Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Rolle der in der embryonalen Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) sezernierten Signale bei der Entwicklung der Großhirnrinde zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst die embryonale CSF isoliert und als Kulturmedium verwendet wird. In den nächsten Schritten wird die sich entwickelnde Großhirnrinde präpariert, auf eine Polycarbonatmembran platziert und auf der CSF schwimmend kultiviert.

Die Ergebnisse zeigen, dass die embryonale Zerebrospinalflüssigkeit auf der Grundlage der Analyse von Explantaten mittels Immunfärbung instruktive Signale für die Entwicklung der Großhirnrinde bereitstellt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zerebrospinalflüssigkeit zu beantworten. Zum Beispiel: Welche Bestandteile enthält die Zerebrospinalflüssigkeit, welche Funktion hat sie zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung, und hoffentlich kann sie dabei helfen zu bestimmen, wie man sie eines Tages als therapeutisches Transportmittel für neurodegenerative Erkrankungen nutzen könnte.

Es ist entscheidend, dass die CSF kontaminationsfrei gesammelt wird und die Schädigung des kortikalen Explants minimiert wird. Diese Verfahren erfordern möglicherweise erhebliche Übung, da kleine Gewebe mit sehr feinen Dissektionswerkzeugen manipuliert werden müssen. Beginnen Sie damit, die Mikropipettenspitzen vorzubereiten.

Beispielsweise werden auf einem Orica PC 10 vertikalen Mikropipettenzuggerät 10 bis 20 Mikroliter Mikrokapillarpipetten mit folgenden Einstellungen hergestellt: eine Zugeheizung in Stufe zwei, eingestellt auf 58, und ein Zuggewicht von 100 Gramm. Brechen Sie die feine Spitze der Mikropipette mit feinen Pinzettenspitzen Nummer 55 ab. Der durchschnittliche Innendurchmesser der resultierenden Nadel beträgt 85 Mikrometer.

Bereiten Sie als Nächstes die Aspiratoranordnung vor. Für die CSF-Aspiration führen Sie den mit den Mikrokapi­llarpipetten mitgelieferten Mikrokolben in die Kapillarnadel ein. Alternativ befestigen Sie einen plastischen Einwegfilter am Ende der Aspiratorrohranordnung, die mit der Mikrokapi­llarpipette verbunden ist.

Als Nächstes wird am gegenüberliegenden Ende der Aspiratoranordnung die Nadel durch die Dichtung hindurchgeschoben und in Position gebracht. Überführen Sie nun einen isolierten Maus- oder Rattenembryo in eine Mikrodissektionschale, die mit Sylgard vorbereitet wurde. Spülen Sie den Embryo mit steriler HBSS und entfernen Sie die Embryonen umgebende Flüssigkeit durch Absaugen und Abtupfen mit saugfähigem Papier.

Stellen Sie das Embryo unter einem Stereomikroskop dar. Befindet sich ein Maus-Embryo vor, sollte dieser seitlich liegen und somit eine sagittale Ansicht ermöglichen. Führen Sie nun die Mikrokappillarpipette kontinuierlich in das Seiten- oder Kopfventrikel, das Mittelhirnventrikel oder das hintere Sternum ein.

Magna versucht, die neuroepithelialen Zellen nicht zu berühren. Sobald die Pipette eingeführt wurde, sollte die Nadel nur so weit vorgeschoben werden, bis das Gewebe durchstochen ist. Nun wird vorsichtig und sanft die Zerebrospinalflüssigkeit unter Verwendung eines schwachen Unterdrucks, erzeugt durch den Mikrokolben oder Mundabsaugung, in die Pipette aspiriert.

Der Liquor cerebrospinalis sollte langsam und kontrolliert sanft in die Mikrokapillarpipette fließen. Halten Sie den Unterdruck aufrecht, bis die Sammlung abgeschlossen ist. Es ist entscheidend, dass die Sammlung eine klare, transparente Flüssigkeit ergibt.

Falls Anzeichen einer Kontamination durch Blut, wie beispielsweise eine rote oder gelbe Verfärbung der Lösung, erkennbar sind, entsorgen Sie die Probe sowohl bei Maus- als auch bei Rattenembryonen. Im Stadium E 16,5 bis E 17 oder früher kann man beobachten, dass sich das Ventrikelgebiet leicht zusammenzieht, dort, wo die Mikrokappillarpipette positioniert ist. Der Liquorfluss stoppt mit diesem Ereignis; wenn der Fluss endet, entfernen Sie die Mikrokappillarpipette vorsichtig.

Als Nächstes wird die gesammelte CSF-Probe vorsichtig in ein auf Eis gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen aus einer E 14,5-Mauswurfsgruppe überführt. Es ist zu erwarten, dass nach Abschluss aller Sammelschritte zwischen 10 und 15 Mikrolitern CSF gewonnen werden. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Um eventuelle kontaminierende Zellen zu entfernen, das klare Zerebrospinalfluid (CSF) in ein neues Röhrchen überführen. Die mikroskopische Untersuchung auf Kontaminationen kann nun durchgeführt werden, falls das Probenmaterial als rein angesehen wird. Die Probe kann für Analysen verwendet, mit anderen Proben zusammengefasst oder schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, um kortikale Explantate für Experimente mit CSF-supplementiertem Medium zu gewinnen.

In einer bestrichenen Petrischale den Cortex eines E14,5-Embryos freilegen. Die Dura zusammen mit dem sich entwickelnden Schädel mit einem Skalpell entfernen, jedoch die Pia und Arachnoidea am Cortex belassen. Das Gehirn entlang der Mittellinie in der mittleren Sagittalebene halbieren und die rechte von der linken kortikalen Hemisphäre trennen.

Bereiten Sie jede kortikale Hemisphäre separat vor. Legen Sie die Hemisphäre mit der medialen Seite nach oben, sodass Sie die Ganglieneminenz und den sich entwickelnden Kortex sehen können. Führen Sie mit dem Skalpell einen koronalen Schnitt durch das kortikale neuroepitheliale Hüllgewebe bis hin zum sich entwickelnden Riechkolben durch.

Dieser Einschnitt sollte am vorderen Rand der lateralen und medialen Ganglieneminenz beginnen und sich durch die Region des anterioren Cingulums des sich entwickelnden kortikalen Anlagegebietes erstrecken. Führen Sie einen weiteren koronalen Einschnitt direkt angrenzend an der hinteren Grenze der lateralen Ganglieneminenz durch. Dieser Einschnitt sollte sich von der lateralen Begrenzung der Ganglieneminenz bis zur medialen Wand des sich entwickelnden kortikalen Anlagegebiets erstrecken.

Verwenden Sie das Skalpell, um die durch die beiden Einschnitte entstandene kortikale Klappe zurückzuklappen. Dies verringert das Risiko einer Schädigung der Großhirnrinde. Dissezieren Sie nun das sich entwickelnde Hippocampus und das kortikale Hem der medialen Zephalon.

Führen Sie dies von der Spitze des Neokortex aus durch, wo die laterale kortikale Oberfläche auf die interhemisphärische Wand trifft. Machen Sie anschließend einen Querschnitt entlang der Grenze, die das laterale ganglionäre Eminenz vom sich entwickelnden Kortex trennt. Entfernen Sie jegliches zusätzliche dissektierte Gewebe von der Platte.

Der präparierte Kortex liegt nun mit der Meningeseite nach unten. Um den Kortex zu übertragen, bereiten Sie eine Platindrathülse vor, die mit einer Glaspipette verbunden ist, indem Sie das Ende der Pipette mit einem Bunsenbrenner auf den Platindraht schmelzen. Sterilisieren Sie nach der Montage die Platindrathülse und lassen Sie sie abkühlen.

Entfernen Sie das überschüssige Medium um das X-Explan herum vorsichtig durch Absaugen. Lassen Sie eine kleine Menge der Lösung zurück, um sie mit der Drahtschleife zu verwenden. Anschließend legen Sie eine einen Zentimeter große Polycarbonatmembran in eine vier Zentimeter durchmessende Imaging-Schale.

Wenden Sie nun mithilfe der Seite des Platindrähtchens vorsichtig die Großhirnrinde, sodass die Meningealseite nach oben zeigt. Platzieren Sie dann das X-Explantat in der Mitte des Drahtchens und heben Sie das kortikale X-Explantat unter Nutzung der intrinsischen hydrostatischen Kräfte aus der Petrischale heraus. Setzen Sie das Explantat anschließend vorsichtig auf die Polycarbonatmembran und heben Sie das Platindrähtchen ab.

Als Nächstes pipettieren Sie 50 Mikroliter Zerebrospinalflüssigkeit oder anderes Medium auf. Heben Sie die Membran vorsichtig an und detektieren Sie das darunterliegende Medium. Hallo, decken Sie die Imaging-Schale ab.

Stellen Sie es in einen befeuchteten Sekundärbehälter und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Um das fortgesetzte Wachstum von s und die Ausbreitung zu unterstützen, wurden CSF-Sammelmengen aus durchschnittlichen Wurfgrößen für Mäuse und Ratten aus verschiedenen embryonalen Altersstadien berechnet. Wenn reine CSF-Proben gesammelt wurden, kann das CSF mit einer Reihe verschiedener Methoden analysiert werden, wie beispielsweise einer Silberfärbung von wenigen Mikrogramm.

Dieses CSF stammt von einem E 14,5-Maus-Embryo. 24 Stunden alte Explantate, die mit 100 % CSF proliferiert wurden, weisen eine Gewebemorphologie auf, die nach Immunfärbung Embryonen von Nagetieren desselben Gestationsalters ähnelt. pH drei.

Ein Marker der Zellteilung wird entlang der ventrikulären Oberfläche exprimiert. B-R-D-U – ein Marker der DNA-Synthese – zeigt ebenfalls eine Einlagerung in der ventrikulären Zone. Und T uj 1, ein neuronalen Marker, wird in der sich entwickelnden kortikalen Platte exprimiert.

Bevor Sie diese Verfahren durchführen, sollten Sie die Richtlinien Ihrer Institution bezüglich der hier demonstrierten Techniken überprüfen. Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, um die in der Zerebrospinalflüssigkeit enthaltenen sekretierten Signale zu untersuchen, die in vitro die Rolle der Großhirnrinde während der Entwicklung steuern.