Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Dynamik des Kalziums direkt im Lumen des endoplasmatischen Retikulums lebender Zellen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem die Zellen mit dem gezielten Esterase-induzierten Farbstoff oder TED-Vektorkonstrukt transduziert werden, um die Carbox-Esterase CS zwei im endoplasmatischen Retikulum zu überexprimieren. Als nächstes werden die Zellen mit dem Acetomethylester-Kalziumindikator Flu Oh Five NA inkubiert, der durch die Plasma- und ER-Membranen diffundiert.

Dann spaltet sich die Carboxylesterase ab. Die Estergruppe setzt den Calciumsensitivitätsindikator im er frei. Es bilden sich Lumen- und fluoreszierende Kalziumkomplexe.

Es werden Ergebnisse erhalten, die Veränderungen der Konzentration von freiem Kalzium im ER auf der Grundlage von Lebendzell-Bildgebung zeigen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Regulation der zellulären Kalziumhomöostase zu beantworten. Calciumsignale werden am häufigsten im Cytosol überwacht, daher kann nicht leicht unterschieden werden, wo das Calcium aus dem extrazellulären Raum oder aus dem intrazellulären ER-Calciumspeicher in das Cytosol fließt.

Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir ein gezieltes Esterase-induziertes Herunterladen entwickelt. Bei dieser Methode wird das aus dem ER freigesetzte Kalzium direkt überwacht. Der Ansatz ist unterbrechungsfrei.

Die Plasmamembran bleibt intakt und intrazelluläre Signalkaskaden bleiben erhalten. Im Allgemeinen werden Einzelpersonen mit ihrer Methode Schwierigkeiten haben, weil sie Erfahrung benötigen. Bei der TED-Vektorexpression haben wir Vektorkonstrukte entwickelt, die ein Cent-Protein exprimieren, das mit der Carboxylase CES zwei fusioniert ist.

Dies ermöglicht es uns, während der Experimente leicht Zellen zu identifizieren, die für die AR-Kalziumbildgebung geeignet sind, wobei es sich um Zellen handelt, die durch starke rote Fluoreszenz und nur mäßige bis starke Kalziumindikatorfluoreszenz gekennzeichnet sind. Diese fluoreszierenden Markierungen sollten gleichmäßig über das endoplasmatische Retikulum verteilt sein und fehlen im Kernbereich. Bevor es losgeht.

Bereiten Sie künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit oder A Liquor und Grippe oh fünf NAM gemäß dem Textprotokoll vor. Den A CSF auf Raumtemperatur vorwärmen und tiefe Glukose hinzufügen, den A CSF fünf Minuten lang mit Carbogen belüften. Dann fügen Sie ein molare Stammlösungen von Calciumchlorid und Magnesiumchlorid zu Endkonzentrationen von jeweils zwei Millimolar hinzu.

Nach dem Start des Live-Imaging-Mikroskops und des Computerprogramms beginnen Sie mit der Profusion in einer Dummy-Bildgebungskammer und äquilibrieren das Röhrensystem, erwärmen Sie die Inline-Lösungsheizung und die Bildgebungskammer auf dem Mikroskoptisch und äquilibrieren Sie das System auf 32 bis 37 Grad Celsius. Bevor Sie mit dem Download-Verfahren beginnen, um Farbstoff in die Zellen zu laden, fügen Sie 100 Mikroliter vorgewärmten A CSF zu einem 0,5 Mikroliter Aliquot von fünf Millimolar Grippe oh fünf NAM hinzu und solubilizieren Sie die Lösung in einem Wasserbad für 90 Sekunden und übertragen Sie 400 Mikroliter vorgewärmter Bildgebungslösung in eine Vertiefung einer Vier- oder 24-Well-Platte. Geben Sie die D-Lösung in dieselbe Vertiefung, um 500 Mikroliter einer fünfmikromolaren Lösung herzustellen.

Legen Sie anschließend vorsichtig ein Deckblatt mit Zellen in die Vertiefung, inkubieren Sie für einen angemessenen Zeitraum In einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius hängen die DI-Ladezeit und die D-Konzentration vom Zelltyp, der Zelldichte und den spezifischen Anforderungen der Experimente ab. Lange Inkubationszeiten können die Zellen schädigen, insbesondere die primären Nuancen- und Gliazellen, und dies ist entscheidend für die Reaktionsfähigkeit auf physiologische Reize. Eine Inkubation von mehr als 30 Minuten ist nur für ER-Kalzium-Lokalisierungsexperimente nützlich, um die Verteilung von ER-Kalzium in kleinen Mikrodomänen zu untersuchen, z. B. MUEs von Stacheln. Unmittelbar nach der Inkubation übertragen Sie das Deckglas in eine andere Zellkulturvertiefung, die die Bildgebungslösung enthält.

Um die Montage der Zellen in der Bildgebungskammer vorzubereiten, tragen Sie mit einem Pinsel Hochvakuumfett auf die Bildgebungskammer auf. Wir verwenden selbstgebaute Bildgebungskammern für 10 bis 12 Millimeter Deckgläser mit kleinem Volumen und ermöglichen so hohe Perfusionsgeschwindigkeiten von bis zu 15-fachem Pufferwechsel pro Minute. Nehmen Sie das Deckglas mit der Grippe und den geladenen Zellen auf und fügen Sie einen kleinen Tropfen Bildgebungslösung hinzu, um es feucht zu halten.

Drehen Sie dann den Abdeckschirm auf den Kopf und montieren Sie die Zellen in die Bildgebungskammer. Drücken Sie das Deckglas mit einem Wattestäbchen in den Silikonkleber und wischen Sie den restlichen Puffer von der Unterseite des Glasdeckglases ab. Tauschen Sie anschließend die Dummy-Bildgebungskammer gegen die experimentelle Bildgebungskammer aus.

Waschen Sie die Zellen fünf bis 10 Minuten lang durch kontinuierliche Perfusion zur Zellauswahl. Verwenden Sie eine minimale Menge an Laserbeleuchtung, um ein schnelles Ausbleichen von Grippe OH 5 und Calcium Zwei in der Notaufnahme zu verhindern, eine hohe Scanrate von zwei bis vier Hertz, eine kleine Bildgröße und eine hohe Verstärkung am Mikroskop. Laut dem Pflanzenversuch.

Zu Beginn des Experiments dokumentieren Sie die zelluläre Verteilung der Grippe-OH-Fünf- und Kalziummarkierung sowie die rot fluoreszierende Markierung des roten Carbox-Celesterase-Konstrukts. In Ihrer Zelle, die Sie hier interessiert, führen repräsentative Neuronen durch hochauflösende X-, YZ-Bildstapel XYT-Bildgebung durch, um die ER-Kalziumdynamik unter den spezifischen experimentellen Bedingungen zu überwachen. Typische Einstellungen für unser System sind in Tabelle zwei des Textprotokolls aufgeführt: Überwachen Sie Veränderungen des ER-Kalziums unter kontinuierlicher Perfusion mit bildgebender Lösung, die Pufferaustauschraten betragen 1,5 Milliliter pro Minute für die Zellwäsche und speichern Sie die Depletion durch Blockieren des sarco-endoplasmatischen Retikulums, Kalzium, zwei a TPAs und drei Milliliter pro Minute für die Stimulation durch ein TP und DHPG und Agonisten für den metabotropen Glutamatrezeptor.

Hier werden Gliazellen mit 200 mikromolaren A TP für 10 Sekunden stimuliert. Um die Bilder zu bearbeiten, öffnen Sie den Bildstapel im Programm Image J für Multicolor-Imaging. Teilen Sie die RBG-Kanäle auf, wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden.

Identifizieren Sie die interessierenden Regionen. Zeichnen Sie je nach Zweck die interessierenden Regionen entweder um das gesamte ER oder um kleine Bereiche des ER. Verwenden Sie das Plugin Zeitreihenanalysator, um die durchschnittliche Pixelintensität in einem interessierenden Bereich auszulesen.

Berechnen Sie mit dieser Formel die hintergrundkorrigierten relativen Änderungen der Fluoreszenz um Delta F über F Null. Stellen Sie relative Änderungen der Fluoreszenz als Spur mit Delta F über F Null für die Y-Achse und Zeit für die x-Achse dar. In dieser Abbildung exprimieren die kortikalen Astrozyten der A-Zellen und die Neuronen des Hippocampus einen rot fluoreszierenden TED-Vektor und sind mit dem Kalziumindikator mit niedriger Affinität markiert.

Grippe oh fünf N.Der fluoreszierende Kalziumindikatorkomplex ist im endoplasmatischen Retikulum aller Zelltypen lokalisiert. Diese Abbildung zeigt die Grippe von fünf N-markierten Gliazellen. Während der CIN-Behandlung ist eine helle zytosolische Markierung zu sehen, wenn die Plasmamembran einer Zelle sowohl vor als auch nach der CIN-Behandlung geschädigt ist.

Dies zeigt, dass auch Flu oh five N im Zytosol durch endogene Esterasen freigesetzt wird. In diesem Experiment wird nach der TED-Markierung mit Grippe oh fünf N er der Kalziummangel von kultivierten Hippocampus-Neuronen durch den Circa-Blocker Cyclonsäure verursacht. Beachten Sie, dass die enorme Änderung der mittleren Fluoreszenzdichte pro interessierender Region, die hier gezeigt wird, eine Zeitrafferreihe mit Maus-Cortico-GL-Zellen ist, die mit einem TP stimuliert werden. Die Fluoreszenz fällt abrupt ab und erholt sich, was die Freisetzung und Wiederauffüllung von ER-Kalzium darstellt. Gleichzeitig nimmt die Fluoreszenz des rot fluoreszierenden Proteins geringfügig ab, als Folge von Schieferbleichdiagrammen, die die Änderung der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit in einigen, aber nicht allen Experimenten zeigen.

Die Fluoreszenzwerte kehren nicht auf die ursprünglichen Fluoreszenzintensitätswerte zurück, da einige Grippe- und Fünf-N-Komplexe während der Stimulation verloren gehen. Dieser Film zeigt eine Carboxylase, zwei infizierte BHK 21-Zellen in hoher Auflösung, die von Grippe oder fünf N-Calcium-Komplexen markiert und mit einem TP stimuliert wird. Es ist zu beachten, dass eine TP-induzierte Calciumfreisetzung und eine Wiederauffüllung der ER-Calciumspeicher in feinen Strukturen der ER-Tubuli sichtbar ist. Bei der Teilnahme an diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass nur vollkommen gesunde Zellen physiologische Kalziumreaktionen zeigen.

Wir empfehlen daher, an einem Tag mit derselben Zellcharge eine Reihe von miteinander verknüpften Experimenten zur Kalziumhomöostase durchzuführen. Basierend auf unserer Erfahrung funktioniert die Farbstoffgrippe von fünf N am besten, aber dieser Kalziumindikator ist nicht sehr bruchsicher. Daher wird diese Methode von der Entwicklung bleichbeständigerer Calciumindikatoren mit niedriger Affinität profitieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man E-Kalzium transient mit synthetischen Kalziumindikatoren mit niedriger Affinität abbildet. Diese Indikatoren ermöglichen es Ihnen, die Dynamik des Kalziums mit hoher zeitlicher Auflösung zu überwachen. Aus diesem Grund kann unsere Methode für die Untersuchung von Kalzium-Signalkaskaden nützlich sein, die an der synaptischen Plastizität beteiligt sind, und zur Überwachung von Veränderungen der Kalziumhomöostase in zellulären Modellen für neurodegenerative Erkrankungen.