Name: Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von embryonalem Liquor aus Nagetierembryonen und die Kultivierung von Kortexexplantaten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Signalsubstanzen für die Entwicklung des zerebralen Kortex.

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Wir sind dankbar für die Unterstützung aus dem NIH (Award-Nummern R00 NS072192 um MKL, HD029178 um AS.L. und 2 RO1 NS032457 um CAW). MKL ist der Empfänger von der Kinderklinik Boston Career Development Fellowship / Harvard Medical School Shore Fellowship und Fellow der Alfred P. Sloan Foundation. CAW ist ein Investigator des Howard Hughes Medical Institute.

Ein. Embryo Isolation / der Zubereitung Diese Technik kann für Maus oder Ratte verwendet werden. In diesem Protokoll demonstrieren wir die CSF Sammlung Technik und zerebralen Kortex Explantat Dissektion mit embryonalen Gehirn. Wir werden auf alle wichtige Unterschiede für Ratten im Vergleich zu Mäusen, die im Rahmen der allgemeinen Techniken existieren kommentieren. Für die embryonalen Alter Staging-System, ist E1 als der Tag des Steckers für Ratten klassifiziert und E0.5 wird als Tag des Steckers für Mäuse eingestuft. <ol><li> Bereiten Sie eine Mikrodissektion Gericht mit Sylgard Silikon-Elastomer. Sylgard 184 Silikon-Elastomer wird als zweiteilige flüssige Komponente, Teil A und Teil B. Teil A und Teil B in einem Verhältnis von 10:1 nach Gewicht oder Volumen gemischt werden mitgeliefert. Nachdem die Flüssigkeitskomponenten gemischt werden, gießen die Sylgard Elastomers in einer Petrischale, die gesamte Oberfläche der Schale abzudecken. Einige Luftblasen vorliegen können, die während der Aushärtung zu zerstreuen werden. Legen Sie die Petrischale Deckel auf und lassen Sie die Elastomereer zu heilen. Das Elastomer kann bei Raumtemperatur für 24 Stunden gehärtet werden, oder bei höheren Temperaturen (zB 37 ° C) für eine schnellere Aushärtung. Sobald die flüssigen Bestandteile zu verfestigen, ist die Dissektion Gericht einsatzbereit. Die Schale kann wiederholt für mehrere Experimente verwendet werden, vorausgesetzt, es wird auch nach der Verfahrensweise gereinigt. </li><li> Herstellung der Mikrokapillare Pipette (Nadel). Micro-Kapillar-Pipetten werden durch Anwendung von Hitze zubereitet und ziehen mit einem Narishige PC-10 vertikale Feinpipettenziehvorrichtung mit den folgenden Einstellungen: Ein Schritt Pull; Heater # 2 auf 58, 100 g Abzugsgewicht. Die feine Spitze der Mikropipette wird sorgfältig off mit feinen Nr. 55 Zangen gerissen. Die resultierende durchschnittliche Innendurchmesser der Nadel 85 um. </li><li> Bereiten Sie den Sauger Baugruppe für CSF Aspiration. Legen Mikro-Stempel versehen mit Mikro-Kapillaren in die Kapillare Nadel. Alternativ beifügen Kunststoff-Einweg-Filter am Ende der Saugvorrichtung Tubusbaugruppe, die t verbunden isto die Mikrokapillare Pipette. Schieben der Nadel durch die Dichtung in Position am gegenüberliegenden Ende des Aspirators Montage. </li><li> Übertragen Embryo isoliert von der Streu zu einer Mikrodissektion Schale mit Sylgard hergestellt. </li><li> Entfernen Sie die extra-embryonalen Membranen und Geweben, so dass der Embryo deutlich ausgesetzt ist. Jedes Gewebe Schicht zuerst die Gebärmutterwand und dann die decidua-kann seziert mit feinen Iridektomie Schere (dh Fine Science Tools # 15000-02) werden. An jedem Implantationsstelle zunächst der Gebärmutterwand, dann die decidua kann parallel zu der langen Achse des Uterus eingeschnitten werden soll, und der Schnitt kann dann weiter geöffnet werden mit feinen Pinzetten. Die Decidua kann nach einem ähnlichen Schnitt entfernt werden, Freilegung der Fruchtblase. Vorsicht ist geboten, so dass die Fruchtblase nicht eingeschnitten oder durchstochen werden. </li><li> Waschen mit steriler Hanks balanced salt solution (HBSS) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem umliegenden Embryos mit einer Pipette sowie einen Kimwipe oder FilterPapier geschnitten in Dreiecke. </li></ol> 2. Ventrikelliquor Sammlung <ol><li> Visualisieren Embryo unter dem Dissektionsmikroskop: für Maus, der Embryo sollte auf seiner Seite vorgesehenen Ablagefläche ist, so dass man eine sagittale Ansicht des sich entwickelnden Embryos aufweist. Mit Rattenembryonen E16 oder älteren, Positionieren des Embryos auf seiner dorsalen Wirbelsäule entlang seiner längsten planaren Dimension von einer kranial nach kaudal Richtung, als wenn der Embryo auf dem Rücken liegt. Auf diese Weise kann der Liquor von beiden rechten und linken lateralen Ventrikel gesammelt werden. </li><li> Kontinuierlich einsetzen Mikrokapillare Pipette in den lateralen Ventrikel, mesencephalicus Herzkammer oder cisterna magna, versucht nicht, die Neuroepithelzellen kontaktieren, sobald der Pipette eingesetzt ist. Für E14.5 Maus-Embryonen oder älter, kann der Liquor aus der rechten Herzkammer abgesaugt werden und anschließend die Nadel entnommen und in den linken Ventrikel. Wegen der Durchgängigkeit der Ventrikel und dem Neuralrohr in Embryonen jünger als E14.5, diegesamte CSF Lautstärke kann oft aus der Seitenventrikel mit einem einzigen Nadeleinführung abgesaugt werden. Dies ist jedoch nicht immer der Fall, da Zeiten und Entwicklungsstörungen Durchgängigkeit der Verbindung Ventrikel leicht variieren kann, und daher kann die Mikrokapillare Pipette kann auch in die Zisterne magna eingefügt werden, um die maximale Volumen CSF sammeln. </li><li> Sobald die Mikrokapillare Pipette in den lateralen Ventrikel, mesencephalicus Herzkammer oder cisterna magna eingesetzt ist, sorgfältig und schonend beginnt Ansaugen der CSF in die Pipette, wobei entweder die Mikro-Kolben einen Unterdruck erzeugen und saugt den CSF, oder durch Bereitstellen eines sanften Unterdruck durch den Mund, so dass CSF sanft in die Mikro-Kapillarpipette in einem langsamen und kontrollierten Art und Weise zu fließen beginnt erstellt. Wir empfehlen, dass der Betrachter mit ihren eigenen lokalen Beamten in Bezug auf institutionelle Politik auf diesen Ansätzen überprüft. </li><li> Weiterhin negativen Druck auszuüben und sammeln die CSF in der Mikro-Kapillarpipette.In beiden Maus und Ratte Embryonen von E16.5/E17 oder jünger ist es möglich, den Ventrikel Zusammenbruch leicht beobachten durch das Auftreten eines Divot Bilden, auf der Seite des Kopfes, dass die Mikro-Kapillarpipette in. ist In älteren Embryonen, wegen der größeren Größe des Gehirns, kann es nicht möglich sein, den Kopf zu beobachten kollabieren. </li><li> Stoppen Sie Druck und entfernen Sie vorsichtig die Mikrokapillare Pipette aus der Seitenventrikel. </li><li> Gently Vertreibung der CSF Probe in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis wurde gekühlt. </li><li> Sammeln Sie weiter die CSF aus einem ganzen Wurf von Tieren und bündeln die Proben in das gleiche Rohr. </li><li> Zentrifugieren bei 10000 × g bei 4 ° C für 10 min, um alle kontaminierenden Zellen zu entfernen. </li><li> Analyse der Proben auf Anzeichen von kontaminierenden Neuroepithelzellen oder roten Blutzellen. Anzeichen von Verunreinigungen werden in der Regel durch das Fluid auftretenden trüb oder rot / rosa, oder die Anwesenheit eines Pellets mit einem Blut gefärbte Fleck angedeutet. Nach Zentrifugation der CSF kann mikroskopisch auf Anzeichen von Zellen oder Zelltrümmer analysiert werden. Bei Anzeichen von Verunreinigungen sind die Flüssigkeit sollte verworfen werden. Als zusätzliche Kontrolle kann das Pellet Inhalt auch für Zellen gefärbt werden. Ein sauberer CSF-Probe kann für eine Zellkultur, kortikale Kultur, Spektrometrie, Western-Blot, ELISA, und andere Assays verwendet werden. Die klare CSF sollte ein neues steriles Eppendorf-Röhrchen überführt werden. Die Probe kann nun zur Analyse verwendet werden, mit anderen gepoolten Proben oder Schnappverbindung mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. Das Einfrieren und Auftauen von kleinen Proben von Fluid kann in einem kleinen Volumen Abnahme und Veränderungen in Proteinkonzentration führen. Dies kann durch Gefriertrocknen die Proben vermieden werden. </li></ol> 3. Kortikale Explantation Dissection <ol><li> Übertragen Sie die E14.5 Embryos aus dem Wurf auf eine Mikrodissektion Gericht mit Sylgard vorbereitet isoliert. </li><li> Entfernen Embryo aus extra-embryonalen Membranen und Geweben wie in Schritt 1.5 beschrieben. </li> &lt;li&gt; Wash mit steriler Hanks balanced salt solution (HBSS) und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus dem umliegenden Embryos mit einer Pipette. </li><li> Sezieren durch den Halsbereich Abtrennen des Kopfes von dem Rest des Embryos (Abb. 1A). </li><li> Mit einem feinen Skalpell (Augenheilkunde Messer), reduzieren die Mittellinie der Kopfhaut. Fassen Sie jede Seite diesen Einschnitt mit feinen Pinzetten und entfernen Sie die Haut. Als Nächstes verwenden Iridektomie Schere einen Einschnitt, der die Länge der Mittellinie der Entwicklungsländer Schädels verläuft machen. Anschließend stellen zwei weitere Einschnitte, etwa 1/3 des Abstands von der vorderen und hinteren Enden der Entwicklungswalze Schädel. Verwenden feinen Pinzette, um die &quot;Klappen&quot; des Schädels zu begreifen, die sich aus diesem Teil der Dissektion, und entfernen Sie die Entwicklung von Schädel Gewebe, Aussetzen des Kortex (Abbildung 1B). </li><li> Mit dem Skalpell bisect das Gehirn entlang der Mittellinie in der Mitte der Sagittalebene, die Trennung der rechten und linken kortikalen Hemisphären (Figures1B, C). Die Pia und Arachnoidea sind links an dem Cortex und die Dura wird zusammen mit der Entwicklung von Schädel entfernt. </li><li> Bereiten Sie jede kortikale Hemisphäre getrennt. Legen Sie die Hemisphäre medialen Seite nach oben, so dass Sie die Ganglien Eminenz und die Entwicklung von Cortex (1C, D) zu sehen. </li><li> Mit dem Skalpell einen koronalen Schnitt durch die kortikalen Neuroepithel kaudal der Entwicklung Riechkolben. Dieser Schnitt sollte am vorderen Rand der lateralen und medialen ganglionären Eminenzen beginnen, und erstrecken sich durch den vorderen Bereich des cingulären entwickeln kortikalen Rudiment (1E). </li><li> Machen Sie eine weitere koronalen Schnitt nur kaudal der hintere Begrenzung der seitlichen ganglionic eminence (1F). Dieser Einschnitt sollte auch von der seitlichen Begrenzung des ganglionären Eminentia erstrecken zur medialen Wand der Entwicklungseinheit kortikalen Rudiment. </li><li> Ziehen Sie den kortikalen &quot;Klappe&quot; created durch die beiden Einschnitte in den Schritten 3.7 und 3.8 hergestellt, ein Skalpell oder leichten Druck aus einem Strom von HBSS mit 200 ul Pipettors geliefert an eine mechanische Beschädigung der Hirnrinde zu vermeiden. Dann machen Sie einen Quer-Schnitt entlang der Grenze zwischen den seitlichen ganglionic Eminenz aus den Entwicklungsländern Kortex (Figuren 1G, H). Dann sezieren entfernt die Entwicklungsländer Hippocampus und Kortex Saum des medialen Telencephalon, an der Spitze des Neokortex, wo die seitliche kortikale Oberfläche trifft interhemisphärischen Wand. </li><li> Machen Sie einen Quer-Schnitt entlang der Grenze zwischen den seitlichen ganglionic Eminenz aus den Entwicklungsländern Kortex (Abb. 1H). </li><li> Entfernen Sie zusätzliche seziert Gewebe, das auf der Sylgard Platte aus dem seziert kortikalen Explantat ist. Man kann vorsichtiges Pipettieren mit frischem HBSS-Puffer verwenden, um pipettieren entfernt alle persönlichen seziert Gewebe. Die seziert Kortex ist jetzt mit meningealen Seite nach unten (Abb. 1I). </li></ol><ol><li> Bereiten Sie einen Platindraht Schleife mit einer Glaspipette. Erwärmen der Glaspipette mit einem gefalteten Platindraht am Ende der Glaspipette eingefügt. Durch Verdrehen des Endes der Platindraht Schleife kann die Größe der Schleife erhöht oder verringert werden, und die Schleife geformt sein, um die Größe des gewünschten Explantat zu passen. (Dies kann vorbereitet und wiederverwendet werden.) </li><li> Erwärmen des Endes des Platindraht, um die Schleife zu sterilisieren. </li><li> Isolieren Sie die seziert kortikalen Explantat und entfernen Sie die zusätzlichen HBSS Medien durch vorsichtiges Pipettieren, so dass eine kleine Menge mit der Drahtschlinge verwenden. </li><li> Legen Sie eine 1 cm Polycarbonat Membran in einer 4 cm Durchmesser Bildgebung Gericht. </li><li> Mit der Seite des Platin Drahtschlinge vorsichtig kippen die Rinde, so dass die meningealen Seite nach oben zeigt. </li><li> Heben die kortikale Explantat vor der Dissektion Schale, indem das Explantat in der Mitte der Schleife und Verwendung der intrinsischen hydrostatischen KräfteHeben Sie das Explantat auf einer ebenen Fläche. </li><li> Sanft platzieren das Explantat auf dem Polycarbonat-Membran, und heben den Platindraht Schleife entfernt, so dass das Explantat auf der Membran auf eine flache Ebene mit der ventrikuläre Oberfläche in Kontakt mit Membran bleibt. </li><li> Heben Sie die Membran und pipettieren 50 ul CSF oder andere Medien unter der Membran. </li><li> Bedecken Sie den Imaging-Teller, legen Sie sie in einem befeuchteten zweiten Behälter, und bei 37 ° C in 5% CO 2 für 24 Stunden, um weitere Zellproliferation und Explantat Wachstum zu unterstützen. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung des endgültigen kortikalen Explantat Gericht Vorbereitung. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das beschriebene Verfahren zur Ventrikelliquor Kollektion relativ reine Proben von embryonalen CSF mit stabilen Protein-Zusammensetzung und konsequente Aktivität in einer Reihe von zellulären Assays 9 ergab. Mit einer guten Sammlung Technik und Wurfgröße von zehn E14.5 Mäusen, kann man erwarten, 10-15 ul CSF zu sammeln und aus einem Wurf von E16 Ratten, kann man erwarten, dass etwa 50-90 ul CSF sammeln. Diese Sammlung Technik minimiert Kontamination von Blut und Gewebe, durch sorgfältige Beobachtung, Zentrifu...

Das GFK ist eine komplexe Flüssigkeit, die die Entwicklung Neuroepithel 1-6 badet und liefert wesentliche Druck 7 und wachstumsfördernde Signale für das sich entwickelnde Gehirn 8-12. Die CSF im Laufe der Entwicklung des Gehirns zu untersuchen, haben wir Techniken Ventrikelliquor aus Entwicklungs Ratte oder Maus-Embryonen isolieren während verschiedenen Stadien der Entwicklung 6,9. Bisherige Methoden der Isolation aufgenommen mit einem Glas Mikro-Nadel und Isolierung der CSF mit einem Mikro-Injektor 1,2. Unsere Methode nutzt ein Glas Mikro-Kapillarpipette deren Spitze wurde gezogen, um eine ultrafeine für verbesserte Eindringen in das Gewebe zu schaffen. Das Glas Mikrokapillare Pipette ist an ein Sauggebläse angeschlossen, so dass Ventrikelliquor Sammlung unter leichtem Druckänderungen gesteuert werden kann. Um die Stammzellen Einflüsse von CSF-Signale zu untersuchen, zerlegen wir zerebralen kortikalen Explantaten, legen Sie sie auf Polycarbonat Membranen und schweben sie über geeignete culture Medium mit CSF Proben 9 ergänzt. Mit dieser Technik sind geringere Mengen von Medien ausreichend ist, um das Gewebe Kultur, so dass für eine effiziente Verwendung von CSF 9.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Wiretrop II Kapillarnadeln </td><td> Drummond Scientific </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Ellsworth Adhesives </td><td> Nr. 184 SIL ELAST Kit </td><td></td></tr><tr><td> Aspirator Tubusbaugruppe </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Einwegfilter </td><td> Venturi oder örtlichen Apotheke </td><td> nicht verfügbar </td><td> Standard Zigarettenfilter </td></tr><tr><td> Roundstock opthalmic Messer (15 Grad stab Messer) </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35mm Glasboden Kulturschale </td><td> MatTek Corp </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platin-Iridium-Draht </td><td> Tritech Forschung </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch Membrane </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Iridektomie Scissors </td><td> Fine Science Tools </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von liquor aus rodent embryonen für die verwendung mit dissected cerebral kortikale explantate

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Das GFK ist eine komplexe Flüssigkeit mit einer sich dynamisch ändernden Proteom während der Entwicklung und im Erwachsenenalter. Während der embryonalen Entwicklung unterscheidet der naszierenden CSF aus dem Fruchtwasser bei Schließen des vorderen Neuralrohr. CSF Volumen steigt dann über den folgenden Tagen als neuroepithelialen Vorläuferzellen entlang der Herzkammern und die Plexus generate CSF. Die embryonalen CSF Kontakte der apikale, ventrikuläre Oberfläche der neuralen Stammzellen des sich entwickelnden Gehirns und des Rückenmarks. CSF bietet entscheidende Flüssigkeitsdruck für den Ausbau des sich entwickelnden Gehirns und vertreibt wichtige wachstumsfördernde Faktoren auf neurale Vorläuferzellen in einem zeitlich-spezifische Weise. Um die Funktion der CSF zu untersuchen, ist es wichtig, reine Proben von embryonalen CSF ohne Kontamination aus Blut oder der Entwicklungswalze telencephalen Gewebe isolieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um relativ reine Proben von ventrikulären embryonalen CSF, die verwendet werden kann für isoliereneine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie Massenspektrometrie, Protein-Elektrophorese und der Zelle und primären Explantatkultur. Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur kortikalen Explantate auf porösen Polycarbonatmembranen um die Entwicklung kortikalen Gewebe mit reduzierten Volumina von Medien oder CSF wachsen. Mit diesem Verfahren kann unter Verwendung von Experimenten CSF aus unterschiedlichen Alters oder Bedingungen, um die biologische Aktivität des CSF Proteom auf Zielzellen zu untersuchen.

Die CSF Sammlung sollte ergeben einen klaren, transparenten Flüssigkeit. Es sollte keine Anzeichen von Kontamination aus Blut sein, wie durch einen rot oder gelb gefärbten Flüssigkeit in der Ansaug und in der Eppendorf-Röhrchen nachgewiesen. Es sollte auch keine Hinweise auf Gewebe in dem Aspirat und Eppendorf Rohr sein. Wenn der CSF zentrifugiert wird, kann man auch die für das CSF mikroskopisch um sicherzustellen, dass es keine Kontamination. Bei Anzeichen von Verunreinigungen sind, sollte die CSF verworfen werden. Vo...

Kammerunterstützungsgerät Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) taucht die neuroepithelialen und zerebralen Kortex Vorläuferzellen während der frühen Entwicklung des Gehirns im Embryo. Hier beschreiben wir die Methode entwickelt, um ventrikuläre CSF aus Nagetier Embryonen unterschiedlichen Alters zu isolieren, um seine biologische Funktion untersucht. Darüber hinaus zeigen wir unsere zerebralen Kortex Explantat Dissektion und Kultur Technik, die für Explantat Wachstum ermöglicht mit minimalem Volumen von Kulturmedium oder CSF.

Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Rolle der in der embryonalen Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) sezernierten Signale bei der Entwicklung der Großhirnrinde zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst die embryonale CSF isoliert und als Kulturmedium verwendet wird. In den nächsten Schritten wird die sich entwickelnde Großhirnrinde präpariert, auf eine Polycarbonatmembran platziert und auf der CSF schwimmend kultiviert.Die Ergebnisse zeigen, dass die embryonale Zerebrospinalflüssigkeit auf der Grundlage der Analyse von Explantaten mittels Immunfärbung instruktive Signale für die Entwicklung der Großhirnrinde bereitstellt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zerebrospinalflüssigkeit zu beantworten. Zum Beispiel: Welche Bestandteile enthält die Zerebrospinalflüssigkeit, welche Funktion hat sie zu verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung, und hoffentlich kann sie dabei helfen zu bestimmen, wie man sie eines Tages als therapeutisches Transportmittel für neurodegenerative Erkrankungen nutzen könnte.Es ist entscheidend, dass die CSF kontaminationsfrei gesammelt wird und die Schädigung des kortikalen Explants minimiert wird. Diese Verfahren erfordern möglicherweise erhebliche Übung, da kleine Gewebe mit sehr feinen Dissektionswerkzeugen manipuliert werden müssen. Beginnen Sie damit, die Mikropipettenspitzen vorzubereiten.Beispielsweise werden auf einem Orica PC 10 vertikalen Mikropipettenzuggerät 10 bis 20 Mikroliter Mikrokapillarpipetten mit folgenden Einstellungen hergestellt: eine Zugeheizung in Stufe zwei, eingestellt auf 58, und ein Zuggewicht von 100 Gramm. Brechen Sie die feine Spitze der Mikropipette mit feinen Pinzettenspitzen Nummer 55 ab. Der durchschnittliche Innendurchmesser der resultierenden Nadel beträgt 85 Mikrometer.Bereiten Sie als Nächstes die Aspiratoranordnung vor. Für die CSF-Aspiration führen Sie den mit den Mikrokapi­llarpipetten mitgelieferten Mikrokolben in die Kapillarnadel ein. Alternativ befestigen Sie einen plastischen Einwegfilter am Ende der Aspiratorrohranordnung, die mit der Mikrokapi­llarpipette verbunden ist.Als Nächstes wird am gegenüberliegenden Ende der Aspiratoranordnung die Nadel durch die Dichtung hindurchgeschoben und in Position gebracht. Überführen Sie nun einen isolierten Maus- oder Rattenembryo in eine Mikrodissektionschale, die mit Sylgard vorbereitet wurde. Spülen Sie den Embryo mit steriler HBSS und entfernen Sie die Embryonen umgebende Flüssigkeit durch Absaugen und Abtupfen mit saugfähigem Papier.Stellen Sie das Embryo unter einem Stereomikroskop dar. Befindet sich ein Maus-Embryo vor, sollte dieser seitlich liegen und somit eine sagittale Ansicht ermöglichen. Führen Sie nun die Mikrokappillarpipette kontinuierlich in das Seiten- oder Kopfventrikel, das Mittelhirnventrikel oder das hintere Sternum ein.Magna versucht, die neuroepithelialen Zellen nicht zu berühren. Sobald die Pipette eingeführt wurde, sollte die Nadel nur so weit vorgeschoben werden, bis das Gewebe durchstochen ist. Nun wird vorsichtig und sanft die Zerebrospinalflüssigkeit unter Verwendung eines schwachen Unterdrucks, erzeugt durch den Mikrokolben oder Mundabsaugung, in die Pipette aspiriert.Der Liquor cerebrospinalis sollte langsam und kontrolliert sanft in die Mikrokapillarpipette fließen. Halten Sie den Unterdruck aufrecht, bis die Sammlung abgeschlossen ist. Es ist entscheidend, dass die Sammlung eine klare, transparente Flüssigkeit ergibt.Falls Anzeichen einer Kontamination durch Blut, wie beispielsweise eine rote oder gelbe Verfärbung der Lösung, erkennbar sind, entsorgen Sie die Probe sowohl bei Maus- als auch bei Rattenembryonen. Im Stadium E 16,5 bis E 17 oder früher kann man beobachten, dass sich das Ventrikelgebiet leicht zusammenzieht, dort, wo die Mikrokappillarpipette positioniert ist. Der Liquorfluss stoppt mit diesem Ereignis; wenn der Fluss endet, entfernen Sie die Mikrokappillarpipette vorsichtig.Als Nächstes wird die gesammelte CSF-Probe vorsichtig in ein auf Eis gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen aus einer E 14,5-Mauswurfsgruppe überführt. Es ist zu erwarten, dass nach Abschluss aller Sammelschritte zwischen 10 und 15 Mikrolitern CSF gewonnen werden. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Um eventuelle kontaminierende Zellen zu entfernen, das klare Zerebrospinalfluid (CSF) in ein neues Röhrchen überführen. Die mikroskopische Untersuchung auf Kontaminationen kann nun durchgeführt werden, falls das Probenmaterial als rein angesehen wird. Die Probe kann für Analysen verwendet, mit anderen Proben zusammengefasst oder schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden, um kortikale Explantate für Experimente mit CSF-supplementiertem Medium zu gewinnen.In einer bestrichenen Petrischale den Cortex eines E14,5-Embryos freilegen. Die Dura zusammen mit dem sich entwickelnden Schädel mit einem Skalpell entfernen, jedoch die Pia und Arachnoidea am Cortex belassen. Das Gehirn entlang der Mittellinie in der mittleren Sagittalebene halbieren und die rechte von der linken kortikalen Hemisphäre trennen.Bereiten Sie jede kortikale Hemisphäre separat vor. Legen Sie die Hemisphäre mit der medialen Seite nach oben, sodass Sie die Ganglieneminenz und den sich entwickelnden Kortex sehen können. Führen Sie mit dem Skalpell einen koronalen Schnitt durch das kortikale neuroepitheliale Hüllgewebe bis hin zum sich entwickelnden Riechkolben durch.Dieser Einschnitt sollte am vorderen Rand der lateralen und medialen Ganglieneminenz beginnen und sich durch die Region des anterioren Cingulums des sich entwickelnden kortikalen Anlagegebietes erstrecken. Führen Sie einen weiteren koronalen Einschnitt direkt angrenzend an der hinteren Grenze der lateralen Ganglieneminenz durch. Dieser Einschnitt sollte sich von der lateralen Begrenzung der Ganglieneminenz bis zur medialen Wand des sich entwickelnden kortikalen Anlagegebiets erstrecken.Verwenden Sie das Skalpell, um die durch die beiden Einschnitte entstandene kortikale Klappe zurückzuklappen. Dies verringert das Risiko einer Schädigung der Großhirnrinde. Dissezieren Sie nun das sich entwickelnde Hippocampus und das kortikale Hem der medialen Zephalon. Führen Sie dies von der Spitze des Neokortex aus durch, wo die laterale kortikale Oberfläche auf die interhemisphärische Wand trifft. Machen Sie anschließend einen Querschnitt entlang der Grenze, die das laterale ganglionäre Eminenz vom sich entwickelnden Kortex trennt. Entfernen Sie jegliches zusätzliche dissektierte Gewebe von der Platte.Der präparierte Kortex liegt nun mit der Meningeseite nach unten. Um den Kortex zu übertragen, bereiten Sie eine Platindrathülse vor, die mit einer Glaspipette verbunden ist, indem Sie das Ende der Pipette mit einem Bunsenbrenner auf den Platindraht schmelzen. Sterilisieren Sie nach der Montage die Platindrathülse und lassen Sie sie abkühlen.Entfernen Sie das überschüssige Medium um das X-Explan herum vorsichtig durch Absaugen. Lassen Sie eine kleine Menge der Lösung zurück, um sie mit der Drahtschleife zu verwenden. Anschließend legen Sie eine einen Zentimeter große Polycarbonatmembran in eine vier Zentimeter durchmessende Imaging-Schale.Wenden Sie nun mithilfe der Seite des Platindrähtchens vorsichtig die Großhirnrinde, sodass die Meningealseite nach oben zeigt. Platzieren Sie dann das X-Explantat in der Mitte des Drahtchens und heben Sie das kortikale X-Explantat unter Nutzung der intrinsischen hydrostatischen Kräfte aus der Petrischale heraus. Setzen Sie das Explantat anschließend vorsichtig auf die Polycarbonatmembran und heben Sie das Platindrähtchen ab.Als Nächstes pipettieren Sie 50 Mikroliter Zerebrospinalflüssigkeit oder anderes Medium auf. Heben Sie die Membran vorsichtig an und detektieren Sie das darunterliegende Medium. Hallo, decken Sie die Imaging-Schale ab.Stellen Sie es in einen befeuchteten Sekundärbehälter und inkubieren Sie es 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Um das fortgesetzte Wachstum von s und die Ausbreitung zu unterstützen, wurden CSF-Sammelmengen aus durchschnittlichen Wurfgrößen für Mäuse und Ratten aus verschiedenen embryonalen Altersstadien berechnet. Wenn reine CSF-Proben gesammelt wurden, kann das CSF mit einer Reihe verschiedener Methoden analysiert werden, wie beispielsweise einer Silberfärbung von wenigen Mikrogramm.Dieses CSF stammt von einem E 14,5-Maus-Embryo. 24 Stunden alte Explantate, die mit 100 % CSF proliferiert wurden, weisen eine Gewebemorphologie auf, die nach Immunfärbung Embryonen von Nagetieren desselben Gestationsalters ähnelt. pH drei.Ein Marker der Zellteilung wird entlang der ventrikulären Oberfläche exprimiert. B-R-D-U – ein Marker der DNA-Synthese – zeigt ebenfalls eine Einlagerung in der ventrikulären Zone. Und T uj 1, ein neuronalen Marker, wird in der sich entwickelnden kortikalen Platte exprimiert.Bevor Sie diese Verfahren durchführen, sollten Sie die Richtlinien Ihrer Institution bezüglich der hier demonstrierten Techniken überprüfen. Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, um die in der Zerebrospinalflüssigkeit enthaltenen sekretierten Signale zu untersuchen, die in vitro die Rolle der Großhirnrinde während der Entwicklung steuern.

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