Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in Drosophila Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Neurodegeneration von dopaminergen Neuronen in transgenen Drosophila zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem zunächst die gewünschten Transgene unter der Kontrolle des Tyrosinhydroxylase-Promotors über das GAL-Vier-UAS-System exprimiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, Fliegen des gewünschten Genotyps zu sammeln, sie nach Geschlecht zu trennen und zu altern.

Der dritte Schritt besteht darin, die Steigaktivität von Fliegen mit zunehmendem Alter durch eine negative Geoachse zu testen. Der letzte Schritt besteht darin, die Anzahl der dopaminergen Neuronen aus präparierten Gehirnen zu zählen, die in verschiedenen Altersstufen gesammelt wurden. Letztendlich werden die Ergebnisse Veränderungen im Bewegungsverhalten der Tiere und in der Größe ihrer dopaminergen Neuronenpopulation zeigen.

Die Implikationen dieses Ansatzes erstrecken sich auf die Therapie neurodegenerativer Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit. Dieser Ansatz kann helfen, neuroprotektive Gene und pharmakologische Interventionen zu identifizieren. Um den Assay einzurichten, wählen Sie altersangepasste Fliegen der gewünschten Genotypen aus. Trennen Sie sie nach Geschlecht und gruppieren Sie sie nach dem Zufallsprinzip in Kohorten von 20 bis 30 Tieren.

Jede Kohorte stellt eine statistische Stichprobe dar. Halten Sie die Kohorten auf einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus, um die Auswirkungen des zirkadianen Rhythmus auf das Bewegungsverhalten zu kontrollieren, und auf einer Temperatur, die im Testraum repliziert werden kann. Wechseln Sie die Fläschchen der Kohorte alle zwei bis drei Tage und testen Sie sie wöchentlich zu einem einheitlichen Zeitpunkt.

30 Minuten vor dem Test betäuben Sie jede Kohorte mit Kohlendioxid und geben Sie sie in ein beschriftetes Plastikröhrchen aus leeren Lebensmittelfläschchen, die mit Klebeband verbunden sind. Die Fliegen sollten nach fünf bis 10 Minuten wach sein, aber die vollständige Genesung von der Narkose variiert mit dem Alter und dem Genotyp und muss optimiert werden. Jetzt. Erstellen Sie eine Höhenskala, die hinter die Testfläschchen blickt.

Markieren Sie Abstände zwischen einem und 20 Zentimetern auf einem weißen Blatt Papier. Befestigen Sie dann die Waage in Position. Richten Sie nun die zu testenden Röhrchen in etwa 20 bis 30 Zentimetern Entfernung gegen die Skala aus.

Positionieren Sie eine Digitalkamera mit einer quadratischen Ansicht der Fläschchen. Achten Sie darauf, dass die Etiketten auf den Röhrchen und der Waage gut sichtbar sind. Sobald Sie positioniert sind, starten Sie die Aufnahme und starten Sie einen digitalen Timer.

Tippen Sie nun einige Sekunden lang auf eine Röhre. Alle Fliegen sollten den Boden der Röhre sammeln. Stellen Sie sicher, dass Sie diesen Schritt während des gesamten Experiments konsistent mit der gleichen Dauer und der gleichen Kraft ausführen.

Wiederholen Sie den Niederschlag nach einer Minute erneut für den zweiten von 15 aufeinanderfolgenden Versuchen. Wenn alle 15 Versuche abgeschlossen sind, lege die Fliegen wieder in frische Fläschchen, indem du die Filme visuell inspizierst. Zählen Sie für jeden der 15 Versuche, die pro Kohorte durchgeführt werden, die Anzahl der Fliegen über der Zwei-Zentimeter-Marke.

Nach Ablauf von 10 Sekunden wird empirisch die Zwei-Zentimeter-Marke bestimmt, es ist die Distanz, die alle Kontrollen nach 10 Sekunden bei vielen der getesteten Altersgruppen zurücklegen. Nehmen Sie die durchschnittliche Punktzahl aus den 15 Versuchen und drücken Sie sie als Prozentsatz der Kohortenmitglieder aus, die die Marke überschritten haben. Die Anzahl der statistischen Wiederholungen entspricht der Anzahl der Kohorten, die für jede Gruppe getestet wurden, nicht für die 15 Studien.

Beurteilen Sie die statistische Signifikanz zwischen verschiedenen Genotypen mit dem T-Test eines Schülers, einer Anova oder anderen geeigneten Analysemethoden. Legen Sie die Fliegen für etwa eine Minute in eine Sezierschale mit 70%igem Ethanol. Um das Nagelhautwachs zu entfernen.

Bringen Sie dann die Fliegen in eine andere Sezierschale, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist, und fahren Sie mit dem Präparieren des Gehirns fort. Positionieren Sie die Fliege mit der Bauchseite nach oben und entfernen Sie optional die Flügel und Beine. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Körper festzuhalten, und eine andere, um die Nagelhaut unter dem Auge festzuhalten.

Ziehe dann den Kopf vom Körper weg. Entfernen Sie als Nächstes den Rüssel, indem Sie ihn vom Kopf abziehen. Fassen Sie dann die Nagelhaut des Kopfes an den gegenüberliegenden Kanten des neuen Lochs und ziehen Sie in entgegengesetzte Richtungen, bis das Gehirn aus der Kopfkapsel entfernt wird.

Entfernen Sie nun vorsichtig die verbleibende Nagelhaut von der Gehirnoberfläche. Entfernen Sie dann das gesamte luftgefüllte Luftröhrengewebe. Dadurch wird verhindert, dass das Gehirn während der folgenden Inkubationsschritte schwebt.

Bereiten Sie eine Pipette für die Handhabung des Gehirns aus einer Pipettenspitze P 200 vor. Schneiden Sie ein paar Millimeter ab und äquilibrieren Sie es mit 0,1 % Triton X 100 in PBS. Übertragen Sie das Gehirn in ein halbes Milliliter-Röhrchen, das vollständig mit 4% PFA in PBS gefüllt ist.

Fixieren Sie das Gehirn 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit sanfter Drehung. Verwenden Sie nach 20 Minuten eine P 1000-Pipette, um das Fixiermittel durch einen halben Milliliter Waschpuffer zu ersetzen, der 0,1 % Triton X 100 in PBS entspricht. Mischen Sie durch Inversion und lassen Sie das Gehirn eine Minute lang inkubieren, bevor Sie den Waschpuffer austauschen.

Tauschen Sie nach einer Minute den Waschpuffer ein zweites Mal aus und inkubieren Sie das Gehirn 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Tauschen Sie dann den Waschpuffer ein drittes Mal aus und inkubieren Sie das Gehirn für weitere 20 Minuten. Entfernen Sie nun den Waschpuffer und lassen Sie das Gehirn eine Stunde lang bei Raumtemperatur in einem halben Millimeter Blockpuffer inkubieren.

Nach einer Stunde eine Verdünnung von 1 bis 100 Antit-Antikörpern in Blockierungslösung hinzufügen. Lassen Sie es zwei Tage lang bei vier Grad Celsius in sanfter Rotation inkubieren. Um den Block zu entfernen, wiederholen Sie die Waschgänge, mit denen Sie den Fixierer entfernt haben.

Dann äquilibrieren Sie das Gehirn mit einem halben Milliliter einer Verdünnung von einer bis 200er Verdünnung des Sekundärantikörpers in einer Blockierungslösung für zwei Tage bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation. Einige Tage später entfernen Sie den Sekundärantikörper mit dem gleichen Waschverfahren. Zur Vorbereitung der Montagefolien geben Sie 2 25 Mikroliter Eindeckmedium auf ein Deckglas.

Platzieren Sie zwei Abdeckgläser mit einem Spalt in der Mitte auf dem Eindeckmedium. Lassen Sie die Objektträger trocknen. Wenn die Breite des Objektträgers nicht zum Tisch des konfokalen Mikroskops passt, befestigen Sie mit Nagellack einen 22 x 22 Millimeter großen Deckglas an dem Objektträger, damit er richtig sitzt.

Ersetzen Sie nun die Lösung, in der sich das Gehirn befindet, durch 50 Mikroliter Eindeckmedien. Äquilibrieren Sie das Gehirn mit dem Einbettmedium, indem Sie mit einer abgeschnittenen P 200-Spitze pipettieren. Als nächstes verwenden Sie eine abgeschnittene P 200-Spitze, um das Gehirn in den Graben zu übertragen.

Richten Sie das Gehirn in der Montagefolie so aus, dass es die vordere oder hintere Seite sieht. Decken Sie sie dann mit einem Deckglas Nummer 1,5 ab und füllen Sie den Raum zwischen den Abdeckgläsern von einer Ecke aus mit Eindeckmedien, um die gesamte Luft zu entfernen. Lassen Sie die Objektträger trocknen und versiegeln Sie sie dann vor der Untersuchung mit Nagellack.

Humanes Alpha-Synuclein wurde in DA-Neuronen unter Verwendung des TH GAL four-Treibers im Kletterassay exprimiert. Männchen, die dieses Transgen exprimierten, zeigten einen beschleunigten Rückgang im Vergleich zu altersangepassten Kontrollen und als Coex, das den NRF 2D NA-Bindungspartner exprimierte. Math S-Weibchen zeigten ähnliche Ergebnisse beim Vergleich von vier Wochen alten männlichen Fliegen verschiedener Genotypen.

Th-Immunfluoreszenz-basierte DA-Neuronenzahlen wurden verwendet, um die Anzahl der PPL-One-Neuronen zu quantifizieren. Ein kleiner, aber signifikanter Verlust von PPL-1-Neuronen wurde bei Fliegen gefunden, die Alpha-Synuclein exprimieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Neurodegeneration der Varg-Neuronen in transgenen Zoa durch CLA-Assays und Tyrosin-AASE-Immunfluoreszenz beurteilt werden kann.

Danke fürs Zuschauen.