Name: Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in Drosophila Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Lernen Sie die Bewertung neurodegenerativer Phänotypen in dopaminergen Neuronen von Drosophila durch Kletterassays und Immunfärbung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung altersabhängiger Neuronendegeneration.

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Wir danken Leo Pallanck für Fliegenfischer Aktien, Christine Sommers für technische Unterstützung und Gerasimos P. Sykiotis für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch das NIH Ausbildungsförderung T32CA009363 zu MCB finanziert

1. Startle-induzierte Negative Geotaxis Assay <ol><li> Wählen Fliegen des gewünschten Genotyps, trennen sie nach Geschlecht, nach dem Zufallsprinzip Gruppe sie in Kohorten von 20-30 Tieren und kippen sie in neue Nahrung Fläschchen alle 2-3 Tage; Test jeder Satz von Fliegen (dh Alter abgestimmte Kohorten, eine Kohorte / Genotyp) mindestens einmal pro Woche. </li><li> Dreißig Minuten vor der negativen Geotaxis Test, betäuben die Fliegen mit CO 2 und legen Sie sie in pre-markierten klar Kunststoffrohre mit zwei leeren Flaschen Nahrung (siehe Materialien Table), die an ihren Öffnungen mit durchsichtigem Klebeband (Kammer Maße: 19 cm x 2.85 cm). In unseren Tests verwenden wir meist 25 Fliegen / Rohr. Hinweis. Die Erholungszeit aus der Narkose kann von wenigen Minuten bis zu mehreren Stunden variiert werden (z. B. O / N) und sollte für die spezifischen Genotypen getestet optimiert werden. </li><li> Markieren verschiedenen Höhen (von 1 bis 20 cm) auf ein Stück Löschpapier und kleben Sie das Papier auf einer vertikalen surface, die senkrecht zu der Bank. </li><li> Legen Sie die Rohre vor dem Papier: die Rohre sollte alles ausgerichtet und so nah wie möglich an das Papier, um eine genaue Höhenmessung ermöglichen. </li><li> Legen Sie die Digitalkamera (siehe &quot;Sonderausstattung&quot; Table) vor der Rohre, in einem Abstand von 20-30 cm von dem Papier, auf einem Ständer (zB eine Pipettenspitze Kasten), wählen Sie die &quot;Film&quot;-Option und starten Sie Aufnahme; zu diesem Zeitpunkt sollten Sie auch einen Timer zu starten, den Überblick über die Zeit zwischen aufeinander folgenden Prüfungen zu halten. </li><li> Lassen Sie die Fliegen an der Unterseite des Rohres durch Antippen des Röhrchens für ein paar Sekunden (zB 10 sec) zu sammeln. Dieser Schritt sollte konsequent durchgeführt werden (dh dieselbe Dauer, dieselbe Kraft, demselben Betreiber) während des gesamten Experiments. </li><li> Nimm Fliegen &#39;Bewegungen mit der Digitalkamera für 10 sec. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.7 vierzehn Mal an einem-Minuten-Intervallen. </li><li> Analysieren von Daten: <ol type="a"><li> Zähle die Anzahl der Fliegen, die über dem liegen2 cm-Marke nach 10 Sekunden durch visuelle Inspektion der aufgenommenen Filme. Hinweis: In unserem Test Bedingungen der Fliegen &quot;negative Geotaxis Verhalten nicht zuletzt über den ersten 10 Sekunden nach überraschenden (dh Fliegen setzte sich in Bewegung in alle Richtungen 10 Sekunden nach überraschenden ihnen). Der Mindestabstand kletterte um Kontrolle Fliegen (dh 1 Woche alt Fliegen Ausdruck der THGal4 Fahrer, siehe Legende von Abbildung 1) in diesem Zeitfenster von 2 cm. So nutzten wir die 2 cm Marke als Referenz für die Analyse der Aktivitäten von Klettern Fliegen unterschiedlichen Alters und Genotypen 10 Sekunden nach Einleitung des Verhaltens. Diese Parameter können verlangen Anpassung, um Unterschiede im Verhalten der Fliegen getestet (zum Beispiel aufgrund von unterschiedlichen genetischen Hintergründen oder Laborbedingungen). Beachten Sie, dass in unseren Testbedingungen getestet alle Genotypen schlechter oder ähnlich durchgeführt, um die Fliegen von der Steuerung Genotyp. </li><li> Der Mittelwert der Ergebnisse aus den fünfzehnStudien. </li><li> Express Durchschnitt als Prozentsatz der Gesamtzahl von Fliegen in das Rohr (=% steigender Aktivität), die Anzahl der Wiederholungen (N) wird durch die Anzahl der unabhängigen Kohorten für jeden Genotyp untersucht worden sind </li><li> Bewerten statistische Signifikanz zwischen den verschiedenen Genotypen im Laufe der Zeit. Dies kann mit einem Student-t-Test (beim Vergleich zweier Genotypen) oder einem 2-Wege ANOVA Analyse von Bonferroni post-hoc-Test (bei ​​der Durchführung multiple Vergleiche) unter Verwendung kommerzieller Software wie GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla gefolgt erreicht werden, CA, USA). </li></ol></li></ol> Hinweis Wir führen alle unsere Tests in der gleichen Zeit des Tages, bei RT und unter den gleichen Lichtverhältnissen. Keeping die Fliegen in einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus Umfeld ist es ratsam, für die Wirkung der zirkadianen Rhythmen auf der Fliegen Bewegungsapparates Verhalten zu kontrollieren. 2. Tyrosin Hydroxylase ImmunfluoreszenzAssay von Whole-Brain-Mounts Lösungen und Puffer Fixierlösung: 4% Paraformaldehyd (PFA) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) Waschpuffer: 0,1% Triton X-100 in PBS Blocking-Puffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 und 0,5% BSA Montage Medien: Mowiol-Dabco (siehe Protokoll in Harlow E, D. Lane, Antikörper-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988) beschrieben) Vorgehensweise <ol><li> Setzen Sie fliegt in einer Dissektion Gericht mit 70% EtOH für ca. 1 min, um die Nagelhaut entfernen Wachs gefüllt. </li><li> Übertragen fliegt zu einem anderen Dissektion Gericht mit eiskaltem PBS gefüllt. </li><li> Präparieren Sie das Gehirn: <ol type="a"><li> Legen Sie die Fliege mit der Bauchseite nach oben (optional: remove Flügel und Beine). </li><li> Ziehen Sie den Kopf vom Körper weg: Verwenden Sie eine Zange, umhalten, um den Körper und eine andere zu halten, um die Nagelhaut unter dem Auge, um zu verhindern das Gehirn schädigen </li><li> Entfernen Sie die Rüssel. </li><li> Halten Sie den Kopf Kutikula auf gegenüberliegenden Seiten des Schlitzes offen gelassen nach dem Entfernen der Rüssel und ziehen in entgegengesetzte Richtungen, bis das Gehirn aus dem Kopf Kapsel entfernt wird. </li><li> Entfernen Sie alle Häutchen aus dem Gehirn. </li><li> Entfernen Sie alle luftgefüllten Luftröhrengewebe, dies wird das Gehirn vor schwimmt während der folgenden Inkubationsschritten verhindern. </li></ol></li><li> Schneiden einige Millimeter von der Spitze eines P-200 Pipettenspitze und äquilibriert mit 0,1% Triton-Lösung X-100/PBS </li><li> Verwendung der hergestellten P-200 Pipettenspitze, übertragen die Gehirne einem 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml 4% PFA / PBS gefüllt und auf Eis halten, bis die Präparation beendet. </li><li> Fix die Gehirne bei RT für 20 min: eine milde Drehung, indem Sie die Eppendorf-Röhrchen auf einem Gestell und Platzierung des Racks auf einer Kolbenpendel. </li><li> Entfernen Sie das FixativVerwendung eines P-1000 micro Pipette 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, durch Umdrehen mischen und für 1 min inkubieren geschweige; wiederholen Sie diesen Schritt einmal waschen. </li><li> Entfernen Sie den Puffer aus dem zweiten Waschen, 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS und lassen Inkubation bei RT für 20 min; wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. </li><li> Entfernen des Waschpuffers und lassen die Gehirne in Blocking-Puffer inkubiert (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 und 0,5% BSA) für 1 Stunde bei RT. </li><li> Inkubieren Sie die Gehirne mit einer 1:100 Verdünnung von Anti-TH-Antikörper (siehe &quot;Tabelle der spezifische Reagenzien&quot;) in Blocking-Lösung für zwei Tage bei 4 ° C, mit sanften Drehung (siehe Schritt 2.6.). </li><li> Wiederholen Waschschritte 2.7. und 2.8 .. </li><li> Equilibrieren die Gehirne mit einer 1:200 Verdünnung des sekundären Antikörper in Blocking-Lösung, für zwei Tage bei 4 ° C, mit sanften Drehung. </li><li> Wiederholen Waschschritte 2.7. und 2.8 .. </li><li> Bereiten Sie die Montage Objektträger wie in 2A dargestellt: <ol type="a"><li> Add 2 X 25 ul Tropfen Montage-Medien mit einem Deckglas (24 x 60 mm, nein. 1.5). </li><li> Platz zwei Deckgläsern (Größe 18 x 18 mm, nein. 2) an den Montage-Medien eine Lücke in der Mitte des Schlittens und trocknen lassen. </li></ol> Hinweis. Überprüfen Sie den Probenhalter auf der Bühne des konfokalen Mikroskops. Sie können das Deckglas die gleiche Größe von 25 x 75 mm Folie durch die Anbringung eines 22 x 22 mm 1,5 Deckglas auf einem der Enden (verwenden Nagellack und Band). </li><li> Entfernen Sie den Waschpuffer, fügen 50 ul Montage Medien und damit die Gehirne, um mit ihm durch Auf-und Abpipettieren Gleichgewicht. </li><li> Die Verwendung eines P-200 Pipettenspitze (siehe Schritt 2.4) übertragen die Gehirne mit dem Schlitten in den Raum zwischen den beiden Deckgläser und decken Sie sie mit einem Deckglas Nr. 1.5 (siehe Abbildung 2A; zu orientieren die Gehirne auf der Folie zu sehen 7). Hinweis: Die Proben werden zwischen zwei Deckgläsern montiert, um die Visualisierung sowohl der Front-und der poste erlaubenrior Seite des Gehirns. </li><li> Füllen Sie den gesamten Raum zwischen den Deckgläsern mit Montageplatte Medien; Pipette von einer Ecke in die Luft zu entfernen, trocknen lassen und Dichtung mit Nagellack. </li><li> Um die Anzahl von dopaminergen Neuronen in einem bestimmten Cluster beurteilen erwerben eine Reihe von optischen Abschnitten entlang der z-Achse mit einem 1,0 um Schrittweite mit einem konfokalen Mikroskop (für den anatomischen Identifizierung dopaminerger Cluster in der Drosophila erwachsenen Gehirn siehe 7). </li></ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
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<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

Wir erklären, dass wir keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die hier beschriebenen Assays stellen einen nützlichen Ansatz, um die Rolle von spezifischen Genen zu untersuchen, Signalwege oder kleinen Verbindungen bei der Aufrechterhaltung der DA Neuronen in Alterung sowie bei verschiedenen Krankheiten verbunden genetischen Hintergründen (Übersicht in 5). Die startle induzierten negativen Geotaxis Verhalten von Drosophila wurde ausgiebig als funktionelle Auslesen für die Funktionalität des DA Neuronen in unterschiedlichen genetische...

Die Besonderheit des hier beschriebenen Assays beruht auf der Verwendung eines Gal4 Fliege Linie, die die regulatorischen Sequenzen der Tyrosin-Hydroxylase-Gen Expression in dopaminergen Neuronen 3 erreichen ausnutzt. Tyrosinhydroxylase katalysiert den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in Dopamin-Synthese. TH-Immunreaktivität in der erwachsenen Fliege Gehirn Überschneidungen mit der Dopamin, was TH ein guter Kandidat, um DA Neuronen in vivo (siehe zum Beispiel 6) zu identifizieren. Darüber hinaus ist die Expression von THGal4 präziser als andere Gal4 Linien wie DdcGal4, die regulatorischen Sequenzen enthält der Dopa-Decarboxylase-Gen und treibt transgene Expression nicht nur in DA Neuronen, sondern auch in serotonergen Neuronen und Gliazellen Teilmengen von 3 . Feany und Bender (2000) zum ersten Mal beobachtet, dass pan-neuronale Expression der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen den fortschreitenden Verlust von sta beschleunigtrtle-induzierten negativen Geotaxis Verhalten in Drosophila. Wir haben ähnliche Ergebnisse mit dem DA-Neuron-spezifische THGal4 Linie, um die Expression von α-Synuclein eine transgene 10 fahren beobachtet und verwendet diese funktionelle ausgelesen, um die neuroprotektive Rolle des Nrf2-Signalweg in dieser Studie Drosophila-Modell der PD 14. Die spezifischen Assay hier beschriebenen 2 und 3 angepasst. Die Drosophila Gehirn enthält mehr als 100 DA Neuronen, in mindestens 5 verschiedenen Clustern angeordnet (pPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), die visualisiert werden in ganze Gehirn Halterungen durch konfokale Mikroskopie können (siehe zum Beispiel 11 und 7). Es ist noch umstritten, ob die Anzahl der DA Neurone im Gehirn Drosophila mit dem Alter abnimmt 9, 11, jedoch altersabhängige Neurodegeneration bei Fliegen beobachtet wird, wo PD-chromosomale Gene mutiert worden / überexprimiert um menschliche Krankheiten zu modellieren5. Die Expression von humanen α-Synuclein in DA Neuronen hat eine solche Wirkung und damit als Modell für PD verwendet worden. Hier beschreiben wir einen Test für DA Neurone im gesamten Gehirns zählen Aktivierungen mit TH als Zell-Marker. Dieser Test wurde von 13 und 10 angepasst.

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstung</td></tr><tr><td>Polystyrol-Fläschchen</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28,5 x 95 mm</td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Canon</td><td>PowerShot A3100IS (Modell)</td><td>12,1 Megapixel 4X Optischer Zoom</td></tr><tr><td>Glaskuvetten Nr. 1,5</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>Größen: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Glaskuvetten Nr. 2</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>Größe: 18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Dissektionsschalen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-01</td><td>Größe: 30 mm O.D.</td></tr><tr><td>Dumostar Nr. 5 Pinzetten</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000 (Modell)</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td>SP2 oder SP5 (Modell)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materialtabelle.</td></tr></tbody></table>

beurteilung neurodegenerative phänotypen in<em&gt; drosophila</em&gt; dopaminergen neuronen durch klettern assays und whole brain immunostaining

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster ist ein wertvoller Modellorganismus zur Alterung und pathologischen degenerativen Prozessen im Nervensystem zu studieren. Die Vorteile der Fliege als experimentelles System sind seine genetischen Lenkbarkeit, kurze Lebensdauer und die Möglichkeit zu beobachten und quantitativ zu analysieren komplexe Verhaltensweisen. Die Ausprägung der Krankheitsresistenz-chromosomale Gene in spezifische neuronale Populationen der Drosophila Gehirn, können verwendet werden, um neurodegenerative Erkrankungen wie der Parkinson-und Alzheimer-5 zu modellieren. Dopaminergen (DA) Neurone gehören zu den am stärksten gefährdeten neuronale Populationen in der alternden menschlichen Gehirns. Bei der Parkinson-Krankheit (PD), die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung, führt der beschleunigte Verlust von DA Neuronen zu einer fortschreitenden und irreversiblen Rückgang der Funktion der Bewegungsorgane. Neben Alter und der Belastung durch Umweltgifte, ist der Verlust der DA Neuronen durch spezifische Mutationen in der kodierenden verschärftoder Promotor-Regionen von mehreren Genen. Die Identifizierung solcher PD-assoziierten Allele liefert die experimentelle Grundlage für die Verwendung von Drosophila als Modell zur Neurodegeneration DA Neuronen in vivo zu studieren. Zum Beispiel, der Ausdruck der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen in Drosophila DA Neuronen rekapituliert einige Merkmale der menschlichen Erkrankung, z. B. progressive Verlust von DA Neuronen und sinkende Bewegungsapparates Funktion 2. Dementsprechend ist dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um potentielle therapeutische Targets in PD 8 zu identifizieren. Hier beschreiben wir zwei Assays, die üblicherweise verwendet wurden, um altersabhängige Neurodegeneration DA Neuronen in Drosophila untersuchen: a Klettern Assay basiert auf der startle induzierten negativen Geotaxis Reaktion und Tyrosin Hydroxylase Immunfärbung der gesamten erwachsenen Gehirn montiert, um die Anzahl von Neuronen überwacht DA in verschiedenen Altersstufen. In beiden Fällen, in vivo-Expression von UAS transgenes speziell in DA Neuronen durch einen Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Promotor-Gal4 Treiberleitung 3, 10 erreicht werden.

Wir haben die verwendeten Assays beschrieben hier die Rolle der Beanspruchung schützende Nrf2-Signalweg in Drosophila Modell der PD 14 zu studieren. Dieses Modell beruht auf der Expression des humanen α-Synuclein-Gen in DA Neuronen mit einem TH Gal4 Treiber 2, 10. Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer Schreckreaktion-induzierten negativen Geotaxis (Klettern)-Assay in männlichen Fliegen, die verschiedene Transgene unter der Kontro...

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt;: Das Klettern / startle-induzierten negativen Geotaxis Assay, um die funktionalen Auswirkungen der DA Neurone Degeneration und der Tyrosinhydroxylase Immunfärbung, die zur Identifizierung und zählen DA Neuronen im gesamten Gehirns Halterungen wird studieren können.

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Beurteilung der Neurodegeneration dopaminerger Neuronen in transgenen Drosophila. Dies wird erreicht, indem zunächst die gewünschten Transgene unter der Kontrolle des Tyrosinhydroxylase-Promotors über das GAL-Vier-UAS-System exprimiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Fliegen des gewünschten Genotyps zu sammeln, sie nach Geschlecht zu trennen und zu altern.Der dritte Schritt besteht darin, die Kletteraktivität der Fliegen durch negative Geo-Achse im Laufe des Alterns zu testen. Der letzte Schritt ist das Zählen der Anzahl der dopaminergen Neuronen aus sezierten Gehirnen, die in verschiedenen Altersstufen gesammelt wurden. Letztendlich werden die Ergebnisse Veränderungen im Lokomotorverhalten des Tieres und in der Größe ihrer Population dopaminerger Neuronen zeigen.Die Auswirkungen dieses Ansatzes erstrecken sich auf die Therapie neuro degenerativer Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit. Dieser Ansatz kann dazu beitragen, neuroprotektive Gene und pharmakologische Interventionen zu identifizieren. Um den Test einzurichten, wählen Sie altersgleiche Fliegen der gewünschten Genotypen. Trennen Sie sie nach Geschlecht und gruppieren Sie sie zufällig in Gruppen von 20 bis 30 Tieren.Jede Kohorte repräsentiert eine statistische Stichprobe. Halten Sie die Kohorten an einem 12-Stunden-Tag-Nacht-Zyklus, um die Auswirkungen zirkadianer Rhythmen auf das Lokomotorverhalten zu kontrollieren, und bei einer Temperatur, die im Testraum repliziert werden kann. Wechseln Sie die Gefäße der Kohorten alle zwei bis drei Tage und testen Sie sie wöchentlich zu einer festgelegten Zeit.30 Minuten vor dem Test betäuben Sie jede Kohorte mit Kohlendioxid und bringen Sie sie in ein beschriftetes Plastikröhrchen aus leeren Futtergefäßen, die mit Klebeband verbunden sind. Die Fliegen sollten nach fünf bis zehn Minuten wieder wach sein, aber die vollständige Erholung von der Narkose variiert je nach Alter und Genotyp und muss optimiert werden. Jetzt. Erstellen Sie eine Höhenskala, um hinter den Testgefäßen zu sehen.Markieren Sie Abstände zwischen ein und 20 Zentimeter auf einem Stück weißes Papier. Befestigen Sie dann die Skala an der Position. Richten Sie nun die zu testenden Röhrchen an der Skala etwa 20 bis 30 Zentimeter entfernt aus.Positionieren Sie eine Digitalkamera mit einer quadratischen Ansicht der Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass die Etiketten auf den Röhrchen und der Skala deutlich zu sehen sind. Sobald die Position festgelegt ist, starten Sie die Aufnahme und starten Sie einen digitalen Timer.Tippen Sie nun für einige Sekunden auf ein Röhrchen. Alle Fliegen sollten den Boden des Röhrchens erreichen. Stellen Sie sicher, dass Sie diesen Schritt während des gesamten Experiments mit gleicher Dauer und gleicher Kraft durchführen.Wiederholen Sie nach einer Minute den Knockdown erneut für den zweiten von 15 aufeinanderfolgenden Versuchen. Wenn alle 15 Versuche abgeschlossen sind, bringen Sie die Fliegen durch visuelle Inspektion der Filme in frische Röhrchen zurück. Zählen Sie für jeden der 15 pro Kohorte durchgeführten Versuche die Anzahl der Fliegen über der Zwei-Zentimeter-Marke.Nach 10 Sekunden wird die Zwei-Zentimeter-Marke empirisch bestimmt, es ist die Entfernung, die alle Kontrollen nach 10 Sekunden bei vielen der getesteten Altersstufen überqueren. Ermitteln Sie den Durchschnittswert aus den 15 Versuchen und drücken Sie ihn als Prozentsatz der Kohortenmitglieder aus, die die Marke überquert haben. Die Anzahl der statistischen Wiederholungen entspricht der Anzahl der getesteten Kohorten für jede Gruppe, nicht den 15 Versuchen.Beurteilen Sie die statistische Signifikanz zwischen verschiedenen Genotypen mit einem Student's T-Test, Anova oder anderen geeigneten Analysemethoden. Setzen Sie die Fliegen für etwa eine Minute in eine Dissektionsschale mit 70% Ethanol, um das Cutikelwachs zu entfernen.Übertragen Sie dann die Fliegen in eine weitere Dissektionsschale, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist, und gehen Sie zum Dissezieren des Gehirns über. Positionieren Sie die Fliege mit der Bauchseite nach oben und entfernen Sie optional die Flügel und Beine. Halten Sie mit einem Satz Pinzetten den Körper fest und mit einem anderen Satz Pinzetten die Cuticula unter dem Auge.Ziehen Sie dann den Kopf vom Körper weg. Entfernen Sie als Nächstes die Rüssel, indem Sie ihn vom Kopf abziehen. Ergreifen Sie dann die Kopfcuticula an gegenüberliegenden Rändern des neuen Lochs und ziehen Sie in entgegengesetzte Richtungen, bis das Gehirn aus der Kopfkapsel entfernt ist.Entfernen Sie nun vorsichtig die verbleibende Cuticula von der Hirnoberfläche. Entfernen Sie dann alle luftgefüllten Tracheengewebe. Dies verhindert, dass das Gehirn während der folgenden Inkubationsschritte schwimmt.Bereiten Sie eine Hirnhandhabungspipette aus einer P 200 Pipettenspitze vor. Schneiden Sie einige Millimeter ab und gleichen Sie sie mit 0,1% Triton X 100 in PBS aus. Übertragen Sie die Gehirne in ein halb milliliter Röhrchen, das vollständig mit 4% PFA in PBS gefüllt ist.Fixieren Sie die Gehirne bei Raumtemperatur für 20 Minuten mit sanfter Rotation. Verwenden Sie nach 20 Minuten eine P 1000 Pipette, um das Fixiermittel durch ein halbes Milliliter Waschpuffer zu ersetzen, der 0,1% Triton X 100 in PBS ist. Mischen Sie durch Inversion und lassen Sie die Gehirne eine Minute lang inkubieren, bevor Sie den Waschpuffer ersetzen.Ersetzen Sie nach einer Minute den Waschpuffer ein zweites Mal und inkubieren Sie die Gehirne für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie dann den Waschpuffer zum dritten Mal und inkubieren Sie die Gehirne weitere 20 Minuten. Entfernen Sie nun den Waschpuffer und lassen Sie die Gehirne für eine Stunde bei Raumtemperatur in einem halben Millimeter Blockierungspuffer inkubieren.Fügen Sie nach einer Stunde eine eins zu 100 Verdünnung des Antikörpers in Blockierungslösung hinzu. Lassen Sie es zwei Tage bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation inkubieren. Um den Block zu entfernen, wiederholen Sie die Waschgänge, die zum Entfernen der Fixierung verwendet wurden.Gleichen Sie dann die Gehirne mit einem halben Milliliter einer eins zu 200 Verdünnung des Sekundärantikörpers in Blockierungslösung für zwei Tage bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation aus. Entfernen Sie einige Tage später den Sekundärantikörper mit dem gleichen Waschverfahren. Um die Montageträger vorzubereiten, fügen Sie 2 25 Mikroliter Tropfen Montagemedium auf ein Deckglas hinzu.Legen Sie zwei Deckgläser auf das Montagemedium mit einem Abstand in der Mitte. Lassen Sie die Träger trocknen. Wenn die Breite des Montageträgers nicht zur Bühne des Konfokalmikroskops passt, verwenden Sie Nagellack, um einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckglas zu befestigen, so dass er richtig passt.Ersetzen Sie nun die Lösung, in der sich die Gehirne befinden, durch 50 Mikroliter Montagemedium. Gleichen Sie die Gehirne mit dem Montagemedium durch Pipettieren mit einer geschnittenen P 200 Spitze aus. Verwenden Sie als Nächstes eine geschnittene P 200 Spitze, um die Gehirne in den Graben zu übertragen.Orientieren Sie die Gehirne auf dem Montageträger, um ihre anteriore oder posteriore Seite zu betrachten. Decken Sie sie dann mit einer Nummer 1,5 Deckglas ab und füllen Sie von einer Ecke aus den Raum zwischen den Deckgläsern mit Montagemedium, um die gesamte Luft zu entfernen. Lassen Sie die Träger trocknen und versiegeln Sie sie dann mit Nagellack, bevor Sie sie untersuchen.Humanes Alpha-Synuclein wurde in DA-Neuronen unter Verwendung des TH GAL vier Treibers im Klettertest exprimiert. Männchen, die dieses Transgen exprimieren, zeigten einen beschleunigten Rückgang im Vergleich zu altersgleichen Kontrollen und Fliegen, die das NRF 2D NA-Bindungspartner coexprimierten. Math S-Weibchen zeigten ähnliche Ergebnisse beim Vergleich von vier Wochen alten Männchen verschiedener Genotypen.Die auf der Immunfluoreszenz basierenden DA-Neuron-Zählungen wurden verwendet, um die Anzahl der PPL-Eins-Neuronen zu quantifizieren. Ein kleiner, aber signifikanter Verlust von PPL

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Behavior-Assays zur Messung der lokomotorischen Funktionen, Lern-und Gedächtnisleistung...

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Dieses Video beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung der Fortbewegung von Fliegen und zeigt den durchgeführten Kletter-Assay. Der Fly-Climbing-Assay ist ein allgemeiner Test der motorischen Funktion, der auf einer negativen Geotaxis-Reaktion beruht.

Fly Climbing Assay: Eine Methode zum Testen der allgemeinen Fortbewegung bei Drosophila melanogaster

Wir präsentieren einen optimierten, kostengünstigen und zuverlässigen negativen Geotaxis-Assay in Drosophila melanogaster als Modell für neurodegenerative Erkrankungen. Da dieser Assay empfindlicher auf leichte Defekte des Bewegungsapparates reagiert, hilft er bei der Suche nach potenziellen genetischen Wechselwirkungen und Wirkstoffzielen.

Quantitative Analyse der Kletter Defekte in einem Drosophila Modell von neurodegenerativen Erkrankungen

Drosophila ist weithin als ein Modellsystem verwendet , Neurodegeneration zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, mit dem Degeneration, wie durch Vakuolenbildung im Gehirn bestimmt wird, kann quantifiziert werden. Es minimiert auch die Auswirkungen aufgrund der Versuchsdurchführung durch die Verarbeitung und sectioning Kontroll- und Versuchs Fliegen wie eine Probe.

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Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Dieses schrittweise Protokoll analysiert Drosophila negative Geotaxis Verhalten mit einem automatisierten Multi-Zylinder-System, das beherbergt hunderte von fliegen und synchronisiert ihre Aktion durch einen Elektromotor. Bei der Synchronisation ist fliegen negative Geotaxis Verhalten untersucht, digital erfasst und analysiert mit Hilfe der selbst entworfenen RflyDetection-Software.

Eine automatisierte rasche Iterative Negative Geotaxis Assay für die Analyse von Erwachsenen Klettern Verhalten in einem Drosophila -Modell der Neurodegeneration

Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.

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Diese Studie stellt ein vereinfachtes Protokoll für die Gewebeaufbereitung vor, das Enthauptung, Fixierung, Kryosektion, Fluoreszenzfärbung, Immunfärbung und Bildgebung umfasst und auf konfokale und Multiphotonen-Bildgebung erweitert werden kann. Die Methode behält eine Wirksamkeit bei, die mit komplexen Dissektionen vergleichbar ist, ohne dass fortgeschrittene motorische Fähigkeiten erforderlich sind. Die quantitative Bildanalyse bietet ein umfangreiches Untersuchungspotenzial.

Direkte Kryosektion von Drosophila-Köpfen zur verbesserten Fluoreszenzfärbung und Immunfärbung des Gehirns

Das Protokoll stellt eine kostengünstige Methode mit hohem Durchsatz zur Beurteilung der Neurotoxizität in der Fruchtfliege durch die Quantifizierung der Bewegungsstörung als Alternative zu herkömmlichen Säugetiermodellen dar. Ziel ist es, die neurotoxischen Wirkungen von pharmazeutischen Wirkstoffen, Umwelteinflüssen oder genetischen Veränderungen anhand eines sensitiven, reproduzierbaren und ethisch günstigen Modells zu bewerten.

Verhaltensanalyse der lokomotorischen Dysfunktion bei Drosophila melanogaster als Aussage für Neurotoxizität

Lernen Sie die Bewertung neurodegenerativer Phänotypen in dopaminergen Neuronen von Drosophila durch Kletterassays und Immunfärbung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung altersabhängiger Neuronendegeneration.

Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in Drosophila Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining (Video) | JoVE Journal

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