Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die typische Interaktion zwischen Thrombozyten und Neutrophilen an der aktivierten Endothelzellschicht während einer vaskulären Erkrankung sichtbar zu machen. Dies wird durch Echtzeit-Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie an lebenden Mäusen erreicht, um die Mikrozirkulation im Musculus cremaster darzustellen. In einem zweiten Schritt werden fluoreszenzmarkierte Antikörper infundiert, und eine entzündliche Reaktion oder Schädigung wird ausgelöst, um die daraus resultierenden typischen Interaktionen zwischen Thrombozyten und Neutrophilen direkt visualisieren zu können.

Anschließend werden die gespeicherten Daten analysiert, um die Anzahl der Zellen und ihre Dynamik zu quantifizieren. Letztendlich können direkte typische Interaktionen zwischen Thrombozyten und Neutrophilen auf dem aktivierten Endothel basierend auf dem fluoreszierenden Signal der infundierten Antikörper in der Echtzeit-Intravitalmikroskopie bewertet werden. Unsere intravitalmikroskopische Methode kann Einblicke in die Echtzeit-Interaktionen zwischen Thrombozyten und Neutrophilen auf aktiviertem Endothel während vaskulärer Entzündung und Thrombusbildung liefern.

Diese Technologie kann auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Krebszellen und Blutzellen. Schalten Sie vor Beginn des Experiments das Mikroskopsystem für das Modell der vaskulären Entzündung ein. Injizieren Sie intravital mittels Gröbchen-Monitoring TNF-alpha drei Stunden vor der i.p.-Injektion von Anästhetika.

Nachdem die Sedierung durch Zehenquetschen bestätigt wurde, kann eine PE-90-Röhre in die Trachea der Maus eingelegt werden, um Atembeschwerden auszuschließen. Anschließend wird eine PE-10-Röhre in die linke Vena jugularis eingeführt, um fluoreszenzmarkierte Antikörper und zusätzliche Anästhetika zu infundieren. Danach wird die Skrotalhaut vorsichtig herausgezogen und horizontal incidiert und der Operationsbereich mit vorgewärmtem Puffer benetzt.

Drücken Sie nun mit einer Pinzette auf den Unterbauch und ziehen Sie vorsichtig mit der anderen Pinzette einen Hoden heraus. Richten Sie den Musculus carpoideus vertikal aus und glätten Sie den Muskel über eine Deckglasabdeckung auf einem Mikroskoptray mit In-vial-Platte, indem Sie das umliegende Gewebe an der Platte fixieren. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie zunächst DITE 4 88 markierten Rat, anti-maus CD 42 C und Alexa floor 6 47 markierten anti-maus GR 1 Antikörper über die zuvor platzierte Jugularkanüle infundieren. Aktivieren Sie dann im Filteraufbau des Mikroskops die Kontrollkästchen für die Kanäle, die belichtet werden sollen, und stellen Sie die Belichtungszeit für jede gewählte zeitraffende Aufnahme ein.

Stellen Sie die Anzahl der Zeitpunkte auf 1000 bis 1500 bei einem Intervall von 200 Millisekunden ein, was einer Gesamtversuchszeit von fünf Minuten entspricht. Nachdem alle Parameter in der Bildaufnahme eingestellt wurden, starten Sie die Aufnahme bei einer 60-fachen Vergrößerung mit einem Fenster von 157 Mikrometer mal 118 Mikrometer. Beobachten Sie die wandständigen und adhärenten Thrombozyten an den Neutrophilen über einen Zeitraum von fünf Minuten in der oberen Hälfte eines entzündeten Cremastergefäßes.

Um die Bildung von Thrombozytenaggregaten zu analysieren, wechseln Sie zur Maske und wählen Sie „Erstellen“. Klicken Sie dann im Hauptansichtsfenster unter dem Auswahlwerkzeug auf das große Bleistiftsymbol. Verwenden Sie den Bleistift, um einen Bereich außerhalb des Gefäßes in der Hauptansicht einzufärben.

Um eine Hintergrundmaske festzulegen, gehen Sie zu Maske, klicken Sie auf „diese Ebene kopieren“ und anschließend auf „Maske kopieren“. Wählen Sie im aktuellen Zeitpunkt alle Zeitpunkte aus und klicken Sie auf „OK“. Um das Hintergrundsignal zu berechnen, gehen Sie zu Statistik und klicken Sie auf „Maskenstatistik“.

Danach im Bildmodus den aktuellen 2D-Zeitraffer oder die Vier-D-Bilder im Maskenmodus auswählen, die gesamte Maske in den Merkmalen auswählen. Unter Aufnahmedatum die verstrichene Zeit auswählen. Unter morphologische Geometrie die Fläche in Pixeln auswählen und unter Intensität die maximale Intensität auswählen.

Klicken Sie nun auf „Exportieren“. Öffnen Sie die Textdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie den Durchschnittswert des Hintergrundsignals über den gesamten Aufzeichnungszeitraum, um die Hintergrundfluoreszenzintensität zu bestimmen.

Nach der Berechnung der Hintergrund-Fluoreszenzintensität während des Thrombusbildungsprozesses in der Plättchenanalyse, wie zuvor im Modell der entzündlichen Gefäßwand dargestellt, wechseln Sie zur Maske, klicken Sie auf Segment, wählen Sie Fit e und Kanal aus, und geben Sie den Mittelwert des Hintergrundsignals bei niedriger Intensität ein. Klicken Sie dann auf Übernehmen und OK. Gehen Sie danach zu Statistik und klicken Sie auf Maskenstatistik. Gehen Sie nun in Image Scope zu aktuellen 2D-Zeitraffer- oder 4D-Bildern; im Maskenbereich wählen Sie die gesamte Maske unter den Merkmalen aus, unter Aufnahmedatum wählen Sie verstrichene Zeit, unter morphologischer Geometrie wählen Sie Fläche in Pixeln und unter Intensität wählen Sie Summenintensität.

Klicken Sie dann auf „Export“. Öffnen Sie die Textdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die Fluoreszenzintensität des Thrombus. Zur Analyse der arteriellen Thrombose infundieren Sie zunächst DITE 4 88-konjugiertes Anti-Maus-CD 42- und ANDOR 6 47-konjugiertes Anti-Maus-GR1-Antikörper, wie zuvor gezeigt.

Nachdem Sie auf „Start“ geklickt haben, um den Bildaufnahmeprozess zu starten, doppelklicken Sie auf eine Stelle zwei bis drei Mikrometer innerhalb der Gefäßwand, um den Laser auszulösen. Die Verletzung der arteriellen Endothelzellen führt zu einer sichtbaren Formveränderung, die im Hellfeldbild erkennbar sein sollte, gefolgt von einer Anreicherung von Thrombozyten. Fünf Minuten nach der Laserverletzung unterbrechen und beenden Sie die Aufnahme.

Starten Sie anschließend eine Aufnahme mit 2.400 Zeitpunkten und einem Intervall von 500 Millisekunden, um die adhärenten Thrombozyten sowie rollende und adhärente Neutrophile 20 Minuten lang aufzuzeichnen. Nach der Berechnung der Hintergrundfluoreszenzintensität während des Thrombozyten-Thrombus auf ähnliche Weise wie im inflammatorischen Modell, wechseln Sie zur Maske, klicken Sie auf Segmentieren, wählen Sie Fit und Kanal aus, geben Sie den Mittelwert des Hintergrundsignals bei Niedrig ein, klicken Sie auf Übernehmen und dann auf OK. Gehen Sie nun in der Bildansicht auf Aktueller 2D-Zeitraffer oder 40D-Bilder in der Maskenansicht, wählen Sie die gesamte Maske unter Merkmale aus, wählen Sie unter Aufnahmezeit den verstrichenen Zeitpunkt, unter Morpho die Fläche in Pixeln und unter Intensität die mittlere Intensität aus.

Klicken Sie dann auf „Exportieren“. Öffnen Sie die Textdatei in einem Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die Fluoreszenzintensität des Thrombus. Um das Rollverhalten und die Adhärenz der Neutrophilen zu quantifizieren, spielen Sie die Zeitrafferaufnahme ab und zählen Sie die Anzahl der Zellen, die sichtbar darüberrollen.

Der Plättchenthrombus während des 20-minütigen Wälzens ist definiert als Abnahme der Neutrophilengeschwindigkeit während der Interaktion mit dem Plättchenthrombus über mindestens zwei Sekunden. Adhärierende Neutrophile werden als solche definiert, die mindestens zwei Minuten lang an dem Plättchenthrombus haften bleiben. Hier sind repräsentative Bilder des Erscheinungsbilds der mit Neutrophilen in Rot und Plättchen in Grün assoziierten fluoreszierenden Signale dargestellt.

Bei der dargestellten Entzündung ist der Pfeil zeigt die Richtung des Blutflusses im Gefäß. Die Anzahl der rollenden und adhärenten Neutrophilen an entzündeten endothelialen Zellen betrug 0,25 Zellen pro Minute bzw. 18,5 Zellen pro fünf Minuten. Die Daten sind repräsentativ für den Mittelwert plus/minus Standardfehler des Mittelwerts von 30 verschiedenen Es in vier Wildtyp-Mäusen.

Hier wird das mediane integrierte fluoreszente Signal der Thrombozyten in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt. Es zeigte sich, dass die meisten Thrombozyten in Rot an den adhärenten und wandernden Neutrophilen in Grün haften, statt an der entzündeten Gefäßwand. Nun zum Thema Wechselwirkungen zwischen Neutrophilen und Thrombozyten nach laserinduzierter arteriolärer Verletzung.

Diese Aufnahmen zeigen einen einzelnen Neutrophilen in Rot, der mit dem gelben Pfeil gekennzeichnet ist und über den grünen Plättchenthrombus rollt, sowie einen zweiten Neutrophilen in Rot, der durch den weißen Pfeil markiert ist und schnell über die arteriellen Endothelzellen rollt; beide Bewegungen sind hier über ein Zeitintervall von fünf Sekunden dargestellt. Ein einzelner Neutrophiler erneut in Rot wird über einen Zeitraum von 15 Sekunden dargestellt, wie er über einen grünen Plättchenthrombus rollt und daran haftet. Der Pfeilkopf kennzeichnet die rollenden und adhärenten Neutrophilen, während der dicke graue Pfeil die Richtung der Blutströmung anzeigt. Hier wird die mediane integrierte fluoreszierende Signalintensität der Thrombozyten als Funktion der Zeit dargestellt.

Die Anzahl der rollenden und adhärenten Neutrophilen betrug innerhalb von 20 Minuten 21,5 bzw. 1,6 Zellen. Ein anfängliches schnelles Rollen der Neutrophilen fand auf den Endothelzellen statt. Sobald die Neutrophilen den Plättchenthrombus kontaktierten, änderte sich die Rollgeschwindigkeit der Neutrophilen auf dem Plättchenthrombus auf einen Bereich von 8,2 Mikrometern pro Sekunde, vermittelt durch die Interaktion von P-Selectin und PSGL-1.

Die Daten sind repräsentativ für den Mittelwert plus/minus Standardfehler des Mittelwerts von 14 verschiedenen Thromben in sieben Wildtyp-Mäusen fünf Minuten nach Laserverletzung. Die Größe des Plättchenthrombus bleibt während der Bildgebung relativ konstant, und die Neutrophilen rollen auf den Thrombus auf und haften daran. Das fluoreszierende Signal der zirkulierenden Plättchen ist vernachlässigbar.

Im Vergleich zu dem vom Thrombus, nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das intravitale Mikroskopiesystem mit lebenden Mäusen einrichtet, um in Echtzeit die heterotypischen Interaktionen zwischen Thrombozyten und Neutrophilen auf aktiviertem Endothel innerhalb der Mikrozirkulation sichtbar zu machen.