Zellen einere auf Deckgläsern ausgesät, um endlich ermöglichen Live Cell Imaging. Dann lebenden Zellen werden mit dem Acetoxymethylester (AM-Ester) Form niedriger Affinität Ca 2 + inkubiert Indikatoren, zum Beispiel Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, oder Mag-Fura2-AM. Die Esterase-Aktivität im ER spaltet hydrophoben Seitenketten vom AM Form des Ca 2 +-Indikator und einem hydrophilen fluoreszierenden Farbstoff / Ca 2 +-Komplex gebildet wird, und eingeschlossen in das ER-Lumen. Nach Farbstoffbeladung, werden die Zellen mit einem invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop analysiert. Die Zellen werden kontinuierlich mit Ringer-ähnliche Lösungen perfundiert und die ER Calcium Dynamik direkt visualisiert Zeitraffer-Bildgebung. Calcium-Freisetzung aus dem ER wird durch eine Abnahme der Fluoreszenz-Intensität in Regionen von Interesse identifiziert, während das Nachfüllen der ER Calcium Speicher erzeugt eine Zunahme der Fluoreszenzintensität. Schließlich wird die Änderung in der Fluoreszenzintensität über die Zeit durch Berechnung der AF / F 0 bestimmt.

Dieses Protokoll stellt eine unterbrechungsfreie Ansatz für die direkte Bildgebung der freien ER Calcium. Low-Affinität synthetischen Ca 2 + Indikatoren gelöst und eingeschlossen in das ER-Lumen mit Hilfe eines ER gezielt rekombinanten Esterase Enzymaktivität. Verbesserte Belastung der Ca 2 +-Indikator Farbstoffe zum ER-Lumen ermöglicht eine direkte und schnelle Darstellung von ER Kalzium-Speicher der Dynamik. Zelltypen für TED Die Durchführbar...

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED) unterstützt die Analyse der intrazellulären Kalzium-Speicher der Dynamik von Fluoreszenz-Bildgebung. Das Verfahren stützt sich auf Targeting eines rekombinanten Carboxylesterase zum Endoplasmatischen Retikulum (ER), wo es verbessert die lokale Entlarvung von synthetischen niedriger Affinität Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indikatorfarbstoffe in das ER-Lumen.

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Kalziumdynamiken direkt im Lumen des endoplasmatischen Retikulums lebender Zellen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem die Zellen mit dem gezielten Esterase-induzierten Farbstoff oder TED-Vektor-Konstrukt transduziert werden, um die Carboxylesterase CS2 im endoplasmatischen Retikulum zu überexprimieren. Anschließend werden die Zellen mit dem Acetoxymethylester-Kalziumindikator Fluo-5N AM inkubiert, der durch die Plasmamembran und die ER-Membran diffundiert. Dann spaltet die Carboxylesterase die Estergruppe ab und setzt den kalziumempfindlichen Indikator im ER-Lumen frei. Es bilden sich fluoreszierende Kalziumkomplexe.Es werden Ergebnisse erhalten, die Veränderungen der freien Kalziumkonzentration im ER auf der Grundlage von Live-Cell-Imaging zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Regulation der zellulären Kalziumhomöostase zu beantworten. Kalziumsignale werden am häufigsten im Cytosol überwacht, weshalb nicht leicht zu unterscheiden ist, ob das Kalzium aus dem extrazellulären Raum oder aus dem intrazellulären ER-Kalziumspeicher in das Cytosol gelangt.Um diese Einschränkung zu überwinden, haben

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das endoplasmatische Retikulum spielt eine wichtige Rolle in Protein Biogenese und in Calcium-Homöostase. Wir haben ein experimentelles System, das uns auf die Rolle der Ca2 +-Kanäle Leck-Adresse und ihrer vermeintlichen Regulationsmechanismen charakterisieren lässt etabliert. Dieses System beinhaltet siRNA-vermittelten Gen-Silencing-und Live-Cell-Ca2 +-Imaging.

Live Cell Imaging mit Calcium siRNA vermittelte Gene Silencing Combined Identifiziert Ca 2 + Leck-Kanäle in der ER-Membran und deren Regulationsmechanismen

Das Ziel dieses Artikels ist es, ein Verfahren zu demonstrieren Immunfluoreszenz Detektion von Östrogen-Rezeptor-α (ERa) in Ratten Pia arteriellen Scheiben mit einem digitalen Immunfluoreszenz-Mikroskop zu optimieren.

Imaging von Estrogen Receptor-α in Rat Pial Arteriolen mit einem Digital-Immunfluoreszenz-Mikroskop

Spontane Aktivitäten zu entwickeln neuronalen Netzen kann mit Hilfe AM-Ester Formen von Calcium-sensitiven Indikator Farbstoffe werden. Änderungen der intrazellulären Calcium, was darauf hinweist neuronale Aktivierung, werden als vorübergehende Veränderungen in Indikator Fluoreszenz mit ein-oder Zwei-Photonen-Imaging nachgewiesen werden. Dieses Protokoll kann für eine Reihe von entwicklungs-abhängige neuronale Netze angepasst...

Functional Calcium Imaging in Entwicklungsländern Kortikale Netzwerke

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Hier präsentieren wir Techniken zur Abbildung lokaler IP3-vermittelter Ca2+-Ereignisse mittels Fluoreszenzmikroskopie in intakten Säugetierzellen, die mit Ca2+-Indikatoren beladen sind, zusammen mit einem Algorithmus, der die Identifizierung und Analyse dieser Ereignisse automatisiert.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Die Kalziumhomöostase des endoplasmatischen Retikulums ist bei verschiedenen Pathologien gestört.  Ein sezernierter ER-Calcium-Monitoring-Protein-Reporter (SERCaMP) kann verwendet werden, um Störungen im ER-Kalziumspeicher zu erkennen.   Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Gaussia-Luciferase-SERCaMP zur Untersuchung der ER-Calciumhomöostase in vitro und in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

Wir präsentieren Protokolle für die Anwendung unseres gezielten genetisch codierten Calciumindikators (GECI) CatchER + zur Überwachung von schnellen Calcium-Transienten im endoplasmatischen / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) von HEK293 und Skelettmuskel-C2C12-Zellen mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Ein Protokoll für die in situ K d Messung und Kalibrierung wird ebenfalls diskutiert.

Monitoring ER / SR Calcium Release mit dem gezielten Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensor Catcher<sup&gt; +</sup

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Dieses Protokoll enthält Schritte zur Erfassung und Analyse fluoreszierender Kalziumbilder von Gehirnummantelungsperizyten und Blutflussdaten aus nahe gelegenen Blutgefäßen bei anästhesierten Mäusen. Diese Techniken sind nützlich für Studien der Wandzellphysiologie und können angepasst werden, um Kalziumtransienten in jedem Zelltyp zu untersuchen.

Gehirn Perizyten-Kalzium und hämodynamische Bildgebung bei transgenen Mäusen in Vivo

Das vorliegende Protokoll beschreibt die rein optische Kontrolle und Beobachtung der ausgelösten zellulären Aktivität in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten (iPSC-CMs) für Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und Toxizitätstests. Multiparametrische Quantifizierung phänotypischer Muster in Zeit und Raum werden gezeigt. Langzeitwirkungen von Medikamenten über Stunden oder sequentielle Messungen über Tage werden nachgewiesen.

Optische Hochdurchsatzkontrolle und Aufzeichnung des Kalziumsignals in iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für Toxizitätstests und phänotypisches Arzneimittelscreening

Lernen Sie die TED-Methode zur direkten Bildgebung von Calciumdynamiken im endoplasmatischen Retikulum lebender Zellen. Diese Technik ermöglicht Forschern die Untersuchung intrazellulärer Calcium-Signalwege mit hoher räumlicher Auflösung.

Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

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