Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die typische Interaktion zwischen Blutplättchen und Neutrophilen auf dem aktivierten Endothel während einer Gefäßerkrankung sichtbar zu machen. Dies wird durch Echtzeit-Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie an lebenden Mäusen erreicht, um das Mikrogefäßsystem innerhalb des Cremaster-Muskels sichtbar zu machen. In einem zweiten Schritt werden fluoreszenzmarkierte Antikörper infundiert und eine Entzündung oder Verletzung eingeleitet, um die resultierende direkte Visualisierung der resultierenden typischen Thrombozyten-Neutrophilen-Wechselwirkungen zu ermöglichen.

Anschließend werden die gespeicherten Daten analysiert, um die Anzahl der Zellen und deren Dynamik zu quantifizieren. Letztendlich können direkte typische Wechselwirkungen zwischen Blutplättchen und Neutrophilen auf dem aktivierten Endothel anhand des Fluoreszenzsignals der infundierten Antikörper in der Echtzeit-Intravitalmikroskopie beurteilt werden. Unsere intravitale mikroskopische Technik kann Einblicke in die Echtzeit-Wechselwirkungen zwischen Blutplättchen und Neutrophilen auf aktiviertem Endothel während der Gefäßentzündung und Thrombusbildung geben.

Diese Technologie kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Bewertung der Wechselwirkungen von Krebszellen und Blutzellen. Schalten Sie vor Beginn des Experiments das Mikroskopsystem für das Modell der vaskulären Entzündung ein. Intra-growly-Injektion von gespiegeltem TNF alpha drei Stunden vor der IP-Injektion von Anästhetika.

Sobald die Sedierung durch Zehenquetschung bestätigt wurde, wird ein PE 90-Schlauch in die Luftröhre der Maus eingeführt, um Atembeschwerden zu beseitigen. Als nächstes wird ein PE 10-Röhrchen in die linke Halsvene kanüliert, um fluoreszenzmarkierte Antikörper und zusätzliche Anästhetika zu infusionen. Ziehen Sie dann die Skrotalhaut vorsichtig heraus und schneiden Sie sie horizontal ein und verwenden Sie den Vorwarmpuffer über das Operationsfeld.

Drücken Sie nun mit einer Pinzette auf den Unterbauch, ziehen Sie vorsichtig einen Hoden mit der anderen Pinzette in der Größe heraus, den Car-Master-Muskel senkrecht und glätten Sie den Muskel über einem Glasabdeckstreifen auf einem Intra-Vial-Mikroskop-Tablett, indem Sie das periphere Gewebe an das Tablett heften. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie zunächst konjugierte Anti-Maus-Antikörper gegen Ratte, Anti-Maus CD 42 C und Alexa Boden 6 47 konjugierte Anti-Maus-GR-One-Antikörper durch die zuvor eingestellte Jugularkanüle infundieren. Markieren Sie dann im Filtersatz des Mikroskops das Kontrollkästchen für die Kanäle, die belichtet werden sollen, und stellen Sie die Belichtungszeit für jede ausgewählte Zeitrafferaufnahme ein.

Um die Anzahl der Zeitpunkte festzulegen, legen Sie einen Wert von 1000 bis 1500 mit einem Intervall von 200 Millisekunden für eine verstrichene Gesamtzeit von fünf Minuten fest. Nachdem Sie alle Parameter in der Bildaufnahme eingestellt haben, wählen Sie Start, um die Aufnahme bei einer 60-fachen Vergrößerung mit einem Fenster von 157 Mikrometer x 118 Mikrometer zu starten. Überwachen Sie die herrschenden und anhaftenden Blutplättchen in Neutrophilen fünf Minuten lang in der oberen Hälfte eines entzündeten Cremaster-Veranstaltungsortes.

Um die Blutplättchenthrombusbildung zu analysieren, gehen Sie zu Maske und wählen Sie Erstellen. Klicken Sie dann unter dem Auswahlrahmen in der Hauptansicht auf das große Bleistiftsymbol. Verwenden Sie den Bleistift, um einen Bereich außerhalb des Schiffes in der Hauptansicht einzufärben.

Um eine Hintergrundmaske festzulegen, gehen Sie zu Maske, klicken Sie auf Diese Ebene kopieren und klicken Sie auf Maske kopieren. Wählen Sie unter Aktueller Zeitpunkt alle Zeitpunkte aus und klicken Sie auf OK. Um das Hintergrundsignal zu berechnen, gehen Sie zu Statistik und klicken Sie auf Statistiken maskieren.

Klicken Sie dann im Bildbereich auf den aktuellen 2D-Zeitraffer oder auf vier D-Bilder im Maskenbereich, und wählen Sie die gesamte Maske in den Funktionen aus. Wählen Sie unter Aufnahmedatum die Option Ablaufzeit aus. Wählen Sie unter Morph-Geometrie die Option Bereich in Pixeln und unter Intensität die maximale Intensität aus.

Klicken Sie nun auf Exportieren. Öffnen Sie die Textdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie den Durchschnittswert des Hintergrundsignals während des gesamten Aufnahmezeitraums. Zur Bestimmung der Hintergrundfluoreszenzintensität.

Nachdem Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität während des Thrombozytenthrombus berechnet haben, wie gerade im ularen Entzündungsmodell gezeigt, gehen Sie zu Maske, klicken Sie auf Segment, wählen Sie Fit e und Kanal aus und geben Sie den Durchschnittswert des Hintergrundsignals bei niedrigem Klick auf Apply und OK ein. Gehen Sie dann zu Statistik und klicken Sie auf Statistiken maskieren. Klicken Sie nun im Bildbereich auf den aktuellen 2D-Zeitraffer oder auf vier D-Bilder im Maskenbereich, wählen Sie die gesamte Maske in den Features unter Aufnahmedatum aus, wählen Sie die verstrichene Zeit unter Morph-Geometrie aus, wählen Sie den Bereich in Pixeln aus und wählen Sie unter Intensität eine gewisse Intensität aus.

Klicken Sie dann auf Exportieren. Öffnen Sie die Textdatei im Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die Fluoreszenzintensität des Thrombozytenthrombus. Zur Analyse der arteriolären Thrombose beginnen Sie mit der Infusion von DITE 4 88 konjugierten Anti-Maus-CD 42 C ANDOR 6 47 anti-Maus GR one Antikörpern, wie gerade gezeigt.

Nachdem Sie auf Start geklickt haben, um den Bildaufnahmeprozess zu starten, doppelklicken Sie auf einen Punkt zwei bis drei Mikrometer intern von der Behälterwand, um den Laser abzufeuern. Die Verletzung der arteriolären Endothelzellen bewirkt eine visuelle Formveränderung, die im Hellfeldbild sichtbar sein sollte, gefolgt von einer Thrombozytenakkumulation. Fünf Minuten nach der Laserverletzung pausieren Sie die Aufnahme und brechen Sie sie ab.

Anschließend wird eine Erfassung mit 2.400 Zeitpunkten mit einem Intervall von 500 Millisekunden gestartet, um die adhärenten Thrombozyten sowie rollenden und adhärenten Neutrophilen für 20 Minuten aufzuzeichnen. Nachdem Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität während des Thrombozytenthrombus auf ähnliche Weise wie im ularen Entzündungsmodell berechnet haben, gehen Sie zu Maske, klicken Sie auf Segment, wählen Sie fit und channel aus und geben Sie den Durchschnittswert des Hintergrundsignals bei niedrigem Klick ein, Anwenden und OK. Klicken Sie nun im Bildbereich auf aktuelle 2D-Zeitraffer- oder 40-D-Bilder im Maskenbereich, wählen Sie die gesamte Maske in den Funktionen unter Aufnahmedatum aus, wählen Sie die verstrichene Zeit unter Morpho auswählen Bereich in Pixeln und wählen Sie unter Intensität eine bestimmte Intensität aus.

Klicken Sie dann auf Exportieren. Öffnen Sie die Textdatei im Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die Fluoreszenzintensität des Thrombozytenthrombus. Um die rollenden und adhärenten Neutrophilen zu quantifizieren, spielen Sie den Zeitraffer ab und zählen Sie die Anzahl der Zellen, die sichtbar umrollen.

Der Thrombozytenthrombus über 20 Minuten Rollen ist definiert als eine Abnahme der Neutrophilengeschwindigkeit während der Interaktion mit dem Thrombozytenthrombus für mindestens zwei Sekunden. Adhärente Neutrophile sind definiert als alle Neutrophilen, die mindestens zwei Minuten lang an den Thrombozytenthrombus gebunden bleiben. Hier sind repräsentative Bilder des Auftretens von Fluoreszenzsignalen, die mit Neutrophilen in Rot und Blutplättchen in Grün assoziiert sind.

Während der ularen Entzündung zeigt der Pfeil die Richtung des Blutflusses im Gefäß an. Die Anzahl der rollenden und adhärenten Neutrophilen auf entzündeten Endothelzellen wurde auf 0,25 Zellen pro Minute bzw. 18,5 Zellen pro fünf Minuten bestimmt. Die Daten sind repräsentativ für den Mittelwert plus oder minus den Standardfehler des Mittelwerts von 30 verschiedenen Es in vier Wildtyp-Mäusen.

Hier wird das mediane integrierte Fluoreszenzsignal der Blutplättchen als Funktion der Zeit aufgetragen. Es zeigte sich, dass die meisten Blutplättchen in Rot eher an den adhärenten und kriechenden Neutrophilen in Grün als an der entzündeten Gefäßwand haften. Kommen wir nun zu den neutrophilen Thrombozytenwechselwirkungen nach laserinduzierter arteriolärer Verletzung.

Diese Bilder zeigen eine einzelne Neutrophilin in Rot und mit dem gelben Pfeil, der über den Thrombozytenthrombus rollt, in Grün mit einem zweiten Neutrophilen in Rot und angedeutet durch den weißen Pfeil, der schnell über die arteriolären Endothelzellen rollt, beide über ein Fangintervall von fünf Sekunden, hier ist ein einzelnes Neutrophil, das sich wieder in Rot über einen Thrombozytenthrombus rollt und an ihm haftet, in Grün über ein Intervall von 15 Sekunden. Die Pfeilspitze kennzeichnet den rollenden und einen adhärenten Neutrophilen und der dicke graue Pfeil zeigt die Richtung des Blutflusses an. Hier wird das mediane integrierte Fluoreszenzsignal der Blutplättchen als Funktion der Zeit aufgetragen.

Die Anzahl der rollenden und adhärenten Neutrophilen wurde mit 21,5 bzw. 1,6 Zellen über 20 Minuten bestimmt. Ein anfängliches schnelles Rollen der Neutrophilen erfolgte auf den Endothelzellen. Sobald die Neutrophilen den Thrombozytenthrombus berührten, veränderte sich die Rollgeschwindigkeit der Neutrophilen auf dem Thrombozytenthrombus um einen Bereich von 8,2 Mikrometern pro Sekunde und wird durch die Wechselwirkung von Pektin und psgl L eins vermittelt.

Die Daten sind repräsentativ für den Mittelwert plus oder minus, den Standardfehler des Mittelwerts von 14 verschiedenen Thromben bei sieben Wildtyp-Mäusen fünf Minuten nach der Laserverletzung. Die Größe des Thrombozytenthrombus bleibt während der Bildgebung relativ konstant, und die Neutrophilen rollen auf den Thrombus und haften an ihm. Das Fluoreszenzsignal der zirkulierenden Blutplättchen ist vernachlässigbar.

Im Vergleich zu dem des Thrombozytenthrombus sollten Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Intravitalmikroskopsystem mit lebenden Mäusen einrichten, das es Ihnen ermöglicht, die heterotypischen Wechselwirkungen zwischen Blutplättchen und Neutrophilen auf aktiviertem Endothel innerhalb des Mikrogefäßsystems in Echtzeit zu visualisieren.